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增强植物对感染的抵抗力的方法
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技术领域
本发明涉及能增强植物对感染，包括病原体和创伤所致感染的抵抗力的蛋白质。本发明还涉及通过表达编码这些蛋白质的基因来增强植物对感染抵抗力的方法。
背景技术
预先形成的和诱导的防御机理为植物宿主对遇到的许多病原体提供广谱抵抗力。病原体特异性的防御反应通常由宿主的相应抗性(R)蛋白识别病原体无毒力(Avr)蛋白来启动。最后，植物宿主会产生一系列防御分子(包括发病机理相关蛋白质)来限制或杀伤病原体。抵抗力启动和抗性蛋白质产生之间的过程涉及尚未完全阐明的复杂信号转导网络。
通过分子遗传学方法鉴定已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定了防御信号转导网络的许多重要节点(hub)，包括EDS1(增强疾病易感蛋白1(Enhanced Disease Susceptibility 1))、NPR1(PR基因的非表达体1(Non-Expresser of PR Genes 1))和NDR1(非物种特异性疾病抵抗力蛋白1(Non Race-Specific Disease Resistance 1))。采用相似的策略以及生物化学研究，确认了拟南芥中植物激素信号参与防御反应，特别是水杨酸(SA)，以及其它植物激素，例如茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的作用。
植物防御反应中采用许多已知的信号传导策略。例如，一些R蛋白是受体激酶，而其它蛋白激酶也起重要作用。生物化学信号，例如钙流(calcium flux)和氧化爆发也是重要的。此外，有几篇报道称其它信号传导组分，例如G-蛋白和RING(真正感兴趣的新基因(
eally
Interesting
New
Gene))锌指蛋白参与其中。
RING锌指蛋白是具有高度保守性锌结合区的一组多样性蛋白。根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基组合的类型，RING锌指蛋白区可分成标准的和修饰的RING锌指。标准的RING锌指可以再分成两个亚类：HC亚类(共有：C-X2-C-X9-39-C-X1-3-H-X2-3-C-X2-C-X4-48-C-X2-C)(SEQ ID NO：1)和H2亚类(共有：C-X2-C-X9-39-C-X1-3-H-X2-3-H-X2-C-X4-48-C-X2-C)(SEQ ID NO：2)(Stone，S.L.等，Plant Physiology(2005)137：13-30)。修饰的RING锌指包括RING-C2、RING-v、RING-D、RING-S/T和RING-G。
RING锌指蛋白家族(包括HC和H2亚类)的许多成员是E3泛素连接酶。不同亚类的RING锌指区决定了针对不同E2泛素偶联酶的特异性。其它RING锌指蛋白可结合核酸或与其它蛋白质靶标相互作用。除了泛素介导的降解途径外，RING锌指蛋白还在细胞器运输和转录/翻译调节中起着重要作用。
在水稻中，鉴定了超过30种针对水稻黄单孢菌水稻致病变种(Xanthomonas oryza pv.oryza)(Xoo)的抗性基因座(Xa基因座)，主要通过绘图克隆方法(map-based cloning approache)克隆了6种Xa基因。据报道，几种发病机理-相关(PR)基因对抗性机制直接起作用。然而，从R蛋白-Avr蛋白开始相互作用到实际抵抗力产生的信号转导途径中只有少数关键组分得到研究。为获得水稻的新的Xoo抗性相关信号转导组分，研究了在水稻品系中差别表达的具有Xa基因座的cDNA克隆。
本发明人克隆并表征了水稻的新型RING锌指蛋白基因(OsRHC1)。在创伤情况下，OsRHC1在含Xa14或Xa23耐受性基因座的近等同基因品系中差别表达，但在相应的易感回归亲本中不是。OsRHC1在转基因拟南芥中的异位表达增强其对细菌病原体的抵抗力，这种保护功能取决于26S蛋白酶体的作用。
发明内容
已知植物中有各种基因编码感染抗性蛋白质，已经利用了经修饰产生这些蛋白质的各种转基因植物以图赋予针对感染的抵抗力。然而，就成功识别的病原体类型而言，这些抗性蛋白质看来活性谱有限。许多还导致不利副作用(例如，程序性细胞死亡)。本发明提供可用于赋予各种植物针对感染的抵抗力，而没有明显不利副作用的材料。本发明提供产生称为OsRHC1的蛋白质的重组材料，该蛋白质是赋予针对广谱病原体感染的抵抗力的RING锌指蛋白。由于源自单子叶植物(水稻)的本发明蛋白质在双子叶植物(拟南芥)中也有效，其也适用于各种植物。
一方面，本发明涉及产生OsRHC1蛋白及其密切相关蛋白的表达系统，所述蛋白是RING锌指蛋白并能增强植物对感染的抵抗力。用本发明表达系统修饰的转基因植物抵抗病原生物或创伤所致感染的能力增强。
因此，在另一方面，本发明涉及经修饰而含有产生该RING锌指蛋白的表达系统的植物细胞或植物。这些植物可以是OsRHC1来源的异源植物，或者可以是经修饰而过表达该蛋白质的水稻植物。
在还有另一方面，该表达系统产生的蛋白质可以用于实施筛选试验以鉴定能调节植物对感染的抵抗力的化合物或化合物组合。
本发明还涉及OsRHC1蛋白的免疫特异性抗体。这些抗体可用于检测和纯化该蛋白质。
附图简述
图1显示OsRHC1基因编码区的核苷酸序列和OsRHC1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：42-43)。
图2A显示与表现出高度相似性的7种注释蛋白质(SEQ ID NO：44-50)比对的OsRHC1的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：43)。图2B显示利用抗-OsRHC1抗体作蛋白质印迹分析的从CBB23和JG30提取的膜结合和可溶性蛋白质组分。
图3A和3B显示OsRHC1在细菌枯萎病抗性品系CBB14和CBB23(分别携带Xa14基因座和Xa23基因座)和它们的易感回归亲本(分别是SN1033和JG30)中的表达情况。
图4A通过实时PCR显示OsRHC1的创伤诱导表达。图4B显示相应蛋白质的蛋白质印迹。
图5A-C显示表达OsRHC1的转基因拟南芥的病原体接种测试。在图5A中，通过Northern印迹分析证实转基因OsRHC1在转基因拟南芥中的表达。疾病症状可见，如图5B所示；收集莲座丛(rosette)叶片(不是感染的部位)估计病原体滴度，如图5C所示。
图6A和6B显示防御标记基因在未接种(A)和接种(B)丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000(Pst DC3000)的转基因拟南芥中的表达。
图7A-D显示用MG132(26S蛋白酶体抑制剂)处理时防御标记基因(PR1(A)、PR2(B)、PDF1.2(C)和Thi2.1(D))的表达。
图8A和8B显示在npr1-3背景中OsRHC1转基因拟南芥的病原体接种测试的结果。图8A显示OsRHC1基因的表达，图8B显示4种防御标记基因的表达。
图9显示在转基因水稻品系中PCR筛选OsRHC1转基因的结果。
图10A通过实时PCR显示OsRHC1的表达，图10B显示转基因水稻品系中相应蛋白质的产生。
图11A-C显示OsRHC1转基因水稻品系中防御标记基因PR1(A)、PBZ1(B)和GRCWP(C)的表达。
图12显示对OsRHC1的RING-HC-C-末端部分进行自泛素化试验(autoubiquitination assay)的结果.
图13显示OsRHC1的结合伴侣的DNA序列(SEQ ID NO：51)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)。
实施本发明的方式
称为水稻RING-HC亚类蛋白质-1(OsRHC1)的蛋白质是在水稻中对病原体或创伤诱导的感染起反应而过表达的409个氨基酸的蛋白质。当各种植物经修饰而产生该蛋白质及其变体(统称为OsRHC1蛋白)时，这些蛋白质使得所述植物抵抗感染的不利影响，所述变体在该409氨基酸序列的全长上有至少90％、优选95％、更优选98％或99％的序列相同性。本发明提供可用于修饰各种植物(单子叶植物和双子叶植物)以增强它们抗感染的能力的表达系统。以下实施例证实了这种表达系统赋予抗性的普遍能力，这些实施例显示源自单子叶植物的该蛋白质能赋予双子叶植物拟南芥这些特性。
目前，构建在植物中可操作的表达载体、修饰植物细胞、使植物细胞再生成完整的植物和植物的重组操作等技术在总体上是众所周知的。这些技术的综述见，例如美国专利7,109,033，其有关这些技术的内容通过引用纳入本文。
如本专利所示，可用于植物表达的启动子可以是组成型、诱导型和/或组织特异性的。转化技术包括利用土壤杆菌、脂质转染、电穿孔等等。从转化的植物细胞再生植物的技术也是熟知的。
因此，一旦有编码OsRHC1蛋白的核苷酸序列可用，本领域普通技术人员即熟知制备产生这些蛋白质的转基因植物的方法。天然产生该蛋白质的核苷酸序列以登录号EF584506保藏在GenBank，并且密码子选择有差异的合成替代物是可能的。
因此，按照本发明，构建在植物中可操作的合适表达系统，其中编码本发明蛋白质的核苷酸序列与在植物中可操作的合适控制序列操作性相连。该表达系统用于修饰植物细胞或植物，从而该蛋白质可以在植物组织中普遍地或专门在植物的所需位置产生，这取决于控制系统和转化方法的选择。然后得到的植物(无论单子叶植物或双子叶植物)对病原体或创伤诱导的感染起反应而产生该蛋白质，从而增强它们抵御这些感染事件所致损伤的能力。
如下所示，OsRHC1是通过将不良蛋白质引向蛋白酶体而增强对它们的破坏作用的E3泛素连接酶。该特性与其它RING蛋白相同，代表了其保护性功能的一方面。该蛋白质是首个在N-末端区域具有跨膜结构域并且在C-末端胞质尾具有RING-HC的E3，发现其参与植物疾病抵抗力。
此外，以足量产生并分离和纯化至合适程度(以重量计，纯度至少50％、优选75％、更优选90％或95％)的该蛋白质本身可用作筛选工具。能结合该蛋白质的化合物或化合物组合是调节植物抵御感染能力的候选对象。通过结合该蛋白质而能刺激其活性的化合物或化合物组合会增强能产生该蛋白质的植物的感染-抵御能力。
因此，可采用结合试验作初步筛选。由于OsRHC1已证实是E3泛素连接酶，可采用以下实施例9所述的泛素连接酶活性试验，或该活性的类似试验来证明候选化合物的激动剂活性。因此，合适的候选化合物会增强OsRHC1实现泛素化的能力。
对所述蛋白质具有特异免疫活性的抗体也可用于纯化本发明蛋白质和检测它们。术语“抗体”应理解为表示完整的抗体(多克隆或单克隆)，其免疫特异性片段，例如Fab片段，及其重组产生的形式，例如单链Fv抗体。因此，术语“抗体”指任何形式的抗体以及保留其免疫特异性特征的任何部分。这些抗体可用在，例如纯化用的亲和柱上。
在以下实施例中，从稻回收图1所示编码OsRHC1蛋白的核苷酸序列并保藏。此外，证明了可以在对病原体起反应和对创伤起反应而表现出抗性的稻品系中在mRNA水平和蛋白质水平诱导OsRHC1表达。
利用OsRHC1蛋白的表达构建物获得转基因拟南芥植物，这些转基因植物显示在常规生长条件下和加入水杨酸或茉莉酸时，4种防御标记基因的表达均增强。OsRHC1转基因拟南芥还显示OsRHC1-编码DNA的组成型表达，当用假单胞菌(Pseudomonas)攻击时，会因这种表达而得到保护。类似地，稻中该DNA过表达导致几种防御标记基因的表达。
提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。
OsRHC1-编码cDNA的鉴定和克隆
利用从6-8周龄CBB14和SN1033提取的总RNA，通过抑制消减杂交技术，用克隆技术公司(Clontech 637401)的PCR选择cDNA消减试剂盒获得部分cDNA克隆，其中CBB14是一种细菌枯萎病抗性株(测试者)，而SN1033(驱动者)是病原体(Xoo属LN44)接种后4天收集的CBB14的易感性亲本水稻品系。通过Zhang，Q.等，Acta Agr.Sin.(1996)22：135-141所述的裁剪方法进行接种。利用该部分克隆的DNA序列信息，用特异性引物进行5’-快速-扩增cDNA末端(5’-RACE)实验和随后的PCR扩增。5’RACE反应中利用基因特异性引物5’-TTCTCCATGTTCGGTAAACCTTTC-3’(SEQ ID NO：3)、5’-TAAAGTTGTGAT TGAGACTACATGG-3’(SEQ ID NO：4)和5’-ACATTGCACAACCAACATGTAC-3’(SEQ ID NO：5)。为扩增全长编码区，利用引物对5’-CCTCACTTTTGTCTCCCAC-3’(SEQ ID NO：6)和5’-CGACATTGCACAACCAAC-3’(SEQ ID NO：7)进行PCR。所有的克隆保存在斯特拉塔基因公司(Stratagene)的质粒载体KSII(+)中，在大肠杆菌菌株DH5α中增殖。
得到的cDNA克隆(GenBank登录号EF584506)编码409个氨基酸残基的完整开放读框(图1)。EF584506与直接保藏的水稻cDNA克隆(登录号：NM_001057564)有99％相同。水稻基因组中的相应基因看来是位于染色体3上的单拷贝基因。BlastP检索显示我们的克隆编码的蛋白质与注释为锌指家族蛋白的水稻克隆(登录号：ABF98464)有99％相同性，但在N-末端少了64个氨基酸残基。利用保守结构域数据库(CDD)的其它分析显示预测的蛋白质具有RING锌指区。RING锌指区中保守性半胱氨酸和组氨酸残基的模式显示是RING-HC亚类的标志。因此，该克隆指定为OsRHC1。
将OsRHC1蛋白的预测氨基酸序列与参与疾病抵抗力的两种水稻RING锌指蛋白，EL5(RING-H2亚类)和XB3(RING-HC亚类)作比较。除在RING锌指区外，未发现明显的同源性(数据未显示)。OsRHC1的RING锌指区位于C-末端(图2A)，而在EL5和XB3中，该区分别位于该蛋白的中间部分或接近C-末端。TopPred和iPSORT程序进行的预测提示OsRHC1可具有多个跨膜区(图2A)，而EL5只有一个，XB3几乎可以肯定没有任何跨膜区(数据未显示)。
BlastP分析显示OsRHC1与GenBank保藏的各种植物品种的其它7种注释蛋白有高度的氨基酸序列同源性(图2A)。这些蛋白质显示与OsRHC1的相同性高于50％(在全长上)，在N-末端那一半有多个跨膜区，在C-末端有RING-HC区。该组蛋白质的RING-HC区的共有序列是Cys-X2-Cys-X11-Cys-X-His-X3-Cys-X2-Cys-X6-Cys-X2-Cys(SEQ ID NO：8)。这些同源物的功能明显未经公开。
证明OsRHC1是膜结合的
为证实OsRHC1如生物信息学工具所示是膜结合的，采用分级方案分离膜结合和可溶性蛋白质(从Jiang和Rogers，J.Cell Biol.(1998)143：1183-1199所述方法改进)。对于蛋白质印迹分析，先用聚丙烯酰胺凝胶(4％浓缩；10％分辨)电泳分离蛋白质，再用BR公司的SD半干式电泳转移槽(SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell，Bio-Rad 170-3949)将蛋白质转移至活化的PVDF膜(用无水甲醇预处理20分钟，再用蛋白质转移缓冲液处理15分钟)。按照生产商英杰公司的手册(Western BreezeTM免疫检测试剂盒，InvitroGen WB7106)进行封闭和检测步骤。通过将合成肽(‘N’-CGYPPEVVRKMPKRD-‘C’)(SEQ ID NO：9)注射入家兔，由商品化服务机构(英杰公司，定制抗体)制备靶向OsRHC1蛋白的第一抗体(多克隆)，先用亲和柱纯化抗体再使用。利用偶联于碱性磷酸酶的抗-兔第二抗体(在Western BreezeTM免疫检测试剂盒中提供，英杰公司WB7106)识别第一抗体。蛋白质印迹分析证实OsRHC1蛋白质与膜紧密相连(图2B)。
实施例3OsRHC1在水稻品系CBB14和CBB23中是创伤诱导的
为研究OsRHC1的表达模式，利用两种近等同基因对(含有Xa14的CBB14及其易感性回归亲本SN1033；CBB23，含有Xa23的抗性品系及其易感性回归亲本JG30)的逆转录RNA样品进行实时PCR分析。水稻品系生长在暖房的常规田地土壤中(温度为24-28℃；RH 70-80％；自然光)。通过Zhang，Q.等，同上(1996)所述的剪切方法接种Xoo菌株LN44和P6。模拟接种和创伤处理遵循同一方案，除了用病原体替代水。对于时程实验，在第0、2、4、6天，大致相同的时间(上午8-10点)收集样品。第0天样品在处理前收集。
为通过实时PCR评估OsRHC1的表达，通过Ausubel等，《最新分子生物学方法》(
)(1995)JW父子公司(JWiley&Sons)，纽约所述的酚提取法提取总RNA。通过DNA酶I(英杰公司18068-015)-处理RNA样品的逆转录(18-聚体寡聚-dT；SUPERSCRIPTTMIIRNA酶H(英杰18064-071))产生cDNA样品。
利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的ABI PRISM 7700序列检测系统在具有圆盖的96-孔PCR平板中进行cDNA的实时PCR扩增。反应在20μl反应体积中进行，其中含有10μlSYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统公司4309155)和0.3μM的各正向和反向引物。实时PCR的OsRHC1引物为：5’-AAAGAAGAGCAAGCCCGG TTAT-3’(SEQ ID NO：10)和5’-GCCTCCATACCTCTTCTGCAA-3’(SEQ ID NO：11)。所有反应独立进行至少4次，至少3组一致的数据用于分析。利用引物组5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’(SEQ ID NO：12)和5’-GACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’(SEQ ID NO：13)的肌动蛋白(稻(O.sativa)OsAc1D；登录号：X15865)的表达水平用于标准化结果。通过2-ΔΔCT方法(Livak和Schmittgen，Methods(2001)25：402-408)计算相对基因表达。
为确认可靠性数据，比较所有实时PCR反应的靶基因和持家基因之间的扩增效率，检测所有PCR产物的解离曲线以确保PCR的质量。至少利用两个独立批次的植物样品，观察到基因表达模式一致。所有PCR产物至少测序一次以证实定量测定了正确的靶标。
当接种不相容的Xoo菌株(对于Xa14是LN44，对于Xa23是P6)时，含有Xa14或Xa23的水稻品系显示诱导了OsRHC1基因表达，而易感回归亲本没有反应，分别如图3A和3B所示。然而，在遭受创伤的模拟接种样品中也观察到这种诱导作用，提示OsRHC1可以是创伤可诱导的。在含有赋予广谱抗性的Xa23基因座的CBB23的情况中，诱导幅度更强。
进一步分析了创伤对CBB23品系及其易感回归亲本JG30中OsRHC1表达的影响。通过叶片剪切使(植物)受伤后收集RNA和蛋白质样品。通过剪切使CBB23和JG30稻品系(8-周龄植物)受伤。收集受伤前的第0天叶片样品。剪切后第2、4和6天收集离受伤部位约6-8mm的叶片组织。平行制备总RNA和膜结合蛋白样品。如上所述进行实时PCR实验。如实施例2所述，利用抗-OsRHC1抗体进行蛋白质印迹分析。
CBB23中，OsRHC1基因表达的诱导峰值在处理后第4天出现(图4A)。膜结合蛋白的蛋白质印迹分析显示在第4天的基因表达诱导后，CBB23中OsRHC1蛋白的产量在第6天大大增加(图4B)。与CBB23相比，JG30中的反应不明显，表明有Xa23基因座存在可在OsRHC1的创伤诱导中起作用。
转基因拟南芥品系的产生
为检验OsRHC1是否能在双子叶植物中介导抗性，修饰拟南芥以产生OsRHC1蛋白并用丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000攻击。将OsRHC1cDNA插入二元载体，转基因表达由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动。采用真空侵入方法(Bechtold，N.等，Methods Mol.Biol.(1998)82：259-266)进行野生型Col-0拟南芥品系的土壤杆菌介导转化。通过后代的卡那霉素耐受性表型(由二元载体中的选择标记基因编码)筛选具有单插入基因座的转基因植物。κ2检验证实T1代中比例为3∶1(抗性∶易感性)提示有单插入事件。
只繁殖含有单插入基因座的阳性转化体以获得纯合品系用于进一步实验。通过Northern印迹分析检测3个独立纯合转基因品系中的转基因表达。如图5A所示，3个转化品系，B-1-4、G-1-5和H-2-9显示高水平的mRNA产量。然而，野生型的Col-0品系未显示有mRNA产生。
拟南芥在生长室中生长(温度22-24℃；RH 70-80％；光照强度80-120μE，16小时白天-8小时黑夜周期)。如以前所述(由Kim，H.S.等，Plant Cell(2002)14：1469-1482；Uknes，S.等，Plant Cell(1992)4：645-656改进)进行PstDC3000培养液的制备、接种(通过浸渍方法)和随后的滴度测定。用补加了0.02％(v/v)Silwet L-77的10mM MgSO4配制的浓度为108菌落形成单位/毫升的Pst DC3000攻击6-周龄幼苗(Pieterse，C.M.J.等，Plant Cell(1998)10：1571-1580；Ton，J.等，Mol.Plant-Microbe Interact.(2002)15：27-34)。
Pst DC3000接种在感染的Col-0和用空载体V7转化的转基因植物中导致严重的黄化和坏死，而在所有OsRHC1转基因品系中疾病症状非常轻，如图5B所示。
莲座丛叶片内的病原体滴度与观察到的表型一致(图5C)。此外，显示转基因表达水平最高的H-2-9品系的病原体滴度也最低(比较图5A和5C)。
OsRHC1的表达增强转基因拟南芥中防御标记基因的表达
检验了4种防御标记基因，PR1、PR2、PDF1.2和Thi2.1在转基因拟南芥中的表达。在拟南芥中，这些基因是包括SA、JA和ET在内的不同植物激素介导防御途径的标志。
收集表达OsRHC1的6周龄拟南芥转基因品系(B-1-4、G-1-5和H-2-9)和未转化野生型(Col-0)的叶片组织以制备总RNA，然后进行实施例3所述的实时PCR。所用引物如下所示：
PR1：5’-TCAAGATAGCCCACAAGATTATC-3’(SEQ ID NO：14)和5’-CTTCTCGTTCACATAATTCCCAC-3’(SEQ ID NO：15)；
PR2：5’-ACCACCACTGATACGTCTCCTC-3’(SEQ ID NO：16)和5’-AACTTCATACTTAGACTGTCGATC-3’(SEQ ID NO：17)；
PDF1.2：5’-CCCTTATCTTCGCTGCTCTTGT-3’(SEQ ID NO：18)和5’-CCCTGACCATGTCCCACTTG-3’(SEQ ID NO：19)；
Thi2.1：5’-AGCACTGCAAGTTAGGGTGTGA-3’(SEQ ID NO：20)和5’-ACATTGTTCCGACGCTCCAT-3’(SEQ ID NO：21)。
利用引物组5’-GAAGGTGCTGAGTTGATTG-3’(SEQ ID NO：22)和5’-GGACTTGACGTTGTTTGG-3’(SEQ ID NO：23)的微管蛋白(拟南芥β-微管蛋白4，登录号：M21415)用于标准化结果。
将图6A所示各转基因品系中PR1(实心)、PR2(空心)、PDF1.2(阴影线)和Thi2.1(打点的)的表达水平与Col-0的那些表达水平(表达水平设置为1)作比较。
在常规生长条件下的6-周龄幼苗中，与野生型Col-0相比，所有4种防御标记基因表达增强(图6A)。有两种不同信号传导途径介导的PR1和PDF1.2基因的诱导倍数尤其较高。在所测试的3种独立转基因品系中，在病原体接种实验中显示转基因表达最高和最佳保护作用的H-2-9品系的PR1和PDF1.2诱导倍数也最高(与图5和6A相比)。
当植物经历Pst DC3000攻击时，Col-0中PR1和PR2转录物的水平增加(数据未显示)，但在转基因品系中这些基因的表达水平甚至更高(图6B)。虽然病原体接种未显著改变Col-0中的Thi2.1水平(数据未显示)，但在转基因品系中其表达升高(图6B)。另一方面，Col-0和转基因品系中PDF1.2的表达均受Pst DC3000接种的抑制(图6B)。
为显示OsRHC1和泛素介导的蛋白质降解之间的关系，在转基因品系中研究了MG132(一种26S蛋白酶体抑制剂)对防御标记基因表达的影响。对4周龄幼苗进行MG 132处理。采用从以前报道(Abas，L.等，Nature CellBiol.(2006)8：249-256；Dong，C.H.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA(2006)103：8281-8286；Guo，H.等，Cell(2003)115：667-677；-Sánchez，L.等，Plant Physiol.(2002)128：1313-1322)改进的方法将26S蛋白酶体抑制剂(MG132)应用于转基因拟南芥。简言之，将溶解在补加了0.01％(v/v)SilwetL-77的1％(v/v)DMSO中的50mg/L MG132倾倒在MS方板上以覆盖幼苗的根部，但不覆盖气生组织。用同样的方法进行模拟处理，除了不加MG 132。4小时后，收集幼苗以供RNA提取，然后进行实时PCR。
该处理未影响转基因的表达(数据未显示)。在Col-0中，未观察到MG132对防御标记基因的表达有显著影响。在另一方面，MG132处理下，过表达的OsRHC1对4种防御标记基因的诱导作用降低，PR1、PR2、PDF1.2和Thi2.1分别如图7A-7D所示，其中空心柱表示模拟处理，实心柱表示MG132处理。
总之，看来在所有情况中，OsRHC1蛋白质增强防御标记基因表达的能力受到26S蛋白酶体抑制剂的抑制。因此，看来本发明蛋白质增强防御标记基因表达的能力可能依赖于26S蛋白酶体活性。
转基因拟南芥中OsRHC1克隆的保护性功能依赖于NPR1的功能
采用模型植物系统(model plant system)定位与防御信号传导网络中已知节点相关的OsRHC1的功能。介导SA和JA/ET的NPR1传递信号并在拟南芥的防御信号传导中起中心作用。如上所述，将OsRHC1转化入消除了NPR1的npr1-3拟南芥突变体。选择含单插入基因座的独立转化体。接种时，采用实施例3所述的实时PCR检测各品系中转基因的表达(在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下)。发现npr1-3背景中OsRHC1的稳态水平与具有Col-0背景的转基因品系中的相当(数据未显示)。
用Pst DC3000攻击表达OsRHC1的8-周龄转基因品系(D-2、E-1、F-1、G-1和G-2)，未转化的npr1-3突变体和野生型Col-0，随后评估病原体滴度，如图8A所示。如实施例5所述测定防御标记基因的表达。各品系中PR1(实心)、PR2(空心)、PDF1.2(阴影线)和Thi2.1(打点)的表达与Col-0(表达水平设置为1)的相当，如图8B所示。这些转基因品系的任一种中均未发现4种选择的防御标记基因表达有显著增加。
当npr1-3转基因品系经历Pst DC3000攻击时，在转基因品系中未观察到保护作用。这些转基因品系的疾病症状产生(数据未显示)和病原体滴度与未转化的npr1-3突变体相似。因此，保护作用看来需要NPR1。
OsRHC1转基因水稻的构建
将图1所示编码OsRHC1的核苷酸序列亚克隆入双T-DNA二元载体，pSB130(香港中文大学Liu Qiaoquan博士和Samuel Sun教授馈赠)。载体pSB130携带两份T-DNA。一份T-DNA具有潮霉素抗性基因(可选择标记)，另一份在玉米泛素启动子的下游具有多克隆位点以供克隆靶基因。将重组构建物转化入土壤杆菌EHA105以供水稻转化，构建转基因水稻品系。
图9显示在T2转基因水稻品系中PCR筛选OsRHC1转基因(亲本：爱知旭(Aichi Asahi))。PCR的正向和反向引物分别来自玉米泛素启动子和OsRHC1编码区，如下所示：
正向引物：5’-CTGATGCATATACATGATGG-3’(SEQ ID NO：24)；
反向引物：5’-ACATTGCACAACCAACATGTAC-3’(SEQ ID NO：25)。
总共获得5个OsRHC1转基因水稻品系。
水稻中OsRHC1和防御标记基因的过表达
通过实施例3所述的实时PCR研究OsRHC1和3种水稻防御标记基因(PR1，富含甘氨酸的细胞壁蛋白编码基因(GRCWP)和PBZ1)的表达。PR1是熟知的PR蛋白。富含甘氨酸的细胞壁蛋白(GRCWP所编码)是在增强的细胞壁中常见的结构蛋白以阻碍病原体攻击。PBZ1由噻菌灵(probenazole)(PBZ)，N-氰基甲基-2-氯-异烟酰胺(已知诱导疾病抗性的化合物)以及真菌枯萎性病原体稻瘟菌(M.grisea)诱导。不相容的稻瘟菌菌株诱导PBZ1快于相容菌株。NH1(水稻防御反应中的关键性信号传导组分)的过表达诱导PR1和PBZ1。
从携带单插入OsRHC1的8-周龄转基因水稻品系(T3代)和它们的野生型亲本(爱知旭)提取RNA。实时PCR所用引物如下所示：
稻(O.sativa)OsRHC1正向引物：5’-AAAGAAGAGCAAGCCCGGTTAT-3’(SEQ ID NO：26)；
稻OsRHC1反向引物：5’-GCCTCCATACCTCTTCTGCAA-3’(SEQ IDNO：27)；
稻PR1(BF889437)正向引物：5’-CGGACAGAGGCCTTACTAAGTTATTT-3’(SEQ ID NO：28)；
稻PR1(BF889437)反向引物：5’-GACCTGTTTACATTTTCACGTCTTTATT-3’(SEQ ID NO：29)；
稻GRCWP(BF889438)反向引物：5’-GAGGCAACGGACACCACTAAG-3’(SEQ ID NO：30)；
稻GRCWP(BF889438)反向引物：5’-TGTAAAGCAGAGAGAGAGGCTCATT-3’(SEQ ID NO：31)；
稻PBZ1(D38170)正向引物：5’-AAGCTCAAGTCACACTCGAC-3’(SEQ ID NO：32)；
稻PBZ1(D38170)反向引物：5’-GATGTCCTTCTCCTTCTCC-3’(SEQID NO：33)。
用于标准化的肌动蛋白引物是：
稻OsAc1D(X15865)正向引物：5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’(SEQ ID NO：34)；
稻OsAc1D(X15865)反向引物：5’-GACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’(SEQ ID NO：35)。
图10A显示通过实时PCR检测到OsRHC1在转基因品系中过表达。如实施例2所述进行的蛋白质印迹分析得到图10B所示结果。转化体通常显示蛋白质含量高于野生型。
图11显示过表达OsRHC1对3种水稻防御标记基因表达的诱导作用。这3种防御标记基因的诱导程度通常与OsRHC1表达水平正相关。例如，显示较高OsRHC1水平的两种转基因R8和R12还诱导这3种防御标记基因更大程度的表达(比较图10和11)。
OsRHC1是E3泛素连接酶
本实施例证明OsRHC1能自泛素化，泛素E3连接酶的共有特性。
制备缺乏位于N-末端的跨膜区的OsRHC1的部分片段(OsRHC1p)。只包括位于C-末端的RING-HC区，因为存在跨膜区使得从大肠杆菌细胞中提取困难。
用侧接含有RING-HC区的C-末端那一半的以下引物组扩增编码序列的合适C-末端部分：HMOL5743(5’-CCGGAATTCGTTGTTCTACTATTACGAAATGG-3’)(SEQ ID NO：36)和HMOL2625(5’-CAGGTCGACGTTAAACATCATATACGGGCATG-3’)(SEQ ID NO：37)。按照以下循环进行PCR反应：94℃，5分钟；30轮的94℃、30秒，55℃、30秒和72℃、1分钟；然后是72℃延伸5分钟。将扩增的产物亚克隆入具有EcoRI和XhoI限制性位点的pGex-4T-1载体，从而与GST编码区框内融合。然后在DE3细胞中表达融合蛋白，生长期间在30℃，用1.5mM IPTG诱导2小时。室温下用1mg/ml溶菌酶裂解细菌细胞1小时，然后用液氮和温水浴进行5轮冻/融来提取GST-OsRHC1p蛋白。用GE保健公司(GH Healthcare)的GST SpinTrap纯化模块纯化提取的蛋白。
在加有400ng GST-OsRHC1p或只有GST蛋白的泛素化缓冲液(40mMTris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl，2mM ATP，2mM二硫苏糖醇，300ng/μl泛素，25μM MG132，5μl小麦胚芽提取物(提供E1和E2酶)(普罗麦格公司(Promega)))中进行体外泛素化试验。未加ATP和泛素的相同反应缓冲液用作阴性对照(如Bazirgan，O.A.等，J.Biol.Chem.(2006)281：38989-39001；Matsuda，N.等，J.Cell.Sci.(2001)114：1949-1957所述改进)。反应混合物置于室温2小时，然后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳，然后用抗-OsRHC1特异性抗体进行蛋白质印迹分析(图12)。
在包含ATP和泛素的反应中(+ve)观察到GST-OsRHC1的自泛素化，但在不含ATP和泛素的反应中(-ve)未观察到。
这些结果证明与其它E3连接酶相似，OsRHC1经历自泛素化。
鉴定OsRHC1结合伴侣
以GenBank登录号ABA98865.1保藏的克隆编码的蛋白质鉴定为结合伴侣。这可采用酵母菌双杂交方案确定，并通过共沉淀验证。该保藏克隆编码的蛋白质在稻(日本栽培品种(Japonica Cultivar-Group))中表达，但其不具有鉴定的功能。然而，由于其与OsRHC1相互作用，估计其能调节植物防御反应。
酵母菌双杂交方法利用商品化试剂盒，BD MatchmakerTM文库构建和筛选试剂盒(克隆技术公司K1516-1)。首先用寡聚物HMOL2624(5’-CCGAATTCATGCCAGCCCCTTCGCTTC-3’)(SEQ ID NO：38)和HMOL2625(5’-CAGGTCGACGTTAAACATCATATACGGGCATG-3’)(SEQ ID NO：39)扩增OsRHC1，用EcoRI和SalI消化，亚克隆入pGBKT7的读框中，并转化入酵母株Y187。从用pGBKT7-OsRHC1和对照pGBKT7转化的酵母菌克隆提取蛋白质。利用抗-c-Myc表位标签抗体的蛋白质印迹分析证实存在与OsRHC1蛋白融合的DNA结合区。
按照生产商的手册，将接种相应的不相容病原体(Xa2为T2；Xal2为P1；Xal4为LN44；Pita、Pib和Pik为Ken54-04)4天的几种水稻品系(各含有以下R基因之一：Xa2、Xal2、Xal4、Pita、Pib和Pik)的RNA样品用作起始材料，在酵母菌AH109中来构建AD区融合酵母菌文库。通过在pGBKT7-OsRHC1转化的Y187和AH109酵母菌文库之间的配对进行两轮文库筛选。在SD-Trp、Leu和His(SD/-3)琼脂板上选择酵母菌二倍体配对产物，30℃温育4天。只将生长至直径2-3mm的菌落划线接种到SD-Trp、Leu、His和Ade(SD/-4)琼脂板上。通过lacZ受体基因活性的菌落转移过滤试验(colony-lift filter assay)(《酵母菌方案手册》(
)，克隆技术公司PT3024-1)来检验选择的克隆。编码表达的蛋白质的部分克隆(登录号：ABA98865.1)(标记为HML1797)产生阳性结果。pGBKT7-OsRHC1和pGADT7-HML1797的再转化(retransformation)入AH109证实这不是因为突变。
为验证酵母菌-2-杂交实验的结果，进行免疫共沉淀试验。用引物HMOL5311(5’-AACCCGGGATGGCCGTGGGGTCAGAG-3’)(SEQ ID NO：40)和HMOL5312(5’-TTCCCGGGTCAAAATAAAAACAAATAAAAAAACAC-3’)(SEQ ID NO：41)扩增ABA98865.1的全长编码区，用SmaI消化，亚克隆入SmaI线形化的pGADT7-Rec载体以产生含有框内HA标签的融合蛋白(HA-ABA98865.1)；这称为HML1846。联用RiboMAX RiboMAXTM大规模RNA生产系统-T7(普罗麦格公司)、小麦胚芽提取物(普罗麦格公司)和TranscendTM生物素-赖氨酰-tRNA系统(普罗麦格公司)分别体外转录并翻译该构建物。
从过表达OsRHC1的水稻品系提取总蛋白(从Boyes，D.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：15849-15854；Greve，K.等，Biochem.J.(2003)371：97-108改进)。利用BD MatchmakerTM免疫共沉淀试剂盒(克隆技术公司630449)，将含有100μg蛋白质的水稻样品与40μl上述HA标签融合蛋白混合在含有50mM Tris/HCl(pH 7.5)、250mM NaCl、2mM MgCl2、0.5mMCaCl2、10％(v/v)甘油、1.5％(v/v)1mM PMSF、2mg/L亮肽素的免疫共沉淀缓冲液中(从Boyes等，1998(同上)；Greve等，2003(同上)改进)。抗-HA表位标记的抗体用于沉淀蛋白质复合物。利用抗-OsRHC1抗体检测蛋白质信号。
蛋白质印迹显示HA标签融合的ABA98865.1沉淀了OsRHC1，但当用融合了HA标签的无关蛋白质处理水稻蛋白提取物时，蛋白质印迹未检测到蛋白质。
序列表
<110>林汉明(LAM，Hon-Ming)
辛世文(SUN，Sai-Ming Samuel)
<120>增强植物对感染的抵抗力的方法
<130>549072000740
<140>PCT/US2008/068189
<141>2008-06-25
<150>US 60/947,365
<151>2007-06-29
<150>US 60/947,590
<151>2007-07-02
<160>52
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(107)
<223>RING锌指HC亚类共有
<220>
<221>Misc_feature
<222>(2)...(3)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>Misc_feature
<222>(5)...(43)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有30个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(45)...(47)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有2个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(49)...(51)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有1个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(53)...(54)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>Misc_feature
<222>(56)...(103)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有44个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(105)...(106)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400>1
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa His
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
100 105
<210>2
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(107)
<223>RING锌指H2亚类共有
<220>
<221>Misc_feature
<222>(2)...(3)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>Misc_feature
<222>(5)...(43)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有30个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(45)...(47)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有2个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(49)...(51)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有1个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(53)...(54)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>Misc_feature
<222>(56)...(103)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸，最多可有44个不存在
<220>
<221>Misc_feature
<222>(105)...(106)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400>2
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa His
35 40 45
Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys
100 105
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ttctccatgt tcggtaaacc tttc 24
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
taaagttgtg attgagacta catgg 25
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
acattgcaca accaacatgt ac 22
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cctcactttt gtctcccac 19
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
cgacattgca caaccaac 18
<210>8
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(35)
<223>RING-HC结构域共有
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(35)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<400>8
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa His Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
20 25 30
Xaa Xaa Cys
35
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<400>9
Asn Cys Gly Tyr Pro Pro Glu Val Val Arg Lys Met Pro Lys Arg Asp
1 5 10 15
Cys
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
aaagaagagc aagcccggtt at 22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gcctccatac ctcttctgca a 21
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
cttcatagga atggaagctg cgggta 26
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
gaccaccttg atcttcatgc tgcta 25
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
tcaagatagc ccacaagatt atc 23
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
cttctcgttc acataattcc cac 23
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
accaccactg atacgtctcc tc 22
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
aacttcatac ttagactgtc gatc 24
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cccttatctt cgctgctctt gt 22
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ccctgaccat gtcccacttg 20
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
agcactgcaa gttagggtgt ga 22
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
acattgttcc gacgctccat 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
gaaggtgctg agttgattg 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggacttgacg ttgtttgg 18
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>24
ctgatgcata tacatgatgg 20
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>25
acattgcaca accaacatgt ac 22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>26
aaagaagagc aagcccggtt at 22
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>27
gcctccatac ctcttctgca a 21
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>28
cggacagagg ccttactaag ttattt 26
<210>29
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>29
gacctgttta cattttcacg tctttatt 28
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>30
gaggcaacgg acaccactaa g 21
<210>31
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>31
tgtaaagcag agagagaggc tcatt 25
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>32
aagctcaagt cacactcgac 20
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>33
gatgtccttc tccttctcc 19
<210>34
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>34
cttcatagga atggaagctg cgggta 26
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>35
gaccaccttg atcttcatgc tgcta 25
<210>36
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ccggaattcg ttgttctact attacgaaat gg 32
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
caggtcgacg ttaaacatca tatacgggca tg 32
<210>38
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ccgaattcat gccagcccct tcgcttc 27
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
caggtcgacg ttaaacatca tatacgggca tg 32
<210>40
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
aacccgggat ggccgtgggg tcagag 26
<210>41
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
ttcccgggtc aaaataaaaa caaataaaaa aacac 35
<210>42
<211>1230
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(1230)
<223>RING锌指蛋白基因(OsRHC1)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1230)
<400>42
atg cca gcc cct tcg ctt cct cat ggc cgt cat tgg gct cct tgc cat 48
Met Pro Ala Pro Ser Leu Pro His Gly Arg His Trp Ala Pro Cys His
1 5 10 15
tca att gtt gca gcg ccg ttg ctt att gcg ttt gag ctg ctg ctt tgc 96
Ser Ile Val Ala Ala Pro Leu Leu Ile Ala Phe Glu Leu Leu Leu Cys
20 25 30
ata tat ctc gaa agt ttg aga gtt aaa agt aag ccg act gtt gat ttg 144
Ile Tyr Leu Glu Ser Leu Arg Val Lys Ser Lys Pro Thr Val Asp Leu
35 40 45
aag att gta ttc ctt cct ctt ctg gcc ttt gaa gtg att att ctt gtt 192
Lys Ile Val Phe Leu Pro Leu Leu Ala Phe Glu Val Ile Ile Leu Val
50 55 60
gac aat ttc aga atg tgt aga gct tta atg cca gga gat gaa gaa agt 240
Asp Asn Phe Arg Met Cys Arg Ala Leu Met Pro Gly Asp Glu Glu Ser
65 70 75 80
atg agc gat gaa gct att tgg gag aca ctt cct cac ttt tgg gtt gca 288
Met Ser Asp Glu Ala Ile Trp Glu Thr Leu Pro His Phe Trp Val Ala
85 90 95
att tct atg gtg ttt ctt ata gct gct aca acc ttc aca ctt ttg aag 336
Ile Ser Met Val Phe Leu Ile Ala Ala Thr Thr Phe Thr Leu Leu Lys
100 105 110
ctg tct ggt gat gtt ggt gct ttg gga tgg tgg gat ttg ttt ata aat 384
Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn
115 120 125
tat gga atc gcg gag tgt ttt gca ttt ctt gtt tgt act aga tgg ttt 432
Tyr Gly Ile Ala Glu Cys Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Arg Trp Phe
130 135 140
aat ccc atg att cat aaa tct cct aat cct ggg gag gct agc tca tca 480
Asn Pro Met Ile His Lys Ser Pro Asn Pro Gly Glu Ala Ser Ser Ser
145 150 155 160
tca gcg gca att aga tac cgt gat tgg gag agt ggt ctt ctc ctc cca 528
Ser Ala Ala Ile Arg Tyr Arg Asp Trp Glu Ser Gly Leu Leu Leu Pro
165 170 175
tca cta gaa gat cat gaa caa gag agg ctc tgt ggt ctt cct gac ata 576
Ser Leu Glu Asp His Glu Gln Glu Arg Leu Cys Gly Leu Pro Asp Ile
180 185 190
ggc ggt cac gta atg aaa ata cca ctg gtg att ttc caa gtt ttg ctt 624
Gly Gly His Val Met Lys Ile Pro Leu Val Ile Phe Gln Val Leu Leu
195 200 205
tgt atg cgc ttg gag ggt acg cct cct agt gct cag tat att ccg ata 672
Cys Met Arg Leu Glu Gly Thr Pro Pro Ser Ala Gln Tyr Ile Pro Ile
210 215 220
ttt gca ctg ttc tcc cca cta ttt att tta caa ggc gct ggt gtc ctt 720
Phe Ala Leu Phe Ser Pro Leu Phe Ile Leu Gln Gly Ala Gly Val Leu
225 230 235 240
ttc tct cta gca aga ttg ttg gag aag gtt gtt cta cta tta cga aat 768
Phe Ser Leu Ala Arg Leu Leu Glu Lys Val Val Leu Leu Leu Arg Asn
245 250 255
gga cca gtt agt cct aat tac ctt aca atc tca tca aaa gtc cgt gat 816
Gly Pro Val Ser Pro Asn Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Lys Val Arg Asp
260 265 270
tgc ttt gct ttt ctt cat cgt ggt tca agg ctt ctt ggt tgg tgg tct 864
Cys Phe Ala Phe Leu His Arg Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser
275 280 285
att gat gaa ggc agc aaa gaa gag caa gcc cgg tta ttc tat act gaa 912
Ile Asp Glu Gly Ser Lys Glu Glu Gln Ala Arg Leu Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
tct act ggg tac aac aca ttt tgt ggc tat cca cct gag gta gtc agg 960
Ser Thr Gly Tyr Asn Thr Phe Cys Gly Tyr Pro Pro Glu Val Val Arg
305 310 315 320
aaa atg cct aag agg gat ctt gca gaa gag gta tgg agg ctc caa gca 1008
Lys Met Pro Lys Arg Asp Leu Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala
325 330 335
gct ttg gga gag caa tca gaa att acc aaa tgt acc aag cag gaa ttt 1056
Ala Leu Gly Glu Gln Ser Glu Ile Thr Lys Cys Thr Lys Gln Glu Phe
340 345 350
gaa agg ctt caa aat gag aag gtt ctt tgt agg att tgc tac gag ggg 1104
Glu Arg Leu Gln Asn Glu Lys Val Leu Cys Arg Ile Cys Tyr Glu Gly
355 360 365
gag ata tgc atg gtc tta ctt cct tgc cgg cac aga aca tta tgc aag 1152
Glu Ile Cys Met Val Leu Leu Pro Cys Arg His Arg Thr Leu Cys Lys
370 375 380
act tgt tct gat aag tgc aag aaa tgt cca atc tgc cgt gtg ccc att 1200
Thr Cys Ser Asp Lys Cys Lys Lys Cys Pro Ile Cys Arg Val Pro Ile
385 390 395 400
gaa gaa cgc atg ccc gta tat gat gtt taa 1230
Glu Glu Arg Met Pro Val Tyr Asp Val *
405
<210>43
<211>409
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(409)
<223>RING锌指蛋白基因(OsRHC1)
<400>43
Met Pro Ala Pro Ser Leu Pro His Gly Arg His Trp Ala Pro Cys His
1 5 10 15
Ser Ile Val Ala Ala Pro Leu Leu Ile Ala Phe Glu Leu Leu Leu Cys
20 25 30
Ile Tyr Leu Glu Ser Leu Arg Val Lys Ser Lys Pro Thr Val Asp Leu
35 40 45
Lys Ile Val Phe Leu Pro Leu Leu Ala Phe Glu Val Ile Ile Leu Val
50 55 60
Asp Asn Phe Arg Met Cys Arg Ala Leu Met Pro Gly Asp Glu Glu Ser
65 70 75 80
Met Ser Asp Glu Ala Ile Trp Glu Thr Leu Pro His Phe Trp Val Ala
85 90 95
Ile Ser Met Val Phe Leu Ile Ala Ala Thr Thr Phe Thr Leu Leu Lys
100 105 110
Leu Ser Gly Asp Val Gly Ala Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn
115 120 125
Tyr Gly Ile Ala Glu Cys Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Arg Trp Phe
130 135 140
Asn Pro Met Ile His Lys Ser Pro Asn Pro Gly Glu Ala Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Ala Ala Ile Arg Tyr Arg Asp Trp Glu Ser Gly Leu Leu Leu Pro
165 170 175
Ser Leu Glu Asp His Glu Gln Glu Arg Leu Cys Gly Leu Pro Asp Ile
180 185 190
Gly Gly His Val Met Lys Ile Pro Leu Val Ile Phe Gln Val Leu Leu
195 200 205
Cys Met Arg Leu Glu Gly Thr Pro Pro Ser Ala Gln Tyr Ile Pro Ile
210 215 220
Phe Ala Leu Phe Ser Pro Leu Phe Ile Leu Gln Gly Ala Gly Val Leu
225 230 235 240
Phe Ser Leu Ala Arg Leu Leu Glu Lys Val Val Leu Leu Leu Arg Asn
245 250 255
Gly Pro Val Ser Pro Asn Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Lys Val Arg Asp
260 265 270
Cys Phe Ala Phe Leu His Arg Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser
275 280 285
Ile Asp Glu Gly Ser Lys Glu Glu Gln Ala Arg Leu Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
Ser Thr Gly Tyr Asn Thr Phe Cys Gly Tyr Pro Pro Glu Val Val Arg
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Lys Met Pro Lys Arg Asp Leu Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala
325 330 335
Ala Leu Gly Glu Gln Ser Glu Ile Thr Lys Cys Thr Lys Gln Glu Phe
340 345 350
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355 360 365
Glu Ile Cys Met Val Leu Leu Pro Cys Arg His Arg Thr Leu Cys Lys
370 375 380
Thr Cys Ser Asp Lys Cys Lys Lys Cys Pro Ile Cys Arg Val Pro Ile
385 390 395 400
Glu Glu Arg Met Pro Val Tyr Asp Val
405
<210>44
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(467)
<223>注释的蛋白NP-564052
<400>44
Met Ser Cys Arg Arg Val Leu Lys Ser Ile Gln Ala Leu Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Leu Leu Phe Cys Phe Thr Leu Leu Leu Val Leu Lys Leu Asp His
20 25 30
Thr Val Ser Ser Ser Trp Trp Met Val Phe Phe Pro Leu Trp Ala Phe
35 40 45
His Ala Val Val Ala Arg Gly Arg Phe Ser Leu Pro Ala Pro Val Ala
50 55 60
Pro Arg Asn Arg His Trp Ala Pro Cys Hi s Ala ValVal Ala Thr Pro
65 70 75 80
Leu Leu Val Ala Phe Glu Leu Leu Leu Cys Ile Tyr Leu Glu Ser Ser
85 90 95
Tyr Ala Arg Trp Pro Pro Ala Val Ser Leu Lys Ile Ala Phe Leu Pro
100 105 110
Leu Leu Ala Phe Glu Leu Thr Ile Leu Val Asp Asn Leu Arg Met Cys
115 120 125
Arg Ala Leu Met Pro Gly Asp Asp Asp Ser Ile Thr Asp Asp Ala Ile
130 135 140
Trp Glu Ala Leu Pro His Phe Trp Val Ala Ile Ser Met Val Phe Thr
145 150 155 160
Leu Ala Ala Thr Phe Phe Thr Leu Leu Lys Leu Ser Gly Asp Val Val
165 170 175
Ala Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn Phe Gly Ile Ala Glu Cys
180 185 190
Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Lys Trp Ser Asn Pro Val Ile His Arg
195 200 205
Ser Ser Arg Ala Arg Glu Thr Gly Ser Ser Ser Thr Ser Ile Arg Tyr
210 215 220
Leu Asp Trp Asn Ser Gly Leu Val Val Ala Pro Glu Glu Asp Arg His
225 230 235 240
Gln Asp Arg Trp Cys Gly Leu Gln Asp Ile Gly Gly His Met Leu Lys
245 250 255
Ile Pro Val Ile Leu Phe Gln Val Val Leu Cys Met Tyr Leu Glu Gly
260 265 270
Thr Pro Glu Arg Ala Lys Asp Ile Ser Ile Pro Val Leu Phe Ser Pro
275 280 285
Leu Phe Leu Leu Gln Gly Leu Gly Val Leu Phe Ala Ala Ser Lys Leu
290 295 300
Leu Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Arg Gly Glu Ala Gly Pro Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Phe Arg Phe Ser Ser Ser Ala His Asp Cys Leu Gly Phe Leu His
325 330 335
His Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser Ile Asp Glu Gly Ser Arg
340 345 350
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355 360 365
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Leu Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gly Glu Gln Thr
385 390 395 400
Glu Ile Thr Lys Phe Ser Gln Gln Glu Tyr Glu Arg Leu Gln Asn Glu
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Lys Val Leu Cys Arg Val Cys Phe Glu Lys Asp Ile Ser Leu Val Leu
420 425 430
Leu Pro Cys Arg His Arg Val Leu Cys Arg Thr Cys Ala Asp Lys Cys
435 440 445
Thr Thr Cys Pro Ile Cys Arg Ile Asp Ile Glu Lys Arg Leu Ser Val
450 455 460
Tyr Asp Val
465
<210>45
<211>466
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(466)
<223>注释的蛋白NP-177535
<400>45
Met Asn Cys Trp Arg Val Leu Lys Ser Val Gln Ala Ser Val Ala His
1 5 10 15
Cys Phe Leu Phe Ser Phe Thr Leu Ala Leu Val Leu Lys Leu Asp His
20 25 30
Ser Ile Thr Tyr Ser Trp Trp Val Val Cys Leu Pro Leu Trp Ala Phe
35 40 45
His Ala Val Val Ala Arg Gly Arg Phe Ser Leu Pro Ala Pro Ile Ala
50 55 60
Pro Arg Asn Arg His Trp Ala Pro Cys His Ala Ile Val Ser Thr Pro
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ala Phe Glu Leu Leu Leu Cys Val Tyr Leu Glu Thr Ala
85 90 95
Tyr Ala Asp Ser Pro Pro Ala Val Ser Leu Lys Ile Val Phe Leu Pro
100 105 110
Leu Leu Ala Phe Glu Val Ile Ile Leu Val Asp Asn Ala Arg Met Cys
115 120 125
Arg Ala Leu Met Pro Gly Asp Glu Glu Ser Val Asn Asp Glu Ala Val
130 135 140
Trp Glu Ala Leu Pro His Phe Trp Val Ala Ile Ser Met Val Phe Phe
145 150 155 160
Leu Ala Ala Thr Val Phe Thr Leu Leu Lys Leu Ser Gly Asp Val Ala
165 170 175
Ala Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn Phe Gly Ile Ala Glu Cys
180 185 190
Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Lys Trp Ser Asn Pro Val Ile His Arg
195 200 205
Ser Ser Arg Asp Arg Glu Thr Gly Ser Ser Ser Thr Asn Ile Arg Tyr
210 215 220
Leu Asp Trp Asn Ser Gly Leu Gly Val Phe Ser Glu Asp Asp Arg Asn
225 230 235 240
Gln Asp Thr Cys Gly Leu Gln Asp Ile Gly Gly His Ile Met Lys Ile
245 250 255
Pro Leu Ile Val Phe Gln Val Val Leu Cys Met His Leu Glu Gly Thr
260 265 270
Pro Glu Ala Ala Lys Ser Ile Ser Val Pro Val Leu Phe Ser Pro Leu
275 280 285
Phe Leu Leu Gln Gly Val Gly Val Leu Phe Ala Ala Ser Lys Leu Ile
290 295 300
Glu Lys Val Val Leu Leu Leu Arg Gly Glu Asp Asp Thr Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Phe Arg Phe Leu Ser Arg Ala His Asp Cys Leu Gly Phe Leu His His
325 330 335
Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser Ile Asp Glu Gly Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Glu Ala Arg Leu Tyr Phe Asp Gln Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Phe
355 360 365
Cys Gly His Pro Pro Glu Ile Val Lys Lys Met Pro Lys Lys Glu Leu
370 375 380
Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gly Glu Gln Thr Glu
385 390 395 400
Ile Thr Lys Phe Ser Gln Gln Glu Tyr Glu Arg Leu Gln Asn Glu Lys
405 410 415
Val Leu Cys Arg Val Cys Phe Glu Arg Glu Ile Ser Val Val Leu Leu
420 425 430
Pro Cys Arg His Arg Val Leu Cys Arg Asn Cys Ser Asp Lys Cys Lys
435 440 445
Lys Cys Pro Phe Cys Arg Ile Thr Ile Glu Glu Arg Leu Pro Val Tyr
450 455 460
Asp Val
465
<210>46
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(467)
<223>注释的蛋白AAW81737
<400>46
Met Ser Cys Arg Arg Val Leu Lys Ser Ile Gln Ala Leu Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Leu Leu Phe Ser Phe Thr Leu Phe Leu Val Phe Lys Leu Asp His
20 25 30
Thr Leu Ser Cys Ser Trp Trp Met Val Phe Phe Pro Leu Trp Ala Phe
35 40 45
His Ala Val Val Ala Arg Gly Arg Phe Ser Leu Pro Ala Pro Ile Ala
50 55 60
Pro Arg Asn Arg His Trp Ala Pro Cys His Ala Val Val Ala Thr Pro
65 70 75 80
Leu Leu Val Ser Phe Glu Leu Leu Leu Cys Ile Tyr Leu Glu Ser Ser
85 90 95
Tyr Ala Ser Trp Pro Pro Ala Val Ser Leu Arg Ile Ala Ser Leu Pro
100 105 110
Leu Leu Ala Phe Glu Val Thr Ile Leu Ile Asp Asn Leu Arg Met Cys
115 120 125
Arg Ala Leu Met Pro Gly Asp Asp Asp Ser Ile Asn Asp Glu Ala Ile
130 135 140
Trp Glu Ala Leu Pro His Phe Trp Val Ala Ile Ser Met Val Phe Thr
145 150 155 160
Leu Ala Ala Thr Phe Phe Ala Leu Leu Lys Leu Thr Gly Asp Val Ala
165 170 175
Ala Leu Ser Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn Val Gly Ile Ala Glu Cys
180 185 190
Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Lys Trp Ser Asn Pro Val Ile His Arg
195 200 205
Ser Ser Arg Pro Arg Glu Thr Gly Ser Ser Ser Thr Pro Val Arg Tyr
210 215 220
Leu Asp Trp Asn Ser Gly Leu Val Val Thr Pro Glu Gln Asp Asn His
225 230 235 240
Gln Asp Arg Tyr Cys Gly Leu Gln Asp Ile Gly Gly His Leu Leu Lys
245 250 255
Ile Pro Val Ile Val Phe Gln Val Val Leu Cys Met His Leu Glu Gly
260 265 270
Thr Pro Glu Arg Ala Lys Asp Ile Ser Ile Pro Val Leu Phe Ser Pro
275 280 285
Ile Phe Leu Leu Gln Gly Leu Gly Val Leu Phe Ala Thr Ser Lys Leu
290 295 300
Ile Glu Lys Ile Val Asp Leu Leu Gln Gly Glu Ala Gly Thr Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Phe Arg Val Ser Ser Arg Ala His Asp Cys Leu Gly Phe Leu His
325 330 335
His Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser Ile Asp Glu Gly Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Gln Ala Arg Leu Tyr Phe Asp Gln Glu Ser Gly Tyr Asn Thr
355 360 365
Phe Ser Gly His Pro Pro Glu Ile Val Lys Lys Met Pro Lys Glu Asp
370 375 380
Leu Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gly Glu Gln Thr
385 390 395 400
Glu Ile Thr Lys Phe Ser Gln Gln Glu Tyr Glu Arg Leu Gln Asn Glu
405 410 415
Lys Val Leu Cys Arg Val Cys Phe Glu Lys Glu Ile Ser Leu Val Leu
420 425 430
Leu Pro Cys Arg His Arg Val Leu Cys Arg Ile Cys Ser Asp Lys Cys
435 440 445
Thr Lys Cys Pro Ile Cys Arg Val Ala Ile Glu Glu Arg Leu Leu Val
450 455 460
Tyr Asp Val
465
<210>47
<211>466
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(466)
<223>注释的蛋白BAE71207
<400>47
Met Ser Trp Ser Arg Val Leu Lys Ser Ala Gln Ala Phe Ala Ala His
1 5 10 15
Thr Phe Leu Leu Cys Phe Thr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Asp His
20 25 30
Gln Ile Ser Ser Ser Trp Trp Ile Ile Phe Ser Pro Leu Trp Met Phe
35 40 45
His Gly Val Val Ala Arg Gly Arg Phe Ser Leu Pro Ala Pro Ser Ala
50 55 60
Pro Arg Asn Arg His Trp Ala Pro Cys His Ala Val Val Ala Met Pro
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ala Phe Glu Leu Leu Leu Cys Ile Tyr Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Tyr Val Arg Gly Phe Pro Ala Val Asp Leu Lys Ile Val Phe Leu Pro
100 105 110
Leu Leu Thr Phe Glu Val Ile Ile Leu Ile Asp Asn Phe Arg Met Cys
115 120 125
Lys Ala Leu Met Pro Gly Asp Glu Glu Arg Met Ser Asp Glu Ala Ile
130 135 140
Trp Glu Thr Leu Pro His Phe Trp Val Ala Ile Ser Met Val Phe Phe
145 150 155 160
Val Ala Ala Thr Val Phe Thr Leu Leu Lys Leu Ser Gly Ser Val Ala
165 170 175
Ser Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn Phe Thr Ile Ala Glu Cys
180 185 190
Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Lys Trp Ser Asn Pro Val Ile His Arg
195 200 205
Ser Ser Arg Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Leu
210 215 220
Asp Trp Asn Asn Gly Leu Leu Val Ser Ser Glu Glu Asp Gln Arg Gln
225 230 235 240
Ala Arg Ile Cys Thr Leu Gln Asp Ile Gly Gly His Phe Met Lys Val
245 250 255
Pro Ile Ile Val Phe Gln Val Leu Leu Cys Met His Leu Glu Gly Thr
260 265 270
Pro Ala Phe Ala Ala Gln Leu Pro Leu Ala Val Leu Phe Ser Pro Leu
275 280 285
Phe Val Leu Gln Gly Val Gly Val Ile Leu Ser Ala Ser Lys Phe Val
290 295 300
Glu Lys Leu Val Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Phe Arg Val Ser Ser Ile Ala His Asp Cys Leu Gly Phe Leu His His
325 330 335
Gly Ser Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser Ile Asp Glu Gly Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Gln Ala Arg Leu Tyr His Glu Gly Ala Ser Gly Tyr Asn Thr Phe
355 360 365
Ser Gly Tyr Pro Pro Glu Ile Val Lys Lys Met Pro Lys Arg Asp Leu
370 375 380
Ala Glu Glu Val Trp Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gly Glu Gln Thr Glu
385 390 395 400
Ile Thr Lys Tyr Ser Gln Gln Glu Tyr Glu Arg Leu Lys Asn Glu Lys
405 410 415
Val Leu Cys Arg Ile Cys Phe Glu Gly Glu Ile Ser Val Val Leu Leu
420 425 430
Pro Cys Arg His Arg Val Leu Cys Ser Leu Cys Ser Glu Lys Cys Lys
435 440 445
Met Cys Pro Ile Cys Arg Asn Tyr Ile Ala Glu Arg Leu Pro Val Tyr
450 455 460
Asp Val
465
<210>48
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(468)
<223>注释的蛋白NP_564945
<400>48
Met Leu Val Gln Arg Arg Val Met Ser Trp Arg Arg Val Trp Lys Ser
1 5 10 15
Phe Gln Ala Ala Ser Ala His Cys Leu Leu Phe Ser Phe Thr Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Leu Lys Leu Asp His Val Val Ser His Ser Trp Trp Phe Val
35 40 45
Phe Ala Pro Leu Trp Leu Phe His Ala Val Ile Ala Arg Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Leu Pro Ala Pro Ser Met Pro His Asp Arg His Trp Ala Pro Phe
65 70 75 80
His Ser Val Met Ala Thr Pro Leu Leu Val Ala Phe Glu Ile Leu Leu
85 90 95
Cys Val His Leu Glu Asp Lys Tyr Val Val Asp Leu Lys Ile Val Phe
100 105 110
Leu Pro Leu Leu Ala Phe Glu Val Ala Ile Leu Ile Asp Asn Val Arg
115 120 125
Met Cys Arg Thr Leu Met Pro Gly Asp Glu Glu Thr Met Ser Asp Glu
130 135 140
Ala Ile Trp Glu Thr Leu Pro His Phe Trp Val Ser Ile Ser Met Val
145 150 155 160
Phe Phe Ile Ala Ala Thr Thr Phe Thr Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp
165 170 175
Val Ala Ala Leu Gly Trp Trp Asp Leu Phe Ile Asn Phe Gly Ile Ala
180 185 190
Glu Cys Phe Ala Phe Leu Val Cys Thr Lys Trp Ser Asn Gln Ser Ile
195 200 205
His Arg Tyr Ser His Ile Pro Glu Pro Ser Ser Ser Ser Met Val Val
210 215 220
Arg Tyr Leu Asp Trp Asn Arg Gly Leu Val Val Thr Ala Asp Asp Glu
225 230 235 240
His Gln Gln Ser Asn Arg Ile Cys Gly Leu Gln Asp Ile Gly Gly His
245 250 255
Val Met Lys Ile Pro Phe Val Thr Phe Gln Ile Ile Leu Phe Met Arg
260 265 270
Leu Glu Gly Thr Pro Ala Ser Ala Lys Asn Ile Pro Ile Leu Val Leu
275 280 285
Phe Val Pro Leu Phe Leu Leu Gln Gly Ala Gly Val Leu Phe Ala Met
290 295 300
Tyr Arg Leu Val Glu Lys Ser Val Leu Leu Ile Asn Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ser Tyr Gly Arg Tyr Phe Thr Ala Thr Ser Ser Ala Arg Glu Phe Leu
325 330 335
Gly Phe Phe Gln His Gly Ala Arg Leu Leu Gly Trp Trp Ser Ile Asp
340 345 350
Glu Gly Ser Arg Glu Glu Gln Ala Arg Leu Tyr Ser Gly Glu Ala Thr
355 360 365
Gly Tyr Asn Thr Phe Ser Pro Glu Val Val Lys Lys Met Pro Lys Ser
370 375 380
Asp Leu Val Glu Glu Ile Trp Arg Leu Gln Ala Ala Leu Ser Glu Gln
385 390 395 400
Thr Asp Ile Thr Ser Tyr Ser Gln Gln Glu Tyr Glu Arg Leu Gln Asn
405 410 415
Glu Lys Ile Leu Cys Arg Val Cys Phe Glu Asp Pro Ile Asn Val Val
420 425 430
Leu Leu Pro Cys Arg His His Val Leu Cys Ser Thr Cys Cys Glu Lys
435 440 445
Cys Lys Lys Cys Pro Ile Cys Arg Val Leu Ile Glu Glu Arg Met Pro
450 455 460
Val Tyr Asp Val
465
<210>49
<211>497
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建物
<220>
<221>Misc_feature
<222>(1)...(497)
<223>注释的蛋白ABE90658
<400>49
Met Leu Val Arg Arg Arg Val Met Ser Trp Arg Arg Val Phe Lys Ser
1 5 10 15
Leu Gln Ala Met Leu Ala His Ala Phe Leu Phe Ser Phe Ser Leu Leu
20 25 30
Leu Val Leu Lys Leu Asp Arg Phe Phe Leu Phe Ser Trp Trp Thr Val
35 40 45
Phe Phe Pro Leu Trp Leu Phe His Val Val Ile Ala Arg Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Leu Pro Ala Pro Ser Met Pro His Gly Arg Gln Trp Ala Pro Cys
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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