脱落酸制备工艺优化及其抗肝纤维化和抗衰老活性研究
脱落酸制备工艺优化及其抗肝纤维化和抗衰老活性研究
【摘要】： 肝纤维化是由长期肝损伤引起的一种慢性疾病,若不及时控制会导致肝硬化,甚至危及生命。另外,随着人类寿命的延长、健康意识的提高以及老龄化人口增加带来的各方面压力,使得延缓衰老、提高生活质量成为一个重要课题。因此寻找一种安全有效而又毒副作用小的药物十分必要,同时也是近年来科研工作者研究的一个方向。脱落酸(Abscisic acid,ABA),一种植物和动物共有的倍半萜烯类成分,由于其在降血糖、诱导癌细胞凋亡、抗炎、改善动脉粥样硬化等方面良好的药理活性而备受关注。ABA有四种混合异构体,相比于人工合成而言,天然型ABA活性更好,而通过真菌发酵的途径就可以在短时间内大量获得天然型脱落酸。而多元菌发酵因其可以克服单一菌种发酵无法实现或者发酵条件较为苛刻的不利影响,从而快速高效的获得目的产物的巨大优势而被广泛研究及应用。本实验以药食两用的薏苡仁、黑豆、红豆、绿豆、玉米、大米为实验材料,筛选优化了黑曲霉(Aspergillus nige)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)两种菌种的混合发酵工艺,并以分离纯化得到的ABA为药物,分别研究了其对于TAA诱导的肝纤维化和D-半乳糖诱导的衰老小鼠的保护作用,具体结果如下:1、通过单因素实验分析了混合菌发酵的技术条件,并结合响应面优化法分析了ABA最佳发酵生产工艺:发酵时间5天、灰葡萄孢菌:黑曲霉3:7混合培养、碳源为葡萄糖:蔗糖8:2、营养添加物玉米粉14g/L,在此条件下发酵脱落酸产量最高。2、ABA干预提高了实验期间个体生存率,提高了肝脏指数和体重。H&E和Masson染色表明ABA能显著改变了TAA引起的肝脏病理学变化。同时,ABA还降低血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平以及肝脏中丙二醛(MDA)、增加肝脏内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的水平。免疫荧光染色观察到半胱天冬酶-3(Caspase-3)、转化生长因子β1(TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加。免疫蛋白印记结果中,TAA模型组引起的炎症蛋白NF-kappa B p65(p65)、白介素1β(IL-1β)水平上升,抑制性卡巴蛋白(Ik B-α)下降,ABA有效的抑制了TAA引起的炎症蛋白表达。ABA同时调节了凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)水平表达,表明ABA通过抗炎和抗凋亡来抑制TAA诱导的肝纤维化。3、ABA连续干预5周,逆转了D-Gal引起的小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)水平改变,提示体内氧化应激水平得到抑制。脑组织ACh E含量以及H&E染色结果表明ABA抑制了D-Gal诱导的脑损伤。同时,蛋白免疫印迹结果表明,ABA可抑制半胱天冬酶-3(Caspase-3)、p53增加,调节磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)蛋白水平、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、沉默调节蛋白1(SIRT1)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)表达水平,但是对小鼠肠道菌群无显著影响。综上所述,ABA可以介导炎症和线粒体凋亡抑制TAA诱导的肝纤维化。通过减轻凋亡和DNA损伤来抑制D-Gal诱导的亚急性衰老。以上实验结果为未来ABA的开发和应用提供参考。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2021
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