首页 > 分享 > 根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对菊花遗传转化的初步研究

根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对菊花遗传转化的初步研究

花匠小妙招
2024-10-29 17:31

【摘要】：花色(flower color)是指显花植物的整个生殖器官的颜色，狭义上是指花瓣的颜色，广义上是指花的器官：花萼、雄蕊甚至苞片发育成花瓣的颜色。花色素主要由类胡萝卜素(carotenoids)、类黄酮(flavonoids)、生物碱(alkaloids)三类物质所组成，其中类黄酮类物质具有产生蓝色的效果。在类黄酮类物质的代谢中，F3’5'H基因(即蓝色基因)编码关键酶，决定无色二氢黄酮醇羟化的位置和程度，能使花色素苷生物合成途径趋向于产生蓝色的翠雀素-3-葡糖苷，从而使花趋向于蓝色。虽然自然界中的花色种类繁多，但是玫瑰、康乃馨、郁金香等重要的花卉，却很少有蓝色和紫色系。花色改良是花卉改良育种的一个重要部分，长期以来，传统育种及定向选择技术虽然对花色改良作出了巨大贡献，但难于打破生物物种的生殖隔离，育种周期长，效果并不理想。而植物基因工程的发展为改良和修饰花卉性状开辟另一条崭新的途径，改良形状有目的性、周期短、检测方便等优点，使基因工程和分子育种成为花卉改良研究的大热点。采用基因工程能有目的地改良植株，并通过目测或少量辅助手段即可判定改良效果。因此，本试验便是将F3’5’H基因转入菊花中，以期获得新的菊花品种。F3’5'H基因作为蓝色花卉基因的重要组成部分之一，确定F3’5'H基因在不同物种间的表达差异，可以为改造其他名贵花卉的研究打下基础。但是同时也要认识到，蓝色花卉的产生所需要的条件很多，其中各因素的相互作用也十分复杂，F3’5’H基因虽然对植株产生蓝色花朵有很大的促进作用，但是效果还远远不够。真正蓝色花卉的产生，还有待于对其他更多因素的共同研究和综合作用。菊花(Dendranthema morifolium)是多年来经过人工培育和天然种间杂交而来，杂交造成的种质渗入以及多倍化和种下变异机制是菊花品种丰富性的来源。菊花的品种多，叶、花型、瓣型变化很大，是色、香、姿、韵俱佳的我国传统名花，与梅、兰、竹被共称为花中“四君子”，菊花不仅受国人的珍惜和推崇，而且也受到世界各国的关注和喜爱。多年来常规育种方法在菊花育种中已经取得巨大成就，但存在着不能利用其它物种基因资源的局限性。随着菊花遗传转化体系的建立发展、外源基因在细胞中的表达及转化方法的进步等，定向修饰它的某些目标性状并保留原有优良性状，使其在花色、花期、花型、抗性等方面都得到了极大的改观和发展。由于国内外菊花品种分类标准存在的差异，国外文献报道的一些菊花品种的遗传转化的体系并不适合我国的一些传统菊花品种，因此研究适合我国菊花品种的遗传转化体系有十分重要的意义。论文研究内容与结果如下：1、四种菊花高频再生体系的优化本研究以菊花‘黄冠’、‘久米荣’、‘山城之光’、‘冬桔’四个品种为试验材料，研究了不同基因型，不同激素浓度，不同预培养时间对菊花愈伤组织诱导、不定芽发生的影响；优化了菊花的再生条件，获得了菊花叶片的高效再生体系并得出了四个品种的叶片的最适分化培养基，分别为：冬桔MS+6-BA2.0 mg/L+IAA2.0 mg/L；久米荣MS+6-BA1.0mg/L+IAA2.0 mg/L；山城之光MS+6-BA2.0 mg/L+IAA5.0 mg/L；黄冠MS+6-BA1.0mg/L+IAA3.0 mg/L。其中，菊花品种山城之光的最高再生频率，能达到100.0％，冬桔、久米荣、黄冠分别为86.7％、85.3％和81.2％。所以后期操作选择了山城之光叶片为外植体的体系作为遗传转化的操作体系。2、构建F3'5'H基因的植物正向表达载体pC2301-F3’5'H及农杆菌菌株的转化用KpnⅠ和BamHⅠ同时双酶切含有目的基因的克隆载体pT-F3'5'H和表达载体质粒pC2301，然后回收、连接目的片段与载体，构建成正向植物表达载体pC2301-F3’5'H。将pC2301-F3'5'H转入农杆菌菌株LBA4404中，经检测，得到含有F3’5’H基因的农杆菌LBA4404-F5'3'H。3、根癌农杆菌介导的F3'5’H基因对菊花的遗传转化切取大小为6mm见方的菊花品种山城之光的无菌苗叶片，以OD_(600)=0.5的农杆菌LBA4404-F5'3’H菌液感染20min，用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接入培养基MSG：MS+6-BA2.0mg/L+IAA 5.0mg/L中进行暗培养3d后，在延迟培养基MSY：MS+6-BA 3.0 mg，L+IAA 5.0mg/L+Cef 200 mg/L中延迟筛选4d，再转入筛选培养基MSS1：MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+Km 20 mg/L+Cef 100 mg/L中进行筛选分化培养。待培养基中生长的芽长到长约1cm后，将其切下接入培养基MSS：1/2MS+Km 10 mg/L中进行生根筛选，筛选出能够正常生根的转化苗，并做进一步的鉴定。4、转化植株的PCR鉴定根据35s启动子、F3’5'H基因序列分别设计特异引物，对转化植株进行PCR检测，所得阳性转化株系命名为Y~(F3'5'H)，未转化的菊花对照用Y~0表示。把经抗性筛选得到转基因植株通过PCR扩增，得到与阳性对照相同的条带，筛选得到15株阳性植株，初步鉴定目的基因已经成功插入到菊花品种山城之光的基因组中，总转化率为3.85％。

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007

1234187246572142592

1 孙庆春;郑成淑;丰震;菊花转基因性状改良的研究进展[A];2008园艺学进展（第八辑）——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年 1 白新祥,戴思兰反义RNA技术在花色育种中的应用[J];植物学通报;2005年03期 2 蒋细旺,包满珠,吴家和,张献龙,田颖川农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花[J];园艺学报;2005年01期 3 郑丽,李名扬,晁岳恩,裴炎根癌农杆菌介导ipt基因对切花菊的遗传转化[J];农业生物技术学报;2005年01期 4 卢钰,刘军,丰震,张美蓉,韩进,杨传强菊花育种研究现状及今后的研究方向[J];山东农业大学学报(自然科学版);2004年01期 5 贾效成,李美茹,陈贻竹蓝色玫瑰研究进展[J];生物学通报;2003年09期 6 王紫萱,易自力卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基因的生物安全性评价[J];中国生物工程杂志;2003年06期 7 李宪利,袁志友,高东升高等植物成花分子机理研究现状及展望[J];西北植物学报;2002年01期 8 滕年军,陈发棣基因工程在花卉遗传改良中的应用研究[J];植物学通报;2002年05期 9 戴思兰,王文奎,黄家平菊属系统学及菊花起源的研究进展[J];北京林业大学学报;2002年Z1期 10 于晓南,张启翔观赏植物的花色素苷与花色[J];林业科学;2002年03期