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增强植物抗病性的方法

花匠小妙招
2024-10-05 01:45

专利名称：增强植物抗病性的方法
技术领域：
本发明涉及植物疾病的领域，更具体地，涉及提高植物对病原体的抗性(抗病性)，更具体地，涉及增强诱导抗病性机制。
背景技术：
当植物遭受病原体时，可防止感染的抗病性机制被激活，就有助于从疾病中恢复，并且甚至预防以后感染。抗病性的共同特征在于，其在响应首次初始遭受病原体或其进攻时被诱导。
近来，已经很清楚，当由与病原体衍生的激发子分子的相互作用而被激活时，植物的抗病性蛋白能够诱导信号转导途径。已经确定，一些相互作用至少部分地使用共同途径(Science，1997，278，1963～1965)。在该出版物中，已经证实需要NDR1位点用于对细菌性病原体丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的抗病性，并且通过真菌性病原体寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)加以诱导。同样地，Parker，J.E.等(The Plant Cell，1996，8，2033-2046)已经证实，在感染寄生霜霉菌后，由拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的EDS1位点编码的产物在信号转导途径中也具有关键作用，但是在感染丁香假单胞菌大豆致病变种(pseudomonas syringae pv glycinae)之后却并非如此。
许多不同的研究组将编码用于这种激发子传感物或受体分子的基因引入植物中，以使这些转化植物对病原体感染产生抗性。一般而言，这些激发子-受体仅能识别一种病原体，或者甚至是病原体物种的一种有毒菌株。此外，病原体对这种形式的选择压力可迅速和容易地适应，并且证实激发子分子的较小修饰足以使植物不能识别该病原体。尽管存在大量可能的传感分子，但是涉及传送信号的基因数量非常小，并且由进化保守性蛋白构成。
更广水平的识别和广谱抗病性反应是通过病原体分子的识别(感知，perception)来介导的，这些病原体分子储存在大量的病原体内。这种病原体-相关分子模式(PAMP)通过植物受体如鞭毛蛋白肽受体FLS2(Mol Cell.，2000，5，1003-1011)，或用于伸长因子Tu的受体(The Plant Cell，2004，16，3496-3507)加以识别。
通过激发子-受体传送的胞内警戒信号为基本抗病性操作提供了合适的靶(Trends in Genetics，2000，16，449-450)。在初始侵入部位的胞内信号转导级联(signaling cascade)是相同的，并且在大多数植物物种中是保守性的。在转基因植物中将该基本信号转导调节到更高水平(参见WO99/45129)，就会产生诱导的基本抗病性水平。
因此，初始防御信号的连续激活看起来是增加第一个防御屏障处的抗病性的选择策略。然而，由于涉及健康代价的原因，这种水平的抗病性的恒定过度刺激是不希望的(Trends in Plant Science，2002，7，61-67)。
通过在整个植物诱导抗病性(IR)反应的方法来提供第二个抗病性屏障(resistance barrier)。这种防御屏障对于抵抗病原体是必不可少的。其可大致分成两个不同的过程
(a)由初始感染部位释放警报信号并且在整个植物体系统传播这些信号。
(b)在不同器官中识别这些信号并激活诱导抗病性(IR)。
警报信号的识别和对激活的抗病性产生的下游加工是可以在各种警报信号之中不相同的过程。
水杨酸(SA)很久以来都被识别为主要的警报信号之一，其也起到涉及植物生长过程如衰老和生热的激素的作用(Plant Physiol.，1992，99，799-803；Science，1987，237，1601-1602；PNAS，1989，86，2214-2218)。在动物医学领域，水杨酸(及其衍生物)长期以来都是用于抗炎性诱导的发热。人体温度的升高可通过施用水杨酸来降低，其中水杨酸通过COX2(一种环加氧酶)来介导其作用。无论是动物系统(Journal of Endocrinology，2003，178，1-4)还是植物系统中，炎症和疾病抗性之间的关系都是通过COX2的活性来介导的。COX2在植物王国具有清楚的同源物(同系物)，如烟草中的Piox(The Plant Cell，1998，10，1523-1537)或胡椒粉中的pCa-COX1，在病原体入侵时，表达模式强烈和迅速地被诱导(J.Exp.Botany，2002，53，383-385)。这里，我们把这些环加氧酶同源物的植物同源物定义为水杨酸的识别分子(受体)。SA结合至环加氧酶导致其酶活性的修饰，这导致了最终导致形成植物体内抗病性的SA-介导的诱导胞内(脂质)过程中的变化。
涉及介导对植物抗病性的SA响应的另一种分子是SABP2。SABP2以高亲和力结合水杨酸(PNAS，2003，100，16101-16106)。由此，SABP2水解酶酶促活性被修饰，这导致了最终导致形成植物抗病性的SA-介导的诱导胞内脂质过程发生变化。最近已知，SABP2是一种甲基酯酶，其将MeSA修饰成激活SAR的SA，而SA抑制反馈环中的这个反应(PNAS，2005，102，1773-1778)。因此这种分子可能被错定义为受体。
油菜素类固醇受体BRI1(油菜素类固醇不敏感突变体1(BRassinosteroid Insensitive 1))是LRR(含有富亮氨酸重复基因)跨膜受体激酶(Cell，1997，90，929-938)。其属于拟南芥中的一个小家族，包括BRI1(At4g39400)；BRL1(At1g55610)，BRL2(At2g01950)和BRL3(At3g13380)(Development，2004，131，5341-5351)。BRI1及同源物不仅直接涉及类固醇识别(Nature 2005，433，167-171)，而且以高亲和力结合至系统素(来自拟南芥At2922940的前系统素同源物)，其中系统素为一种涉及抗病性反应(resistance response)的系统信号转导的肽激素(PNAS，2002，99，9090-9092)。用于植物类固醇信号转导的下游胞内途径已被描述(Bioassays，2001，23，1028-1036；Trends in Plant Science，2004，9，91-95)。
涉及油菜素类固醇识别的另一家族的受体由RKS(受体激酶类SERK)(Receptor Kinase-like SERK；Development，1997，124，2049-2062)基因产物所定义(WO 04/007712)。这些RKS基因产物也涉及介导植物中的油菜素类固醇信号转导，并且看起来与BRI1类受体(The Plant Cell，2004，16，3216-3229；Cell，2002，110，213-222；Cell，2002，110，203-212)形成复合物。它们也涉及结合胞外肽配体，其用候选肽配体如14拟南芥GASA(赤霉酸激活的拟南芥)(Gibberelic Acid Stimulated Arabidopsis；Plant Mol Biol.，1995，27，743-752)基因产物表示，该基因产物已被假定直接结合至14拟南芥RKS基因产物(WO 04/007712)。GASA蛋白在其结构中含有一个袋，其被假定为以高亲和力结合至油菜素类固醇。因而，GASA肽配体充当RKS/BRI-二聚体和油菜素类固醇分子之间的中间物。RKS和其他受体如BRI1之间的二聚复合物是一种动态质膜复合物，其中不同家族成员都可作为二聚分子伴侣参与(参见图1)。
这些种类的受体激酶的活性调节是通过肽配体和类固醇激素来调节的。植物油菜素类固醇可以以不同形式获得(描述于J.Exp.Botany，1999，50，275-282；The Plant Cell，2002，S97-S110；PlantPhysiol，2003，131，287-297)。除了这些，许多合成的激动剂和拮抗剂(Trends in Plant Science，1999，4，348-353)也可用来调节这些受体的活性。
在上述蛋白质受体复合物中，ELS蛋白(WO 04/007712)也涉及油菜素类固醇的识别和信号的传递，因而涉及介导整个植物抗病性反应。LRP(拟南芥ELS基因产物的番茄同源物)是特异性诱导的，并且令人惊讶的是在致病期间也经过了蛋白水解处理(MoI.Gen.Genet.，1994，243，47-53；Plant J.，1996，10，315-330)。因此，ELS蛋白产物明显地涉及抗病性反应，并且可能在抗病性的油菜素类固醇调节的调节中起作用。
也已知通过茉莉酮酸(JA)和大量衍生物分子介导的茉莉酮酸酯(Jasmonate)信号转导在植物抗病性以及生长过程如果实成熟、衰老和胚芽与花粉发育中起重要作用(The Plant Cell，2002，14，S153-S164)。JA通过F-Box蛋白如COI1的作用而涉及介导泛素化途径。JA的识别可通过诸如由JAI-1位点(PNAS，2002，99，6416-6422)或仍待鉴定的受体编码的基因产物所介导。
植物已经在整个植物中形成了激活系统免疫机制的复杂过程。在许多方面，这种二次防御屏障比得上人体内的接种疫苗响应，并且重复部分取决于在植物和动物之间的进化过程中保持保守性的相似基因产物和信号转导途径(EMBO reports，2005，6，504-507)。植物中的系统抗病性反应可大致分成系统获得的抗病性(SAR)和诱导的系统抗病性(ISR)(Curr Opin Plant Biol.，2004，7，456-464)。尽管这些不同模式的抗病性在抵抗宽范围病原体时每一个都有效，但是其在这个阶段对于不同种类的病原体的响应具有或多或少的特异性(MoI Plant Microbe Interact.，2002，15，27-34)。针对抗细菌或病毒的广谱抗病性反应并不一定导致产生抗例如线虫(nematode)或蚜虫(aphid)诱导水平的抗病性。除此之外，每一个信号转导级联通过不同信号转导分子来诱导和传递(Trends in Genetics，2000，16，449-455)。
一般地，这些植物产生的信号的系统传输导致长期有效的广谱抗病性的系统诱导。然而，植物信号一起的特异性组合确定了所获得的持久系统响应的特异性。部分响应已经通过一种信号转导化学物质的存在而被启动；其他的则对不同化学物质完全具有重复要求。所述信号化合物的实例是水杨酸、茉莉酮酸、乙烯(NatureBiotechn.，2000，18，779-783)和油菜素类固醇(WO04/007712)。如上所述，已知肽因子如系统素和GASA干扰油菜素类固醇信号识别。从植物外部的人工施用，例如通过喷洒这些特异性信号转导分子，能够激活植物中所需的诱导抗病性反应。在喷洒的溶液中，各种系统植物信号的浓度和组成的调节使得可以对系统抗病性的获得加以调节。
这些系统信号通过植物各部分中的细胞和器官所识别，其不直接涉及感染过程。这种识别通过系统信号分子各自的特异性受体来完成。
田间条件下的庄稼作物的(单)培养物中，对抗病性水平的控制是一方面的生产农主与另一方面的各种天然病原体之间的持续斗争。植物自身经常包括以高产率水平近交的无性繁殖变种，而其基因组构成一般并不为了最佳抗病性而进行优化。可用于保护生长植物或随后保护收获的农作物的主要手段包括施用生物杀灭剂如抗真菌剂、杀菌剂和杀虫剂。目前与这些化学品相关的环境问题的理解已经导致禁用许多可以利用的化学品，这使农主没有可利用的用于控制病虫害的可替换方案。目前针对抗病性进行的许多典型繁殖策略需要花费很多年时间才能生产出供商业使用的新的有价值的杂交种和栽培变种。然而，在最近几十年中，已通过遗传工程，例如通过用过敏性反应的组分和信号分子的中间物来转化植物进行了各种努力，以增大抗病性(Transgenic Res.，2002，11，599-613)。迄今为止，大多数这些转基因替换方法还未实现商业化。
其中农主利用植物的天然免疫机制的一种方法是通过给予信号转导化合物如水杨酸来启动免疫响应。这些信号转导化合物可在所述环境(土壤添加剂、喷洒、喷粉等)中施加。然而，该方法的缺点在于，所述信号转导化合物在需要以高剂量施加以补偿喷洒损失和植物吸收期间的损失而至少以它们必须用来诱导ISR的浓度时，所述化合物是至少部分有毒的和/或环境不友好的。利用植物自有的系统(手段)，提供了一种通过植物自身增加所述信号转导化合物的内源性生产的可替换方案。因此，调节活性信号转导化合物(如SA、油菜素类固醇等)水平的基因在可诱导/组织特异性或阶段特异性启动子的控制下被表达在转基因植物自身内。这些基因产物的稳定态水平的调节接着调节活性信号转导化合物的水平。这样的基因产物的实例是涉及切割前系统素肽的蛋白酶，或DWARF4基因产物(Plant Journal 26 2001 573-582)。后一种方法的特别缺点在于整个植物都被诱导，这经常是不必要的并且降低植物的整体健康(和产量)。因此，仍然需要用于增强植物抗病性的可替换方案，其尽可能少地干扰植物的健康和产量特性。

发明内容
现在，本发明提供了一种用于增强植物病原体抗性的方法，通过给这些植物提供包含编码用于系统信号化合物的受体的DNA序列的基因构建体，其中该系统信号化合物是水杨酸、茉莉酮酸和油菜素类固醇组成的组中的一种或多种。更具体地，该受体选自茉莉酮酸受体、水杨酸受体和RKS受体。
植物对诱导抗病性的敏感性增强是通过相应于上述受体中的一种或多种而增加受体分子数(每个细胞/器官)来实现的。
识别的增强可以通过增加警戒信号受体的数量以及通过增加这些警戒信号自身的(局部)浓度来进行。这可通过施加或通过这些信号如SA或油菜素类固醇的(局部)内源性生产得以实施。
通过以下方法形成了一特定具体实施方式
，其中编码受体的DNA序列受组织特异性启动子(如在果实、幼苗或花中特异性表达的启动子)或可诱导启动子如病原体可诱导启动子、去污剂可诱导启动子(TWEEN20；Hunzicker，G.M.，et al.(2004)Proceedings forthe 4th International Crop Science Congress，Brisbane，Australia，26September-1 October 2004)、热休克可诱导启动子(Biochem BiophysRes Commun.，200，321，364-369)、类固醇可诱导启动子(或者动物类固醇(例如，Plant J.，2005，41，899-918)或者植物类固醇(例如，At2g14560的启动子))、基于四环素-阻遏物的启动子系统(Plant J.，2000，21，579-588)等的控制。
通过以下方法形成了另一个特定的具体实施方式
，其中，编码受体的DNA序列是嵌合性的，其中嵌合性的是指上述受体的配体识别部分已被另一受体(如选自上述受体、类固醇受体、PAMP受体、甾醇、肽或用于其它涉及系统抗病性反应的可扩散分子的受体的不同信号化合物识别受体)的配体识别部分所取代。
根据本发明的方法生产的植物也是本发明的一部分。这样的植物的一个特定具体实施方式
是其中引入了两种或多种(可以是或可以不是嵌合性的)受体的植物。本发明的另一部分是由所述植物的后代生产的近交植物变种，其中所述变种仍含有对于诱导抗病性提高了的敏感性。类似结果也可通过组合涉及相同途径的不同过表达构建体而获得，如编码受体的构建体结合编码下游靶分子(如转录因子)的构建体。
本发明的另一具体实施方式
是在根据本发明的植物或变种中诱导抗病性的方法，包括向所述植物或变种施用一种配体分子，其能够结合并刺激该植物或变种被提供有的异源或嵌合受体。所述施用优选包括喷洒所述分子。

图1提出的关于抗病性的BRI/RKS介导的信号转导模式。
与RKS受体相互作用的蛋白质用黑灰色示出。BRL代表BRI1类和可以与RKS进行杂二聚的其他RLK(诸如激酶的受体)。NHL(NDR1/HIN1类)和SPL(鳞状骨结合蛋白类(Squamosa-bindingProtein-Like))对应于与RKS相互作用的这两个家族的成员。上游和下游组分以浅灰色表示。
图2油菜素类固醇增强对寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)的抗病性。
给9-天龄的拟南芥幼苗、生态型Columbia(Col-0)或Wassilewskija(WS-0)用mock-Silwet L-77(0.01％)(MQ＝水+Silwet)或0.05mM油菜素类固醇(+0.01％Silwet L-77＝Bras)进行喷洒。干燥后，将该植物在长日照生长室(MPMI 2005，18，583-592)中培育。两天后，将植物的一半用Waco9(50孢子/μL；European journal ofPlant Pathology，2001，107，63-68)在其叶上喷洒。接种7天后，对植物(40幼苗/株系(line))的孢子形成进行计分。将mock用作对照。如前所述进行实验感染和分析(MPMI 2005，18，583-592)。这表明，在喷洒mock和油菜素类固醇混合物后2天，用油菜素类固醇喷洒的所述植物伸长了，但是六天后它们看起来几乎与仅用0.01％Silwett-L77水溶液处理的mock一样(仅仅稍微长得更长)。而且，部分子叶已经发生混乱。用油菜素类固醇喷洒的CoI-0和Ws-0植物与所述mock对照相比，表现出较少的Waco9的孢子形成。
图3RKS4受体涉及油菜素类固醇识别。
A.当对在垂直盘上9天后的Ws-0(WT)、RKS4-OX1和RKS10(BAK1，Cell，2002，110，213-222)过表达(RKS10-OX)幼苗测定时，24-表油菜素内酯(epibrassinolide，EBL)浓度对根生长的影响。B.在0.1nM EBL的根长度。每个正方形为1cm2。C.高EBL浓度对RKS4 KO(剔除型)株系的根生长的影响(详细情况参见图4A)。D.在10nM EBL的根长度。每个正方形为1cm2。
图4在剔除型和过表达幼苗中的RKS4 mRNA水平。
A.RKS4基因上的T-DNA插入部位。B.在来自野生型(Ws-0和Col-0)、过表达株系(RKS4-OX)和两个T-DNA插入株系(rks4-1和rks4-2)的10天龄幼苗中，RKS4全长信使的RT-PCR分析。没有包括模板对照，在组成型泛素基因(Ubi)上评估等量的cDNA模板。相对于不同的T-DNA整合部位，指出了在RT-PCR反应中使用的不同寡核苷酸的位置。
图5RKS4调节对丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000和寄生霜霉菌的抗病性。
A.RKS4(RKS4-OX1)的过表达表明了对丁香假单胞菌的抗病性的诱导水平。这通过在Y轴上的疾病指数来表示。所获得的数据外推表明，RKS4的剔除型株系也涉及介导抗病性反应。抗病性分析如先前描述(Plant Cell 1996，8，1225-1237；Plant cell 1998，10，1571-1580)进行。B.尽管低于用β-氨基丁酸(BABA)诱导的阳性对照，但是RKS4的KO(rks4-1；提高N-末端的表达，参见图4)也增强了对寄生霜霉菌的抗病性。植物用任意标度I-IV进行计分，其中I是指正常至极轻微的症状而IV是指严重症状至死亡。C.在相同植物中证实胼胝质沉积(Callose deposition)，其表明一旦用BABA处理，胼胝质沉积就在rks4-1植物中增加，表明由变化的RKS4水平介导的增强的抗病性包括增强的胼胝质沉积。两个测试都是如在(Plant Cell.，2005，17，987-999)中描述的那样实施。
图6在RKS4过表达背景中的抗病性标记基因的表达分析。
这在来自Ws-0、35S::RKS4和35S::RKS10的10天龄幼苗分离的RNA上，利用用于拟芥南病原体-可诱导基因(SIGMA)的引物文库，通过定量RT-PCR(qRT-PCR)来实施。在用肌动蛋白(Actin)(文库的对照引物)标准化和将野生型用作参照之后，倍数诱导(fold induction)对应于表达变化(2-ΔΔCt值)中3次重复的平均值。误差棒对应于各次重复之间的标准偏差。A.RLK1＝At5g60900，WAK1＝Atlg21250，HEL(橡胶蛋白类蛋白(hevein-like protein))＝PR4＝At3g04720以及WRKY70＝At3g56400。B.ZAT7(C2H2锌指蛋白(zing finger protein))＝At3g46090并且该肽由At2g32200编码。结果表明，RKS4过表达诱导了特异性防御相关基因的表达，证实了其涉及抗病性。
图7通过改变的RKS4表达诱导的形态表型在画面(b)，(e)，(f)和(g)上示出的柱状图是基于在具有RKS4改变表达的植物上进行的测定结果，并且描述了与相应野生型(对于rks4-1和rks4-2的Col-0；对于RKS4-OX1和RKS4-OX2的Ws-0)相关变化(用百分数表示)。所观察到的差异的统计显著性通过t检验进行分析，并且*表示所测定的差异不是统计显著性的(即，p-值＞0.05)。
(a)相对于野生型Ws-0(WT)，由于RKS4过表达(RKS4-OX1)而增大的花大小(比例尺＝1mm)。
(b)RKS4过表达对花瓣和花瓣表皮细胞大小的影响。细胞/花瓣的数目通过将花瓣表面积的平均值除以细胞表面积的平均值而获得。
(c)RKS4-OX1植物的莲座丛(rosette)中改变的叶形状(比例尺为cm)。
(d)RKS4-OX1和WT植物中莲座丛形状和大小的概观(比例尺为cm)。
(e)基于子叶的表面积及其栅状叶肉细胞的表面积的测量值，RKS4改变的表达对子叶大小的影响。每个子叶的细胞数通过将子叶平均表面积除以叶肉细胞的平均表面积而获得。
(f)改变的RKS4表达对种子产量的影响，通过种子长度和重量测量值确定。
(g)当对在垂直盘上生长的9天龄的幼苗进行测定时，RKS4改变的表达对根长度的影响。
(h-i)由RKS4的过表达导致的根尖分裂活性的变化。(h)从左到右在仅含有pCDG构建体(Colón-Carmona，A.，You，R.，Haimovitch-GaI，T.and Peter Doerner，O.(1999)Spatio-temporalanalysis of mitotic activity with a labile cyclin-GUS fusion protein.Plant J.20，503-508)的7天龄的幼苗的根尖种的GUS阳性/分裂细胞；在来自RKS4-OX1和pCDG之间杂交的7-天龄F1幼苗的根尖中的分裂细胞减少的数目；来自RKS4-OX2和pCDG之间杂交的7-天龄F1幼苗的根尖(比例尺＝50μm)。(i)在主根中每个根尖的GUS阳性细胞的平均数的柱状图(用误差棒表示标准偏差)。
图8改变的RKS4表达增加鲜重。
Ws-0、Col-0、pGREEN 4K (空白载体对照)和35S::RKS 10用作对照。如图所示，同样在过表达和在KO株系中鲜重增加，这与图7中的数据是一致的。因此，RKS4水平的调节增强抗病性后，也提高植物健康(生长)特性。
图9改变的RKS4表达水平对At2gl4560和PR1标记基因的表达的影响。
A.报道基因At2gl4560(用于油菜素类固醇诱导和NPR-1介导的抗病性激活的标记物)的qRT-PCR分析。RKS4-OX1(RKS4S 6)和rks4-1(ko566568)都表现出该报道子的mRNA水平的增加，表明了RKS4的N-末端片段(如图4所示)在调节RKS4信号转导介导的基因表达中的作用。RKS4-OX2(RKS4S 22)、RKS4(RKS4a 12)的剔除和RKS4(rks4-2＝ko571166)的剔除都导致了该标记基因的水平降低。B.报道基因PR-1＝At2gl4610(用于SAR诱导和NPR-1介导的抗病性激活的的标记物)的qRT-PCR分析。At2gl4560和PR-1在拟南芥基因组上的位置相互靠近，并且在该位点中的这些和其它基因(如At2gl4620，一种木葡聚糖(xyloglucan)木葡聚糖糖基(xyloglucosyl)转移酶)受调节抗病性的转录激活的直接控制。rks4-1(ko566568)表现出PR-1报道子的mRNA水平的显著增长，如图4所示，表明了RKS4的N-末端片段在调节RKS4信号转导介导的基因表达中的作用。RKS4-OX2(RKS4S 22)和RKS4(RKS4a12)的剔除导致了该报道标记基因产物的水平降低。这些数据表明，受体mRNA的水平决定了下游靶基因产物的响应。
图10油菜素类固醇连同RKS4过表达对At2g14560标记基因表达的影响。
在喷洒油菜素类固醇混合物(brassinomix)(油菜素类固醇的稀原液，0.05或0.01mM(分别是1∶1000或1∶5000稀释的)，混合有Silwett L-77(最终浓度0.01％)或0.01％的Silwett L-77的mock溶液)之后，At2gl4560mRNA水平通过qRT-PCR进行检测。与野生型WS对照相比，这表现出了在RKS4-OX1株系(RKS4S 6)中的油菜素类固醇响应的幅度上非常显著的增长。这种增长在喷洒油菜素类固醇之后3小时就已经检测到。该时间对于间接激活响应而言太短。因此，介导RKS的信号转导通过该油菜素类固醇和激活NPR-1的报道基因对转录激活具有直接作用。在野生型和转化植物中，在时间点t＝0(刚好在喷洒之前)，At2gl4560的mRNA水平被用作图中的基线。对于每一个实验，处理和收获3个植物。将原料进行混合用于mRNA分离。Q-PCR实验进行三次，并指定标准误差。
有意义的是，在RKS4-OX1植物中的最佳油菜素类固醇浓度是最大稀释的浓度(0.01mM)，这证实了过多油菜素类固醇不再具有刺激作用。因此，受体水平和油菜素类固醇水平一起决定植物的最终响应。
具体实施例方式
本发明的原理是增加植物对诱导抗病性的敏感性。如在背景部分中所讨论的，诱导抗病性是由植物对病原体攻击的最初反应所引起的，该攻击随后导致系统信号转导化合物如水杨酸、茉莉酮酸和油菜素类固醇的扩散。这些化合物由植物细胞中的特异性受体所识别。本发明人目前已经发现，用于这些信号转导化合物的受体的量是一个限制抗病性途径中的因素。因此，增加每个细胞或组织的受体数目将能够对循环系统和/或外部施加的信号转导化合物产生更强的响应。这种增强优选通过具有核苷酸构建体的植物细胞的转化来实施，其中核苷酸构建体包含用于这样的受体分子的编码序列。
BRI/RKS二聚跨膜蛋白质复合物(参见图1)涉及发育过程(ThePlant Cell，2004，16，3216-3229；Cell，2002，110，213-222；Cell，2002，110，203-212)，以及涉及通过油菜素类固醇的识别的抗病性调节(Plant Journal，2003，33，887-898；以及由本发明人获得的数据，例如图2和图5)。扩散性系统素肽和可能的GASA配体的识别也涉及通过这种膜相关的蛋白复合物来介导抗病性反应。因此，在该复合物中(图1)，杂二聚蛋白分子伴侣介导各种过程，如抗病性、生长和花器官发育。
令人惊讶地，本发明人已经证实，BRI1-受体的过表达不会增强植物的抗病性(病原体抗性)，而RKS-受体的过表达具有显著的作用(参见实验部分)。这表明，只要考虑的是涉及病原体抗病性途径，则RKS受体看起来是一个限制因素。
这就使其成为一个重要的受体组，其非常适合用于本发明中。这些受体的识别机制与动物系统中通过类固醇控制的炎性响应机制类似。其中，糖皮质激素的施用减少了对病原体入侵的初始响应(primary response)。该过程是通过降低炎性响应的若干关键调节子(如COX2)的mRNA稳定性来调节的。此外，这些类固醇调节若干跨膜TOLL类受体复合物如IL-1的活性(J.Endocrinology，2003，178，1-4)。植物中的TOLL类受体的同源物是通过LRR受体激酶的亚类表示的，其它之中都含有涉及植物类固醇信号转导的BRI1和RKS同源物。通过植物类固醇信号转导调节的途径之一是胞内MAP激酶途径(FEBS Lett.，2001，2，346-50)，其在动物系统中是一个通过糖皮质激素抑制的靶(Curr Opin Pharmacol.，2003，3，404-11)。由这些数据可以导出这样的假设植物类固醇信号转导和SA信号转导相互之间表现出广泛的串扰(cross-talk)，并且它们通过如同动物系统的类似途径和基因产物来介导这种相互作用。这些信号转导化合物中的每一个本身就能够调节抗病性反应，因此，它们利用部分重复的胞内过程。
现在已经证实，这样的受体的过表达在植物中能诱导更高水平的抗病性。这的确是一个高水平，因为其看起来已经存在一个内源(低)水平的信号转导化合物，其能够刺激该受体，如上面所讨论的，该受体形成级联运行，然后产生一个(低)水平的诱导抗病性。这是特别有利的，因为这已经提供了一定水平的抗病性，而勿需另外施加信号转导化合物。而且，这也导致下游级联的敏感性增加，使得有可能利用配体，该配体可刺激用于增加抗病性水平的下游级联的化合物。尤其是，这些配体可选自由SPL、At4gl4400、At4g23130、NPR1、At29l4610、At2gl4560以及其它是下游级联的一部分的蛋白质组成的组。由于已证实在油菜素类固醇抗病性级联与例如SA抗病性级联之间存在串扰，所以有可能的是，应用其他因素(如植物类固醇、来自病原体或其片段的激发子、SA、JA和具有信号转导功能的胞外肽如GASA或系统素或这些肽的片段)也可用于增强激活的级联。因此，就有可能用在下游级联上起作用的配体代替信号分子，该信号分子在某些条件(例如，因为毒性、环境问题等)下可能不希望被利用。
已经进一步发现，用于增强抗病性的受体的过表达必定是最佳的。很明显，过多受体会对下游级联产生过度刺激，表明这是通过抑制机制自动调节的(参见图4和图7)。因此，如果给植物提供编码用于信号转导化合物的受体的遗传构建体，则应该注意不要选择最高的表达子，而要对最佳抗病性参数进行测试。对于本领域的技术人员来说是容易可行的这种测试将在本文后面进行描述。基本地，有若干方法来确定最佳抗病性，如1)进行抗病性测定，如ATTA测定(Cell，1996，87，1307-1316)；以及2)确定标记基因，如PR-1或At2gl4560(在NPR1的直接转录控制下的基因，受SA和油菜素类固醇施加的强烈诱导(Plant Physiology 2005，137，1147-1159；Science 2005，308，1036-1040))或At3946090(ZAT7)或At2932200的量(也参见图9和图10)。使用在植物中的过表达之后具有在RKS4或其他RKS受体的修饰表达的基因作为标记物(如以上方法2)所指明的)的可能性，就提供了设计通过喷洒用于转基因或非转基因植物的优化启动的测定的可能性。
在RKS受体中，RKS1，RKS4，RKS7，RKS11和RKS14是最优选的受体(参见例如WO 04/007712)。这些受体和其各自的编码序列的大多数都已从拟南芥中分离出来。然而，来自其他植物的直向同源受体和这些受体的编码序列(其还没被分离出来)也可被使用。认为这些编码序列与在上述文献中公开的序列是同源的。因此，原则上任何核苷酸序列(其与所述序列同源并编码至少起到系统信号化合物受体的作用的蛋白)都是有用的。这些核苷酸序列可从表达直向同源受体的植物中分离出来，然而，这些核苷酸序列也可通过修饰已有的核苷酸而形成，然后其将编码已知受体的突变蛋白质。
本发明的受体的突变蛋白质是从已知的受体中通过取代、插入和/或缺失一个或多个氨基酸、同时仍保留其作为系统信号转导化合物的受体的功能而获得。这样的突变蛋白质可通过蛋白质改造，例如通过改变能够编码该蛋白的开放阅读框以便由此影响该氨基酸序列而很容易地制成。只要在所述氨基酸序列中的改变并不完全消除该蛋白质的活性，则这样的突变蛋白质就被涵盖在本发明之中。另外，应该理解到，突变蛋白质应该可以衍生自已知的受体，同时保持生物学活性，即所有或大部分的在该突变蛋白质和序列表中描述的蛋白质之间的中间物应能够通过系统信号转导化合物来诱导。大部分是指中间物的30％或更多，优选40％或更多，更优选50％或更多，更优选60％或更多，更优选70％或更多，更优选80％或更多，更优选90％或更多，更优选95％或更多，更优选99％或更多。
因此，本发明的另一部分是至少70％与已知蛋白相同的受体，但是更优选超过80％与上述的已知受体相同，更优选超过90％相同，更优选超过95％相同。为了计算百分数同一性，可以利用使用缺省参数的BLAST算法(Nucl.Acids Res.，1997，25，3389-3402)或可替换地GAP算法(J.MoI.Biol.，1970，48，443-453)，使用缺省参数，这两种算法都包括在Wisconsin遗传学软件包(GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science，Madison，Wisconsin，USA)中。BLAST搜索假定，蛋白质可模式化为随机序列。然而，许多真正的蛋白包含非随机序列的区，其可以是均聚段、短期重复或富含一种或多种氨基酸的区。即使蛋白质的其他区是完全不同的，这样的低复杂性区可以在不相关蛋白质之间进行比对。许多低复杂性过滤程序都可用于降低这样的低复杂性比对。例如，SEG(Comput.Chem.，1993，17，149-163)和XNU(Comput.Chem.，1993，17，191-201)低-复杂性过滤器可单独使用或组合使用。
如本文所使用的，上下文中的两个蛋白质序列(或核苷酸序列)的“序列同一性”或“等同性”或“同源性”包括在所述两个序列中的氨基酸残基的基准物，该两个序列如果在特定对比窗口内进行最大对应性比对时是相同的。当序列同一性的百分数根据蛋白质来使用时，应该理解，不相同的残基位置经常通过保守性氨基酸取代而不同，其中氨基酸被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基所取代，因此不改变该分子的功能特性。当序列不同于保守性取代物时，百分数序列同一性可以加以上调，以校正取代物的保守性。通过这种保守性取代而不同的序列就是所述的具有“序列相似性”或“类似性”。形成这些调节的方法对于本领域的技术任员而言是熟知的。典型地，这涉及将保守性取代计分为部分而不是完全错配，由此提高了百分数序列同一性。因此，例如，当一个相同氨基酸被给分为1而非保守性取代物被给分为0时，则保守性取代物就被给分为0～1之间的一个分值。保守性取代物的计分是例如根据Meyers和Miller算法(Computer Applic.Biol.Sci.，1998，4，11-17)进行计算的。
如本文所使用的，“序列同一性的百分数”是指通过在对比窗口中比较两个最佳比对序列而确定的值，其中当与用于该两个序列的最佳比对的基准序列进行比较时，在所述比较窗口中的氨基酸序列或核苷酸序列的部分可以包括插入或缺失(即，间隙)。该百分数这样计算的通过确定在两个序列中出现相同氨基酸或核苷酸碱性残基的位置数而得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100而得到序列同一性的百分数。
一般而言，并不是蛋白质的所有氨基酸和核苷酸序列的所有核苷酸都是良好等同可互换的。在多数情况下，蛋白质具有一个或多个对于功能是重要或关键的区。对于本发明的RKS受体，通过比对序列(这可以在WO 04/007712中找到)和确定所谓的共有序列(即具有相同功能的同源序列之间是良好保守的蛋白质的部分)而很容易确定较少的可变区。当试图设计RKS受体的变体(或突变蛋白质)时，这些共有序列应优选保持完整，而其他区可以发生更多的变化。在RKS受体的组中，最优选的是RKS1、RKS4、RKS7、RKS11和RKS14。该亚组共享特异性共有序列。
要提及的非常重要的是，部分受体例如仅仅(其中的部分)胞外结构域或仅仅胞内结构域或其片段能够作为杂二聚受体蛋白复合物中的组成型活性化合物。结果表明，RKS4的N-末端部分(胞外结构域)通过增加器官大小和鲜重(图7和图8)可用作关于抗病性(参见图5)和可能如所示也关于植物健康的油菜素类固醇响应的组成型激活子。
在本发明中，当提及RKS受体的N-末端部分时，就是指所述RKS受体的胞外结构域。本领域的技术人员将会理解胞外结构域是指该受体的哪一部分。此外，在WO 04/007712中也已经指出了RKS受体的胞外结构域。
通过嵌合受体形成了本发明的另一个具体实施方式
，其中上面提及的受体的配体结合部分被另一受体(如识别受体或例如类固醇受体的不同信号化合物)的配体结合部分所取代。这样，就有可能如上所述通过一个相同的信号分子或配体诱导不同的IR途径，该IR途径通过不同的受体启动。这也能够将更廉价和更易得到的化合物用于诱导IR响应。例如，一个实例是用水杨酸受体的SA-结合部分取代RKS受体的配体结合部分。在用天然水杨酸受体和嵌合RKS受体进行植物转化后，水杨酸的施加就会启动水杨酸诱导响应和油菜素类固醇诱导响应。然而，也有可能使用并不涉及病原体抗性的受体的配体结合部分和配体。例如，也有可能用另一个不相关的LRR-受体激酶如ERECTA(Plant CeU，1996，8，735-746)的配体结合部分取代任何上述受体的配体结合部分。
核苷酸序列需要在其转化的植物中进行表达。为此，需要包含可表达核苷酸序列的遗传构建体(表达盒(expression casstette))。核苷酸的表达取决于含于这样的构建体中的操作元件，如启动子、终止子和增强元件。
术语“启动子”是指在启动子功能性地连接至其以允许转录可以发生的DNA的转录之前，RNA聚合酶和/或其它转录起始因子结合的短DNA序列。启动子通常位于编码序列的上游(5′)。在其较宽的范围内，术语“启动子”包括RNA聚合酶结合部位，以及位于离转录开始部位几百个碱基对(偶尔甚至更远)种的调节序列元件。这样的调节序列是例如涉及蛋白质因子结合的序列，其中蛋白质因子控制响应于生理状况的转录起动的有效性。启动子区应该在宿主细胞中是功能性的，并优选对应于受体蛋白的天然启动子区。然而，任何异源启动子区都能使用，只要其在需要表达的宿主细胞内是功能性的。异源启动子可以是组成型的、组织的或发育特异性的或可调节的。组成型启动子如CaMV 35S启动子或T-DNA启动子(其对于本领域的技术人员来说都是熟知的)是这样的启动子，其大致不进行调节如诱导或阻遏，但只要满足发生转录的其他必要条件，其就允许在生物的所有或大多数活性细胞内，其功能性结合的DNA序列可以是稳定和大致无变化的转录。组织特异性启动子是这样的启动子，其将编码序列的表达限制在植物的有限部分，即特定组织和/或特定细胞型。经常使用的组织特异性启动子是Rubisco启动子(其对于植物的绿色部分是特异性的)。可调节或可诱导启动子是其功能受一种或多种因子(或者内部存在或者外部添加的)调节的启动子(Trends in biotechnology 2005，23，283-290)。在没有诱导子的情况下，DNA序列将或者不被转录或者以相对于存在诱导物时的转录水平更低的水平被转录。在某些情况下，一个因子可能特异性地结合至可诱导的启动子以激活转录，所述因子以惰性形式和可通过诱导物转换成(直接地或间接地)活性形式而存在。诱导物可以是化学/生物化学试剂，如蛋白质、代谢产物(糖、醇等)、生长调节剂、除草剂或酚类化合物。可替换地，诱导物可以是直接施加的生理应力(例如，热、盐、损伤、有毒成分等)或间接施加的生理应力(例如，病原体或致病剂如病毒的作用)。通过外部将诱导物施加至细胞，如通过喷洒、浇水、加热或类似的方法，可以将含有可诱导启动子的植物细胞暴露于诱导物。可诱导启动子的实例包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的可诱导70kD热休克启动子(Ann.Rev.Genet.，1985，19，297-323)和通过乙醇诱导的醇脱氢酶启动子(Nagao，R.T.et al.，inMiflin，B.J.(ed.)Oxford Surveys ofPlant Molecular and Cell Biology，Vol.3.，pp.384-438，Oxford Univ.Press，1986)。可以通过简单的化学物质诱导的启动子的实例描述于Gurr和Rushton的(Trends in biotechnology 2005，23，283-290)、WO90/08826，WO 93/21334，WO 93/031294和WO 96/37609中。
终止子是DNA的短片段，用于终止DNA向RNA的转录，并优选选自由本领域技术人员熟知的植物转录终止子序列、细菌转录终止子序列和植物病毒终止子序列组成的组。
增强元件(如35S增强子)和其他元件如支架结构连接区(SAR)也可用来增强本发明的基因的表达。有可能通过在开放阅读框中引入内含子(例如Adh-内含子)来促进表达或使用病毒增强子序列。
术语“基因”用于表示DNA序列，其涉及形成多肽链，并包括在编码区(5′-上游和3′-下游序列)前后的区以及间插序列(所谓的内含子)，其被置于单个编码片段(所谓的外显子)之间或在5′-上游和3′-下游区中。5′-上游区可以包含控制该基因表达的调节序列，通常为启动子。3′-下游区可以包含涉及终止该基因转录的序列和可选的负责转录和3′未翻译区的聚腺苷化的序列。
在真核细胞中，表达盒通常另外包含位于开放阅读框下游的转录终止区，允许转录可以终止和初始转录的聚腺苷化可以发生。另外，密码子的用途可以适合选择的宿主已接受的密码子用途。在所选宿主细胞中控制DNA构建体表达的原理对本领域的普通技术人员来说都是通常理解的，而可表达DNA构建体的构造可以是目前用于任何分选宿主细胞(可以是原核或真核的)的路线。
为了在宿主细胞中保持开放阅读框，通常以连接至DNA的包含根据本发明的开放阅读框的复制子形式提供，其被所选择的宿主细胞识别并复制。因此，复制子的选择主要是由所选择的宿主细胞决定。作为控制选择用于具体选择的宿主的合适复制子的这种原理，很好地属于本领域的普通技术人员的能力范围。
特定类型的复制子是一种能够将其本身或其部分递送至另一宿主细胞如植物细胞的一种，由此将根据本发明的开放阅读框一同递送至植物细胞。具有这种能力的复制子在本文称为载体。这种载体的实例是Ti-质粒载体，当存在于合适的宿主如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中时，其能够将其自身的部分(所谓的T-区)递送至植物细胞。不同类型的Ti-质粒载体(参见EP 0 116718 B1)现在常规用于将DNA序列递送到植物细胞或原生质体(基因组中稳定地合并了所述DNA的新的植物可从其产生)中。Ti-质粒载体的一种特别优选的形式是所谓的双元载体(binary vector)(如EP 0 120 516 B1和US 4,940,838中要求保护的)。其他可用于将根据本发明的DNA引入植物宿主中的合适载体可以选自病毒载体，例如非整合型植物病毒载体，如可来源于双链植物病毒(例如CaMV)和单链病毒，双生病毒等。这样的载体的使用是有利的，特别是当难以稳定转化植物宿主时。这可以是木质物种的情况，尤其是树和藤本植物的情况。
短语“在其基因组中整合了根据本发明的DNA序列的宿主细胞”是指包含细胞，以及包含这样的细胞或基本上由这样的细胞构成的多细胞生物体，其稳定地将所述DNA整合到其基因组中，从而保持该DNA，并且优选将这样的DNA的拷贝传送到后代细胞，其可以是通过有丝分裂或减数分裂的。根据本发明的一个优选具体实施方式
，提供了植物，其基本上由将所述DNA的一个或多个拷贝整合到其基因组中的细胞构成，并且其能够将该拷贝传递到其子代，优选采用孟德尔模式(Mendelian fashion)。在某些或全部植物细胞内，通过根据本发明的DNA的转录和翻译能够产生用于系统信号化合物的受体的这些细胞将会对病原体感染表现出增强的抗性。
植物物种的转化对于大量的植物物种(包括双子叶植物和单子叶植物)来说现在都是常规性的。原则上，任何转化方法都可以用来将根据本发明的嵌合DNA引入到合适的亲代细胞中，只要该细胞能够被再生成整株植物。合适的方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Nature，1982，296，72-74；Plant MoI.Biol.，1987，8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Bio/Technol.，1985，3，1099-1102)、微注入植物材料(MoI.Gen.Genet.，1986，202.，179-185)、各种植物材料的(DNA或RNA-涂覆的)粒子轰击法(Nature，1987，327，70)、(非整合型)病毒进行的感染法等。根据本发明的一个优选方法包括土壤杆菌介导的DNA递送。特别优选的是使用所谓的双生载体技术，如披露于EP A 120 516和美国专利4,940,838中的。
通过使用可选择或可筛选的标记物以在转化的植物或植物细胞和非转化植物或植物细胞之间加以区分而可促进转化。然而，可能也可使用所谓的无标记物的转化方案，例如描述在WO 01/29240中的方案。
一般而言，在转化之后，存在一种或多种标记物，选择植物细胞或细胞分组，对于该标记物由与根据本发明的核酸序列共递送的植物可表达基因编码，其中在转化材料被再生成整株植物之后。可用作标记基因的基因可大致分成抗生素抗性标记基因，如nptII(产生卡那霉素抗性)和hpt(产生膦酰基麦黄酮(phosphonotricin)抗性)，和发育或代谢选择性标记基因，如海藻糖酶基因、甘露糖基因(都属于代谢标记物)和IPT基因或RKS受体激酶基因(发育标记物)。对于无标记物的转化，可能使用先前描述的T/R系统，其基于再生基因产物(WO9743427)的瞬间活性或可诱导再生基因产物的稳定整合。
尽管考虑到对遗传转化稍微更困难些，但是单子叶植物可接受转化，并且大量的转基因植物可再生自转化的细胞或晶胚或其他植物材料。目前，对于单子叶植物的转化，优选的方法是晶胚、外植体或悬浮细胞的微投射轰击法，和直接DNA摄取法或电穿孔法(Shimamoto，et al，1989，Nature 338，274-276)。通过微投射轰击法将吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar-基因引入到玉米悬浮培养基的胚胎细胞中而获得了转基因玉米植物，其中这种吸水链霉菌bar-基因编码膦基麦黄酮乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase)(一种使除草剂膦基麦黄酮失活的酶)(Plant Cell，1990，2，603-618)。已经报道将遗传物质引入到其他单子叶作物如小麦和大麦的糊粉原生质体中(Plant MoI.Biol.，1989，.13，21-30)。通过仅选择成熟致密和瘤状胚胎胼胝体组织用于形成胚胎发育悬浮培养基，而已从胚胎形成悬浮培养基中再生出了小麦植物(Bio/Technol.，1990，8，429-434)。对于这些作物，转化系统的组合能够使本发明应用于单子叶植物。
包括商业上重要的作物如水稻和玉米的单子叶植物，也可接受通过土壤杆菌菌株进行的DNA递送(参见WO 94/00977；EP 0 159418 Bl；Plant.Physiol，1991，95，426-434；The Plant J.，1994，6，271-282)。
在DNA转移和再生之后，对推定转化的植物就可以进行对于根据本发明的DNA的存在、拷贝数和/或基因组组织进行评价，例如利用Southern分析。在初始分析之后，表现出希望的拷贝数和根据本发明的新引入的DNA的表达水平的转化植物可以对病原体的抗性水平进行测试。
其它评价可以包括在田间条件下的病原体抗性、可增殖检查、产量、以及其他特征的测试。这样的测试目前是本领域普通技术人员常规性实施的。
在这样的评价之后，转化的植物可以直接生长，但通常它们在新(内生)变种的育种或形成杂种等中可以用作亲代株系。
具有改进的抗病性的这些植物(包括植物变种)可以在田地、温室、住所或别的地方生长。植物或其可食用部分可以用于动物饲料或人消费，或者可以加工成食物、饲料或以农业或工业的任何形式的其他目的。农业是指包括园艺、树木栽培、花草培育等。可以受益于根据本发明的植物材料的工业包括但不限于制药工业，造纸和纸浆工业、制糖工业、饲料和食品工业、酶生产工业等。
根据本发明的植物或其部分的优点是降低了对于杀虫剂处理的需求，由此也降低了原料成本、劳力和环境污染，或延长了这样的植物产品(果蔬、种子等)的保存期。用于本发明目的的植物是指能够进行光合作用的多细胞有机体，其易遭受某些形式的病原体诱导的疾病。它们至少应包括被子植物及裸子植物、单子叶植物及双子叶植物。
本发明的目的之一在于提供增强的抗病性同时维持植物的健康和产量。已证实(参见，例如WO 04/007712)，RKS受体的引入诱导了植物中的表型变化。然而，由RKS受体分子的过表达诱导的变化看起来没有降低健康和产量，相反看起来增强了健康和产量。因此，通过向植物提供编码对应于信号转导化合物的受体的基因构建体来诱导增强的病原体抗性的额外优点在于，这样的受体的过表达还增加植物产量和/或整体健康。
而且，如果这样的效果不是很希望的，则为了维持植物的最佳健康，优选特异性地(即仅在(最)易于感染病原体的那些组织中)表达受体分子组织。当然，组织的选择也取决于寻求防护的病原体部分病原体仅感染例如植物的根，同时其他病原体则对绿色部分或仅叶子或茎是特异性的。应当可以理解，仅在植物的有限部分表达的受体不会严重损害植物的健康，同时将会足以使植物获得增强的抗病性。
尽管转基因植物，就自身而言，会表现出对系统信号化合物增加的敏感性，其中系统信号化合物由那些相同的植物在病原体攻击后以基础水平或更大量系统地产生，但是通过施加系统信号化合物来诱导增强的诱导抗病性也是本发明的一部分，其中该系统信号化合物由受体或配体所识别，而该受体或配体又由嵌合受体(因此该植物是转基因的)识别。优选地，系统信号化合物通过喷洒施加。对于大多数作物植物，已知当它们最易于感染病原体，或病原体把这些植物当作宿主时，是最具致病性的。为了最佳地保护这些植物抵抗疾病，建议在预计病原体攻击之前在可以形成诱导抗病性的时间点喷洒这些植物。
为了提供快速而简洁的测试，如果一旦喷洒了系统信号转导化合物而新植物品种就真正可产生增强的抗病性，则本领域的技术人员可实施已知名为ATTA(根癌土壤杆菌瞬间表达测定(Agrobacterium tumefaciens Transient expression Assay))的快速瞬间表达试验。在该测定(其详细描述在Van den Ackerveken，G.，等.(Cell，1996，87，1307-1316)中)中，编码所选受体的核苷酸序列被置于植物组成型启动子的控制之下，并被引入到土壤杆菌菌株中，该土壤杆菌菌株也用于稳定转化的方案中。在用已知增强土壤杆菌T-DNA转移的乙酰丁香酮或任何其他酚类化合物进行细菌培养之后，把1mL的土壤杆菌培养物通过注射原位渗透进植物中，之后将植物置于温室中。在2-5天之后，就可用所述信号转导化合物对叶进行喷洒，随后一天就可对其进行抗病性测试，或者通过直接在叶上施用病原体，或者通过在熟知的脱叶测定中的叶子。也可能不是主动地采用信号转导化合物进行喷洒，而是使用植物自身的信号转导系统来测试未直接被影响的植物部分的增强的抗病性。
用于检测抗病性水平的另一可替换测试法是通过用于抗病性标记物(即指示对病原体的抗性增强的分子)的测定分析。可用于这个方面的标记物是PR-1，其是用于水杨酸诱导的标记物；At2g14560，其为用于油菜素类固醇和水杨酸诱导但并不用于生长素诱导，并且处于NPR1的直接控制之下的标记物(Plant Physiology2005，137，1147-1159；Science 2005，308，1036-1040)。编码胞外肽信号转导分子的锌指蛋白ZAT7(At3g46090)和At2g32200代表用于SAR-介导的抗病性反应的其他标记物(参见图6、9和10)。具有对于RKS4的过表达的修饰表达的其他基因也可以用作标记物。当相比于野生型对照时，这些标记物的丰度表示植物中增强的病原体抗性。
这些标记物的胞内量利用本领域技术人员熟知的标准测定易于确定(也参见实验部分)。
适合喷洒施用的配体分子或信号化合物对于本领域的技术人员来说是熟知的。水杨酸、茉莉酮酸和油菜素类固醇是批量生产并且易于获得的化合物。修饰RKS受体活性的肽能GASA信号化合物已经被描述了，并且可合成地制成或者通过本领域熟知的重组DNA技术来制成，待施用的化合物的浓度取决于该化合物自身的特性、存在于待处理植物组织中的内源性和转基因受体的密度、以及所述化合物施用的方式(例如通过喷洒，经由营养或水分摄取等)。例如，专门设计的具有优化功能的油菜素类固醇、和油菜素类固醇信号转导、干涉活性油菜素类固醇的正常结合的拮抗剂，可基于分子报道系统进一步进行优化，该分子报道系统是基于定量检测和对油菜素类固醇激动剂和拮抗剂的胞内响应量化的。增强的抗病性响应的优化检测，可在模型植物的不同遗传背景或对于某些信号转导途径突变的植物中确定的。
GASA或系统素肽配体的激活可能通过去除前体蛋白序列的N-末端部分来进行的。通过喷洒活性GASA和/或系统素蛋白质、通过胞外蛋白酶激活前体蛋白、或通过向植物提供直接融合至活性肽配体序列的可诱导/组织或阶段特异性的启动子构建体，就可提供活性肽产物。
如果认为向植物提供了数量更大的用于信号转导化合物的受体分子能增强这种效果，则编码一种或多种这样的加工基因的下游中间体的第二构建体可扩大抗病性增强效应。用于这种方法中进行定性的化合物或者通过从传递信号转导级联下游的基因产物，或者通过受体激活而激活的基因产物来表示。直接信号传递的实例通过NHL和SPL基因产物(其已经证实，两个杂合体蛋白质分子伴侣与RKS蛋白相互作用)来提供。通过该信号转导级联在转录水平控制的基因的实例是通过涉及诱导抗病性启动的基因产物如先前描述的At2g14560，或可替换的At4g14400(涉及把不同胞内蛋白聚集在一起的锚蛋白重复蛋白)和At4g23130(跨膜受体激酶)来表示的。
实施例实施例1克隆方案受体的生产和表达例如通过如在(http://www.psb.rug.ac.be/gateway/)中定义的通路克隆系统加以实施。过表达构建体通过克隆全长cDNA克隆体而形成，该cDNA克隆体获自SALK、RIKEN或通过拟南芥基因-作图工具(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)指定的其他位置，例如通过使用载体序列(M13正向和反向或T7和SP6/T3引物)的重组克隆以及例如采用如在通路克隆技术中使用的将它们融合至B1和B2重组部位。重组成异位双元表达载体，例如是通过通路重组来完成的。为了具有所需基因产物的植物物种的常规转化，可能随后实施表达盒的单独PCR扩增以及随后使用例如T/R无标记转化技术(WO 01/29240)的粒子轰击。用于表达的特异性可诱导系统可以在相同通路克隆载体中进行，其中使用了可诱导启动子例如来自拟南芥的如Tween20可诱导1200bp OPR1启动子(Plant MoI Biol.2001 Nov；47(5)595-605)或组织或阶段可诱导启动子如早期衰老2000 bp CDPK1(At1gl8890)启动子(MoI Gen Genet.，1994，244，331-340)。
嵌合受体可利用不同受体结构域的RT-PCR生产来构建。随后所得嵌合受体的克隆(如在Science，2000，288，2360-2363中描述的)和表达可以再次使用通路克隆和表达系统来实施。
实施例2.施用油菜素类固醇诱导植物中的抗病性该实验使用了两种拟南芥株系Ws-0和Col-0。对9-天龄的幼苗用mock-Silwet L-77(0.01％)或油菜素类固醇(+0.01％Silwet L-77)进行喷洒。干燥后，将植物在长日照生长室(MPMI 2005，18，583-592)中培养。两天后，对一半的植物在其叶上用Waco9(白菜霜霉病菌株(Peronospora parasitica))(50孢子/μL)进行喷洒(MPMI 2005，18，583-592)。接种后7天，植物(每株系40颗苗)对孢子形成进行计分。将mock用作对照。实验的感染和分析如先前描述的(MPMI 2005，18，583-592)进行。
结果(参见图2和表1)表明，在喷洒mock和油菜素类固醇混合物后2天，喷洒油菜素类固醇的植物伸长，但是6天后看起来与mock的几乎一样，仅仅用0.01％Silwett-L77水溶液处理的稍微更长一些。而且，一些子叶已经完全混乱。用油菜素类固醇喷洒的CoI-0和Ws-0植物与mock对照比较，Waco9的孢子形成更少，由此表明通过施用油菜素类固醇诱导了抗病性。
表1 孢子形成结果

实施例3.RKS受体介导油菜素类固醇识别在根响应生物分析中，RKS基因的过表达导致对不同浓度的油菜素类固醇产生了修饰的响应(Cell 2002，110 203-112&213-222)。图3示出了RKS10-OX和RKS4-OX株系对不同浓度的油菜素类固醇表现出增加的敏感性。RKS4(根中的一种基因，特异性表达在中柱的分裂组织起始和维管束原组织中)的剔除型株系在另一方面如通过更长的根举例说明的那样，在高浓度下对油菜素类固醇敏感性表现出大大降低。这不仅表明RKS4在根生长期间是一种重要的调节分子，而且其通过油菜素类固醇信号转导起作用。在若干植物器官中，RKS4控制着细胞增长和细胞分裂速率(参见图8)。其在分生组织细胞中的限制表达表明了RKS4基因产物在生长中的重要作用，取决于受体和激素浓度。
为了详细研究RKS4的作用，接着使用了功能增益和损失的方法。在CaMV 35S启动子控制之下，RKS4全长cDNA在拟南芥Ws-0植物中被异位表达，我们在SALK收集(Alonsoet al.，2003available from NASC the European Arabidopsis seed-stock center)中寻找T-DNA插入株系。两个插入株系SALK_066568和SALK_071166，分别被重命名为rks4-1和rks4-2，与过表达株系(RKS4-OX)一起进行研究。RKS4稳定状态mRNA水平的变化通过在12-天幼苗中的RT-PCR证实，其表明RKS4基因确实在RKS4-OX植物中过表达，而且在两个T-DNA插入株系的任何一个中不可再检测到其全长信使。然而，RKS4 mRNA的5′端(T-DNA插入的上游)仍在rks4-1和rks4-2 KO株系中被转录。在rks4-1中，所产生的截短信使的水平比其他所有的样品中的更高。该片断对应于RKS4受体的胞外结构域。图4的数据表明，与RKS4基因产物的野生型水平相比，rks4-1剔除型株系表现出5′mRNA的较大提高的稳定状态水平。两个剔除型株系不再表达全长RKS4 mRNA。图5中的结果和来自报道PR-1和At2gl4560的数据(图9和10)表明，该片断对于假单胞菌的抗病性和抗病性报道基因产物的mRNA水平具有正性影响。
相似的N-末端蛋白质产物，番茄LRP蛋白(ELS基因产物的同源物，非常类似于RKS胞外结构域)先前已被描述为与类病毒感染有关。该LRP蛋白在病原体发作期间通过枯草杆菌蛋白酶进行加工(Plant Journal 1996，10，315-330)。这些特异性内蛋白酶涉及通过细胞壁内的调节基因产物的特异性修饰而调节植物对病原体的入侵的响应。正如监测所得的抗病性的变化表明了RKS-类基因产物的N-末端结构域在植物的诱导抗病性的激活中的作用，如下文所述。
许多RKS基因产物已经被证实涉及病毒抗病性，介导广谱联体病毒的抗病性(Genes and Development 2004，18，2545-2556)。本文中，RKS7、RKS 14和RKS1的同源功能已关于其对病毒感染的作用进行了研究。成功的植物感染证实取决于通过病毒致病力因子NSP对这些RKS受体的抑制。NSP毒性蛋白直接与RKS蛋白作用，导致产生抗病毒响应的抑制(Virology 2004，318，24-31)。
我们的数据与RKS受体的这个亚类的作用是一致的，因为已调节了RKS4表达的植物表现出增强的抗病性水平。在拟南芥中，RKS4的异位表达确实导致丁香假单胞菌感染降低了约50％(图5)。有意义的是，该水平的抗病性在rks4-1 KO株系中进一步提高(图5)，其中所述信使的5′端的表达水平增加(图4)。这表明受体通过蛋白水解酶被激活。这些植物也对白菜霜霉菌具有抗病性(图5B)，表明至少这个亚类的RKS基因产物在介导各种病原体的抗病性中具有一般性的作用。
实施例4.RKS基因调节不同抗病性标记基因在RKS4过表达植物中，At2gl4560基因产物(油菜素类固醇诱导的标记物，但不是植物生长素诱导的标记物)被上调(参见图9和图10)。标记At2gl4560受NPR1的直接转录控制，并受SA施用的强烈诱导(Plant Physiology 2005，137，1147-1159；Science 2005，308，1036-1040)。这些发现与以下观察结果完全一致与对照植物相比，PR-1与其它抗病性标记物一起在具有修饰水平的RKS4的植物中被较大地上调(参见图6，9和10)。
从这些结果可以推断通过RKS4介导的油菜素类固醇信号转导诱导植物中的SA信号转导响应，如通过PR-1的较大上调而可视化的一样。其它高度诱导抗病性标记基因如C2H2/ZAT7(参见图6)、转录调节基因产物(At3g46090)或抗病性相关基因At2g32200在异位RKS4表达植物中分别被160-倍和100-倍地诱导。
实施例5.RKS诱导表型变化RKS4过表达植物的观察结果显示，较宽范围的形态变化(其为在花中发现的最显著作用)花的尺寸在RKS4-OX1中显著增加(图7a)，但是在RKS4-OX2和KO植物中保持未受影响(数据未示出)。尽管我们未对所有的花瀑进行定量分析，但是该尺寸变化可至少与增加的花瓣尺寸相关。事实上，看起来在RKS4-OX1中的花瓣表面积与野生型相比增加了60％(图7b)。细胞尺寸的测定清楚地表明，这是由于细胞尺寸增长(37.6％)和细胞数目增长(16.3％)两方面的原因所致。然而，在RKS4-OX2(图7b，p-值＝0.09)中或rks4剔除型植物(数据未示出)中没有观察到显著差异。后一结果并不令人惊讶，因为RKS4基因并未在花瓣中表达。然而，在两个过表达株系之间观察到的差异更令人迷惑，并且用于表明高于某一水平的RKS4表达可能将野生型的情形反转。改变的RKS4表达与种子大小(上面已述及)和重量(图7f)相反，并不影响长角果形状和大小(数据未示出)。通过其长度确定的种子大小在KO株系中的确被显著降低，尽管对于rks4-1和rks4-2分别只有5.2％和3.5％。在过表达株系(如花)中观察到相反的结果，RKS4-OX1中表现出较大的长度增长(27.6％)，而在RKS4-OX2中观察到较弱的但也是显著的增长(14.9％)。根据种子重量，该差异遵循同一个趋势，但是对于RKS4-OX1和RKS4-OX2是更为极端的，分别具有更重81.9％和33.7％的种子。另一方面，KO株系并没有显示出显著的差异。很显然种子的大小/重量变化并未影响种子发芽(数据未示出)。在胚芽尺寸和胚乳含量方面的变化并未进行研究，但是子叶尺寸在发芽之后进行测定(图7e)。令人惊讶的是，在KO株系(对于rks4-1为30.1％和rks4-2为15.8％)以及过表达株系(对于RKS4-OX1和RKS4-OX2分别为61.7％和36.9％)的子叶都很明显地更大。更大的子叶可说明晶胚也更大，因此，说明在种子重量和尺寸方面也增长，如在RKS4-OX1和RKS4-OX2中观察的。然而，这与rks4-1和rks4-2种子并不一致(其与野生型相比更小)。更密切观察结果可以解释这种差异。事实上，子叶在KO株系中更大主要是因为细胞分裂增加(rks4-1为15％和rks4-2为10.7％)。另一方面，在过表达株系中，细胞分裂实际上减少了15.5％(RKS4-OX1)和4.9％(RKS4-OX2)，因此更大的子叶只是细胞伸长发生极端增加(分别增加91.3％和43.9％)的结果。有意义的是，细胞伸长在rks4-1中也发生了增加(13.1％)并且也归因于子叶尺寸的变化，但是在rks4-2(p-值＝0.38)中没有发生变化，这表明(与种子一样)了表型强度方面的差异。在RKS4-OX1的子叶中观察到的较大尺寸增加后来在其莲座丛的尺寸和形状方面也是可见的，尤其在短日照条件下，得到具有更圆和更宽的叶的极其强劲的莲座丛(图7c-d)。然而，像花瓣中的那样，对于RKS4-OX2或KO植物来说就不是这样，其没有表现出显著的差异(数据未示出)。正如从其表达模式所期望的那样，改变的RKS4表达水平也影响了根的发育。对在垂直盘上生长的幼苗根的测量结果确实表明，如在子叶中的那样，根的尺寸/长度在KO和过表达株系中都显著增加(图7g)。至于所关心的增长程度的情形甚至是相同的(比较图5e和5g)，rks4-1比rks4-2显示出更强的增长(74％对65.9％)，而RKS4-OX1显示所有(包括再次较不极端的只有52.7％的RKS4-OX2)之中的最大增长(83.7％)。为了研究这种增长的本质，我们利用了由Colón-Carmona等(1999)描述的有丝分裂活性标记物，其在RKS4-OX株系中杂交(图7h)。在根尖中的GUS-阳性细胞数目的定量分析表明，细胞分裂速率在RKS4-OX1中显著降低，但是在RKS4-OX2中变化并不显著(图7i)，这大致与在子叶尺寸(图8e)中观察到的有限降低(4.9％)是一致的。尽管在RKS4-OX1中观察到的细胞分裂降低了3倍，但是根长度仍然增加了84％，这表明与子叶中的一样，根中的尺寸增长是细胞伸长的显著增长所致。然而，在KO株系中，我们还未能研究所述情况是否也对应于子叶中的观察结果，即在解释更长的根的细胞伸长和分裂两个方面的增长。
这些观察结果的总和与RKS4启动子活性一致，表明RKS4受体涉及保持其所表达的器官的尺寸。其表达的增加和降低可导致器官更大(种子除外)的事实表明，在最佳保持器官尺寸恒定方面需要特定水平的RKS4受体。尽管所述受体的功能损失并没有使表型产生与其过表达那样显著的增加，但是很明显，在RKS4剔除型株系中，细胞分裂至少在子叶中和或许也在根中被刺激，而在过表达植物的相同器官中观察到了相反的结果，证实了细胞分裂可在某水平的RKS4下被抑制/维持。另一方面，在花瓣中并未观察到，其中RKS4的过表达刺激了细胞分裂以及伸长。然而，RKS4一般不会在花瓣中表达，由于或许并不代表所述受体的内源性功能的异位相互作用，我们可以着眼于多效性作用。有意义的是，在表现出RKS4更强表达的RKS4-OX2株系中，观察的表型比在其他过表达株系或像在花瓣中的那样甚至是缺乏的株系中更温和。这可能表明产生的受体数目已经达到饱和水平，导致更弱的作用。
植物生长期间光条件对所观察表型的影响和已知的油菜素类固醇涉及光形态发生的调节是与RKS4的作用相一致的，如同与关于油菜素类固醇(BR)信号转导中的RKS10(BAK1/AtSERK3)的文献相符，这也与通过上述的根生长测定的描述一致。
总之，RKS基因产物涉及油菜素类固醇的识别。这些受体的调节导致对不同病原体如假单胞菌和病毒的抗病性水平的提高。具有修饰水平的RKS的植物不仅表现出广谱抗病性，而且也表现出诱导的健康特征。
权利要求
1.用于增强植物抗病性的方法，其通过给植物提供包含编码用于系统信号化合物的受体的DNA序列的基因构建体，其中所述系统信号化合物是由水杨酸、茉莉酮酸和油菜素类固醇组成的组中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体选自由茉莉酮酸受体(可能由JAI-1基因编码)、水杨酸受体(可能由植物COX2同源基因编码)和RKS受体组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其通过增加每个细胞的所述受体分子的数目。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中编码所述受体的所述DNA序列受组织或发育特异性受体或可调节(可诱导)启动子的控制。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述受体是RKS受体，其优选地选自由RKS1、RKS4、RKS7和RKS14组成的组。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述受体是嵌合性的，这样使得所述受体的配体结合部分被另一受体的配体结合部分取代，所述另一受体选自由所述茉莉酮酸受体(可能由JAI-1基因编码)、所述水杨酸受体(可能由植物COX2同源基因编码)、所述RKS受体、类固醇受体、PAMP(病原体相关的分子模式)分子的受体、以及其他可扩散分子的受体组成的组。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RKS受体的配体结合部分被其他受体的配体结合部分取代。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中所述植物被提供了编码两种或多种受体的构建体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA序列编码RKS受体的N-末端部分(胞外结构域)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述N-末端部分是由截短的受体或通过施用胞外蛋白酶(内源性的或外部施加的)产生的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述胞外蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
12.通过根据权利要求6～9所述的方法生产的植物。
13.由根据权利要求9所述植物的后代生产的近交植物变种，其中所述变种中仍含有对诱导抗病性增加的敏感性。
14.诱导已被提供用于信号转导化合物的受体的植物中的抗病性的方法，其通过向所述植物喷洒能够结合至所述受体的信号化合物，所述受体选自由茉莉酮酸受体(可能由JAI-1基因编码)、水杨酸受体(可能由植物COX2同源基因编码)和RKS受体、或它们的嵌合受体组成的组。
15.用于确定应用根据权利要求14所述方法的最佳时间的方法，其通过监测诸如PR-1、At2g4560、ZAT7(At3g46090)和At2g32200的抗病性标记基因的水平。
全文摘要
本发明提供了一种用于通过给植物提供包含编码用于系统信号化合物的受体的DNA序列的基因构建体而增强植物抗病性的方法，其中这样的系统信号化合物是由水杨酸、茉莉酮酸和油菜素内固醇组成的组中的一种或多种。所述抗病性可通过使所述植物接触所述信号化合物而诱导产生。优选地，所述受体是RKS受体、水杨酸受体或茉莉酮酸受体。也可采用组合形式和/或嵌合受体。
文档编号A01H5/00GK101027400SQ200580032411
公开日2007年8月29日申请日期2005年7月25日优先权日2004年7月28日
发明者安妮·道韦·德布尔, 爱德华·丹尼尔·伦德特·施密特, 保罗·亚历山大·帕萨里尼奥申请人:表现研究有限公司