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种质的分子标记辅助创新

花匠小妙招
2024-10-26 14:16

分子标记辅助选择的有关问题与发展策略

黎裕

（中国农科院作物品种资源研究所，北京100081）

植物育种项目包括两方面的重要工作，首先是确定育种材料中是否存在有用的遗传变异，其次是采用有效的方法把目标基因转移到品种中。利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择是提高选择效率和降低育种的盲目性的常用手段。但是在常规育种过程中基本上还是应用的是形态学标记，这类标记往往受环境影响，不利于直接选择，并且标记数目有限。近一、二十年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术给育种提供了崭新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助选择”（marker-assisted selection，缩写为MAS）。但在这里它不包括利用分子标记进行优异种质的鉴定筛选、亲本的确定、遗传材料的鉴定和分析、亲本的遗传多样性和亲缘关系分析等，而是指把分子标记技术应用于育种过程之中，通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的（Dudley, 1993；Lee, 1995）。分子标记辅助选择是分子育种的一部分（分子育种还包括利用基因工程手段育种）。

一、分子标记辅助选择的优越性

有很多理论方面的研究都发现MAS比以表现型为基础的选择更有效，如Knapp (1998)发现在分离群体中，如果目标是从最好的1－2％基因型中选出一个基因型，考虑到成本则MAS是最有效的。MAS不仅针对主基因有效，针对数量性状位点（QTL）也有效；不仅针对异交作物有效，针对自花授粉作物也有效（特别是在QTL存在显性等位基因并处于相引相时效率更高）（van Berloo Ralph & Stam, 1998）。MAS的优越性可以体现在以下方面：

可克服性状基因型鉴定的困难：以下三方面的原因使基因型的鉴定带来不便，即等位基因的外在表现不明显，为隐性等位基因，或与其它基因或环境之间存在互作。尤其对多基因控制的性状（数量性状）来说，环境变异会使不同基因型表现为部分或全部相同的表型，这使基因型的鉴定更加困难。有些表型如抗病虫性、抗旱性或耐盐性只有在难于界定或控制的特定条件下才能表现出来。在育种项目的初期，育种材料较少，不允许做重复鉴定，或要冒一定风险，这方面的问题更加突出。利用分子标记技术则可部分克服基因型鉴定的困难。可克服性状表现型鉴定的困难：有的性状的表现型鉴定相当麻烦，如育性恢复、广亲和性、光温敏不育和一些抗病虫性及抗逆性等，不仅鉴定费时费力，而且这些性状受环境的影响很大，直接鉴定往往不太准确。如玉米粗缩病抗性的鉴定就存在这种情况，采用大田自然发病法需要一定环境条件，并且需要特别的田间设计，采用人工接虫法需要较高的养虫技术。采用分子标记来鉴定就有很大的现实意义。允许早期选择：有很多重要性状如产量和后期叶部或穗部病害抗性等只有在成熟植株上才能表现出来，因此采用传统方法在播种后数月或数年均不能对其进行选择。尤其对二年生或多年生植物如树木等来说这是育种改良的主要限制因素之一。而利用分子标记就可以在播种后数天对幼苗（甚至对种子）进行检测，这可大大节省培育植株中所浪费的人力物力和财力，因为这些植株中的绝大部分在育种项目中是被抛弃的对象。允许更广泛和强度更大的选择：在早期特别是对幼苗的选择还可以允许把更多的群体纳入研究选择的对象之中，从而可以对其施加更大强度的选择压力。同时，还可利用分子标记同时对几个性状（如几种抗病虫性和产量）进行选择。可进行非破坏性性状评价和选择：很多性状是在成熟前进行评价的，这往往带来种子收获的困难。如对植株进行病虫害抗性的评价和选择，则可能收获到的后代种子减少，甚至收获不到种子。而利用分子标记技术只需少量叶片或其它组织，植株还可继续生长至成熟，以便育种工作者同时对该育种群体进行其它性状的选择。可提高回交育种效率：把一个期望等位基因从一个材料转移到另外一个材料中的传统方法是过5-10代的回交育种。在每个回交世代中，育种工作者不仅要选择被转移的等位基因的表型，还要选择轮回亲本的其它性状的表型。然而，在若干代的回交之后，除目标等位基因外，还有与之连锁的相当长的染色体片断也从目标等位基因供体中转移到回交后代中。如利用传统回交方法将一个野生种的优良基因转移到栽培品种中，回交20代以上还有可能带有100个以上的其它非期望基因（Young & Tanksley, 1989）。如果是数量性状位点（QTL）的转移，由于上位效应问题和连锁累赘更为复杂，将更加困难。利用分子标记可以允许选择出那些含有重组染色体（打破了连锁累赘）的个体，从而帮助减小不需要的染色体片断，从而提高育种效率至少10倍以上（Tanksley et al., 1989）。另外，对隐性性状可以进行不间断的回交（传统回交中是隔代回交），从而提高基因的回交转移速度。

二、影响分子标记辅助选择的因素

1、分子标记与目的基因或QTL之间的连锁程度

很多研究表明，分子标记与基因（包括QTL）的距离越小，MAS的效率越高，主要原因是距离小则可以提高估计QTL等位基因效应的准确程度(Dudley, 1993; Edwards & Page, 1994; Hospital & Charcosset, 1997; Moreau et al., 1998; Spelman & Bovenhuis, 1998; Zhang & Smith, 1992)。在每个QTL只有一个连锁的分子标记时尤其如此，如果有两个分子标记则这个效应减弱。Gimelfarb & Lande (1994a,b, 1995)发现如果一条染色体上有多个标记，存在一个最适标记密度，在此之上则MAS的相对效率降低。但是，也有研究认为连锁程度会降低效率，但影响并不太大(van Berloo Ralph & Stam, 1998)。

2、选用的分子标记数目

对主基因，Tanksley (1983)建议用分别位于主基因两侧的两个分子标记同时选择可提高选择效率。Landry et al. (1987)在莴苣的抗霜霉病基因Dm5/8两侧各有一个RFLP标记（距离均为10cM），用一个标记选择获得抗性个体的概率为90％，用两个标记则可达到99％。

对于QTL，Moreau et al. (1998)发现在少数QTL可解释大部分变异的情况下，MAS的效率更高。事实上，在QTL作图时检测到的QTL数目要比实际的QTL数目要少，如果QTL数目太多（如多于20），就不能假定选定的QTL之间是独立的，两个连锁的QTL会导致检测到位于它们之间的一个“幻象QTL”，而这会降低MAS的效率。对在选择指数中引入多少个分子标记的问题，一般认为存在一个最佳数目，这与性状的遗传力有关(Gimelfarb & Lande, 1994a, 1995; Moreau et al., 1998)。Gimelfarb & Lande (1994a)发现利用6个标记时的MAS效率高于利用3个标记时的效率，但利用12个以上的标记时，MAS的效率在低世代时反而降低，在高世代时增幅很小。

3、群体大小

Lande & Thompson (1990)分析MAS的效率时曾假定群体无限大，标记无限多，在此基础上作出性状遗传力低时MAS比常规选择效率高的结论，但他们还是认为有必要研究大量个体，样本大小对加性遗传方差有一定影响，在群体很小时MAS没有多大用处。其它一些根据计算机模拟的结果对MAS的效率进行的研究表明，群体大小是影响MAS的关键因素（Edwards & Page, 1994; Gimelfarb & Lande, 1994a, b, 1995; Hospital et al., 1997; Whittaker et al., 1995; Zhang & Smith, 1992, 1993）。Moreau et al. (1998)也发现MAS的相对效率随群体增大而提高，但在群体小于200时MAS仍然有效。

4、性状的遗传力

根据计算机模拟的结果对MAS的效率进行的研究表明，性状的遗传力也是影响MAS的关键因素，一般来说遗传力越高则MAS效率降低（Edwards & Page, 1994; Gimelfarb & Lande, 1994a, b, 1995; Hospital et al., 1997; van Berloo Ralph & Stam, 1998; Whittaker et al., 1995; Xie & Xu, 1998b; Zhang & Smith, 1992, 1993）。Moreau et al. (1998)认为在群体大小有限的情况下，对低遗传力的性状MAS的相对效率也较高，但存在一个最适遗传力，在此限之下MAS的效率会降低。在低遗传力（0.1-0.2）时，MAS的效率更高，但可能出现的负面试验的频率也高一些，因此利用MAS技术所选性状的遗传力在0.3-0.4之间会更好（Hospital et al., 1997; Moreau et al., 1998）。然而，如果群体大小很大（如大于500但不是无限），最适遗传力接近于零，这一点也就没有多大意义了。在实际利用分子标记辅助选择改良普通菜豆的抗旱性时也证实了MAS的效率与性状的遗传力有反比的关系（Schneider et al., 1997）。

三、进行分子标记辅助选择的前提

1、建立尽量饱和的分子标记图谱：有人把它称之为“框架图谱”，因为真正的基因将定位于这个图谱上，并且在比较不同种的染色体组成时可以以此作为基础。首先需要建立把分子标记以线性形式排列起来的连锁图谱，然后把这些连锁图谱与特定的染色体或连锁群联系起来，定位在染色体上。但后一步工作对育种来说不是必须的。建立饱和的分子图谱是对目的基因进行精密定位的前提。目前，对大多数重要的农作物均已建立相当饱和的图谱，尤其在水稻、玉米、小麦、大麦、西红柿、马铃薯等作物上。但对有些作物还需要在这方面做更多的工作。

2、把目标基因定位于分子图谱上：又称之为“基因标记(gene tagging)”，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。这里的目标基因包括控制简单遗传的性状的基因和控制数量性状的基因（QTL）。分子标记辅助选择的可靠程度取决于目的性状座位于标记座位之间的重组频率，因此二者之间的遗传距离越小越好。与目的基因紧密连锁的单一分子标记可以用于辅助选择，而如果在目的基因两侧均能找到与之连锁的标记，会进一步提高选择的可靠性。由于在15－20cM的距离内很难发生两个重组事件（双交换），因此现在一般认为如果目标基因位于两个距离在15－20cM以下的分子标记之间，这两个标记便可以用于育种项目。很显然，供体和受体材料在标记基因位点上的等位基因应是有差异的，而带有两个分子标记的染色体片断之间有目标基因。如果与目标基因相近的片断发生了单交换，此染色体将只带有两个分子标记之一。假定两个分子标记相距不到15cM，双交换可以忽略。如果目标基因的定位还不太精确，可利用三个以上的分子标记以保证目标基因位于标记位点之间。或者，可进一步对目的基因进行精密定位（通过扩大作图群体、选用其它作图群体、使用群体作图方法、采用更多的探针、内切酶或引物等）以使目的基因两侧都有标记，并且距离在15cM之内（5cM更好）。

3、检测的自动化：由于分子标记辅助选择要求对育种群体进行大规模检测，因而要求检测的方法要简单、快速、成本低、比较准确，也要求检测过程（包括DNA的提取、分子标记的检测、数据分析等）自动化。考虑到这些因素，我们有必要对分子标记种类的选择进行简要的讨论。分子标记可以分两类，一类是以须限制性内切酶酶切而获得的标记，如RFLP等，另一类是以聚合酶链式反应（PCR）为基础而获得的标记，如RAPD、SSR等。RFLP检测步骤多，周期较长，成本较高，因此自动化程度不易提高。而以PCR为基础的标记尤其是SSR标记就有更多的优势。AFLP结合了这两类分子标记的特点，并且可检测到更高的多态性，在分子标记辅助选择中也有很大的发展潜力。而一些根据RFLP、RAPD、AFLP等标记发展出来的特异PCR标记（如STS、SCAR、CAPS标记）一样可以应用于辅助选择。

四、分子标记辅助选择的发展策略

1、回交育种－外源基因的转移

在利用分子标记进行外源基因的转移时，必须解决以下矛盾，即如何保证目标基因位于足够大的染色体片断之内而同时又不能使这个片断太大，因为片断太大会使与目标基因连锁的非期望基因也转移到另一材料中，即带来连锁累赘(linkage drag)。传统的外源基因转移手段是回交方法，它的最大缺陷是多代回交后还存在着来自大量的供体的非期望基因。利用分子标记可直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而可望在很大程度上解决连锁累赘这个问题，同时在理论上可以把回交代数从传统回交育种的六代以上减至2－3代（Melchinger, 1990; Tanksley, 1983; Tanksley et al., 1989）。鉴定检测供体基因是否转移到后代中，又称为前景选择（foreground selection）。单拷贝或低拷贝的分子标记如RFLP和SSR比较合适用于解决这个问题。另一方面，可通过分子标记选择整个基因组，使目标等位基因在回交过程中处于杂合状态而其它位点的基因型与轮回亲本相同(Hillel et al., 1990; Hospital et al., 1992; Tanksley & Nelson, 1996;Young & Tanksley, 1989)。这又称为背景选择（background selection），可以通过利用各染色体上分布较好的4－5个分子标记（AFLP标记更好，Waugh et al., 1997），在每个世代选择轮回亲本的等位基因。可能在回交一代就有一些个体的一些染色体是纯合的而目标基因是杂合的，选择它们进行再次回交（还可重复）。对于在以前世代中已发现是纯合的染色体可少用或不用标记进行检测。最后，对轮回亲本的绝大多数等位基因已纯合的回交个体进行自交。图示基因型方法可以用于监测基因组的变化（Tanksley et al., 1989）。研究表明，在一个个体数目为100的群体中，以100个RFLP标记辅助选择，只要三代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的99.2％，而随机选择则需要七代才能达到这个效果。要去除目的基因两侧的供体染色体片段，用分子标记方法可能两代就可达到目的（即使含目的基因的片段在2cM之内，但需检测至少300个个体），而用常规方法需至少100代（Tanksley et al., 1989）。此外，由于可进行早期（如幼苗）的分子水平的分析，可以大量减少每个世代的植株种植数量。

分子标记能辅助外源基因转移的主要原因是大大提高了缩短目标基因两侧的供体染色体长度的速度。这可以通过连续两代进行分子标记选择来达到。根据数量遗传学分析，现在认为如果仅进行一轮选择，将要分析1200株；若进行连续两轮选择，就仅需分析86株（第一轮分析28株，第二轮分析58株）。在西红柿上利用分子标记辅助回交育种方面的工作十分出色,他们把野生种的不少有益基因转移到了栽培品种中（de Vicente & Tanksley, 1993; Eshed & Zamir, 1994; Lawson et al., 1997; Messeguer, 1991; Young & Tanksley, 1989; Zamir et al., 1994）。

针对QTL的分子标记辅助育种必须考虑到一个问题，即由于重组可能使目标位点丢失、QTL定位发生偏差、QTL在新的遗传背景下的表达发生变化，因此在辅助选择时可能达不到预期的选择效果，这要求在育种过程中谨慎从事。就回交育种而言，对自花授粉作物，可以做到以下几点：（1）利用侧翼标记选择可能带有目标QTL等位基因的后代个体；（2）对选出的个体验证其表现型；（3）用多个标记鉴定带有轮回亲本基因组最大覆盖度的个体（Toojinda et al., 1998）。同时，就效率而言，只转移一个QTL，MAS可能没有表型选择效果好，但若同时转移多个QTL，MAS效率就要高得多（Visscher et al., 1996）。每个QTL用3个以上的分子标记则可基本保证在多代内QTL得到控制（Hospital & Charcosset, 1997；Ragot et al., 1995）。

2、杂交育种

杂交育种是一种普遍使用的育种方法。如果是主基因或由数目不多的QTL控制的性状，分子标记辅助的杂交育种策略与回交选择策略相似。如果是由数目较多的QTL控制的性状，则需要应用分子数量遗传学的方法来进行选择。例如，Lande & Thompson (1990)提出了一种基于表现型对分子标记类型的多元线性回归的方法，把表现型和与分子标记相关的效应估计值结合起来作为选择指数。计算机模拟的结果显示了这种方法在群体足够大而遗传力低时比表现型选择更有效（Gimelfarb & Lande, 1994a; Whittaker et al., 1995）。迄今为止，已发表了一些利用分子标记来辅助选择的实验报告（如Han et al., 1997; Stromberg et al., 1994），但却未使用上述方法。最佳线性无偏估计法（BLUP）也有使用价值(Fernando & Grossman, 1989; van Arendonk et al., 1994; Goddard, 1992; Bernardo, 1998)。Zhang & Smith (1992, 1993)研究了根据分子标记效应值和BLUP估计值得到的指数后也认为MAS比单单选择表型更有效。但是，在MAS的选择指数的确定上，权重是一个需要考虑的问题，交叉验证法可能解决这一问题(Whittaker et al., 1997)。

利用分子标记进行杂交育种中的辅助选择，可以有三种方法，一是仅仅基于标记效应进行选择，二是把标记效应和表型效应结合在一起得到选择指数而进行选择，三是分阶段选择（multistage selection）。这三种方法在不同情形下的结果可能不同。例如，先用分子标记选择后用表型选择可以提高单位成本的遗传增益（Xie & Xu, 1998b），但可能比一次选择降低总的遗传增益，因为一些好的材料在标记选择时已去掉（Xe & Muir, 1991, 1992）。Gimelfarb & Lande (1994a)提出如果在每代都评价检测对选择指数有贡献的标记，选择效果会更好。在MAS时，应先筛选出效应显著的分子标记，并且在计算选择指数时应根据各标记对目标性状的变异的贡献大小给予加权（Gimelfarb & Lande, 1994a; Zehr et al., 1992）。

在杂交育种中同样可以进行早代选择。经过在玉米的实证研究，发现分别根据S1和S4:5测交估计的分子标记效应比较一致，因此早代选择是可行的(Eathington et al., 1997a,b)。在另一个研究中，根据F2代测交得到的分子标记效应值被用来选择家系(Zehr et al., 1992)；对同一个群体，根据S4:5测交得到的标记选择指数和表现型来选择家系，但单单根据分子标记并不太有效（Stromberg et al., 1994）。

3、轮回选择

分子标记也可用于轮回选择。在分子标记位点可解释一个性状的大部分加性遗传方差时，MAS效率较高，尤其是在家系小时效果更明显（Xie & Xu, 1998b）。轮回选择中有不同选择方法，如混合选择（MS）、半同胞家系选择（HSF）、全同胞家系选择（FSF）、S1家系选择（S1F）、测交后代选择（TC）、FSF结合家系内混合选择（CSFS）和HSF结合家系内混合选择（CSHS）等。对CSHS，无论家系大小MAS均有用，CSFS在家系小于50时也比FSF更有效。在选择强度一致而家系相对较大时，分子标记辅助的S1F、CSFS、CSHS比MS好，HSF比MS差，但MS也有其优势（Xie & Xu, 1998b）。在大豆上，利用分子标记进行轮回选择的程序已较为成熟(Lewers & Palmer, 1997)。

4、基因的累加（gene pyramiding）

基因的累加是分子标记辅助选择的重要应用方面之一。因为作物中有很多基因的表现型不易区分，传统的育种方法就难以区别不同的基因，无法弄清一个性状的遗传机制。通过分子标记的方法可以检测与不同基因型连锁的标记来判断个体是否含有某一基因，这样在多次杂交或回交之后就可以把不同基因聚集在一个材料中。如把抗同一病害的不同基因聚集到同一品种中，可以增加该品种对这一病害的抗谱，获得持续抗性。如在国际水稻研究所，通过分子标记辅助选择就已经获得分别聚合3个抗稻瘟病基因和3个抗白叶枯病基因的株系（郑康乐和黄宁，1997；Huang et al., 1997）。关于QTL的累加，Xu (1997)作过详细的介绍。

5 分子标记辅助选择中需解决的一些实际问题

对辅助选择的性状的选择：应选采用常规育种比较费时费力的又十分重要的目的性状（它们往往是难以鉴定和检测的性状、或鉴定成本很高的性状、或是在生长发育后期才出现或才能检测的性状）。加快基因作图的步伐：对重要基因的分子标记作图是分子标记辅助选择的关键之一，因此有必要应用合适的分子标记对更多的重要基因（包括QTL）进行标记和定位。基因作图和辅助选择策略的选择：可以在育种群体内定位目的基因，使基因作图和辅助选择同步进行。Tanksley & Nelson (1996)提出了高回交世代QTL分析（advanced backcross QTL analysis，缩写为AB-QTL），就是一种把QTL分析和育种结合起来的方法。其步骤包括：（1）选出两个材料杂交；（2）用优良亲本作轮回亲本回交至BC1和BC2代；（3）对BC2或BC3代进行分子标记鉴定；（4）继续回交获得BC3或BC4代，并对之继续表型分析，然后进行QTL分析；（5）用分子标记辅助选择方法在优良遗传背景下选择含有供体等位基因的目标基因组区域；（6）对获得的近等基因系（NIL）和优良亲本在重复环境下进行农艺性状鉴定。这种方法尤其适合于把外源基因从不适应的种质中转移到优良品种中，并在西红柿上得到多次应用（Bernacchi et al., 1998a, b; Fulton et al., 1997; Tanksley et al., 1996）。尽快改进和完善自动化检测体系：如DNA提取的自动化、PCR检测的自动化（包括加样机器人和计算机识别系统等的使用），以尽快满足分子标记辅助选择中对大样本的检测的需要。降低成本是推广使用分子标记辅助选择技术的必要条件：尽管MAS比表型选择更有效，但由于基因型鉴定的成本较高导致MAS的成本效益降低（Xie & Xu, 1998），成本问题成为推广辅助选择的很大障碍。如何在今后降低基因型鉴定的成本将是普及该技术的关键所在，如利用基于PCR的标记，或在第二代选择与QTL连锁的分子标记的基因型而勿需评价表现型和鉴定所有分子标记（Hospital et al., 1997），就可以在一定程度上降低MAS的成本。在利用分子标记辅助选择时，群体大小应至少200，所选性状的遗传力应在0.05-0.5之间，标记应与QTL或主基因相当近（Moreau et al.，1998)。同时，应确定一个最佳选择强度以取得最大效率；最好是检测少量杂交组合的很多后代，而不是很多组合的少量后代（Knapp, 1998）。在早代进行MAS最好，因为在后面的世代中MAS反而没有表型选择有效（Hospital et al., 1997）。对数量性状进行改良时，多性状的MAS比单性状的MAS效率高。

利用分子标记辅助选择育种已成为植物育种领域的热点。然而，我们应清醒地认识到，分子标记技术只是起辅助作用，辅助选择离不开常规育种。就目前的发展现状而言，利用分子标记辅助选择的理论问题已研究不少，但利用分子标记于实际的育种项目现在还是处于探索阶段，未来的成功还需要不断积累新的经验和知识。对中国的育种工作者和生物技术工作者来说，现在正是一个赶上世界先进水平的契机。分子标记辅助选择技术将是我国农业新技术革命中一个重要的组成部分，它必将对我国的作物改良作出革命性的贡献。

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