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这个细菌太棘手：质谱搞不定，生化鉴定无反应

花匠小妙招
2024-10-30 10:07

作者 | 吴亮亮龙心梁棉棉单位 | 广东阳春市中医院

前言

目前，微生物自动化鉴定仪器已经得到了广泛的应用，细菌鉴定过程呈现出高度规范化的趋势，其准确性亦得到了显著的提升。近年来，质谱技术与分子测序技术的崛起，似乎将我们推入了一个精准医学的时代。

然而，全自动细菌鉴定仪并非无所不能。对于那些代谢缓慢、生化反应弱的细菌，其准确鉴定仍面临诸多挑战。即便诸如质谱、分子测序等高端技术，也存在着技术上的瑕疵，对于近缘菌、罕见菌等种类，其鉴定准确性也难以保证。

图源：pixabay

近期，笔者遇到一特殊案例：从血培养分离出来的细菌，在生化药敏鉴定板培养48小时上无反应，两天多次做质谱结果却大相径庭，而且均是超低分，实在是棘手。

案例经过

现病史：患者，男性，70岁，半天前无明显诱因开始恶寒发热，少许咳嗽，咯黄黏痰，量少，活动后稍气促,于2023-11-11入我院肺病科治疗。

既往史：患者9年前因鼻咽癌在外院行放化疗（具体不详），目前遗留言语含糊、饮食稍呛咳。患者存在高血压病史多年，自诉口服降压药物（具体不详）治疗。否认肝炎、结核等急、慢性传染病病史，否认重大外伤、输血及手术史，否认药物、食物过敏史。

入院查体：T 37.7℃，P 97次/分，R 22次/分，BP 84/55mmHg。患者神清，精神疲倦，发育正常，营养一般，言语含糊，对答切题。双肺呼吸音粗，可闻及少量湿性啰音，未闻及干啰音及胸膜摩擦音。余基本未见异常。

诊疗经过：

2023-11-11

血常规组合:白细胞(WBC) 12.54×10^9/L↑，中性粒细胞百分比(NEU%) 90.2%↑，红细胞(RBC) 3.33×10^12/L↓，血红蛋白(HGB) 98g/L↓（图1）；肾代谢:尿素(BUN) 7.55mmol/L↑，肌酐(Cr) 108μmol/L↑；超敏C反应蛋白(hs-CRP) 17.7mg/L↑；

血气分析组合:酸碱度(xpH) 7.379，二氧化碳分压(pCO2) 33.6mmHg↓，氧分压(pO2) 58mmHg↓，氧分压与吸氧量比(pO2/FIO2) 142mmHg↓，吸入氧比率(FIO2) 0.41(x.xx)；凝血四项、血清电解质、肝酶组合、肝代谢、血浆D-二聚体测定、B型钠尿肽前体、心肌损伤标志物、感染性疾病筛查结果未见明显异常。

图1

胸部CT：右肺中叶、左肺上叶下舌段及双肺下叶慢性炎症。

目前考虑肺炎，治疗上，暂予注射用头孢他啶静滴抗感染，其余予止咳化痰、退热等对症支持治疗；患者复查血气分析提示氧合指数较前升高，暂继续予低流量吸氧，必要时予无创呼吸。

2023-11-14

血常规组合:白细胞(WBC) 5.64×10^9/L；超敏C反应蛋白测定:超敏C反应蛋白(hs-CRP) 8.9mg/L↑；血液培养（左脚血液）:培养出革兰阴性杆菌。患者目前症状好转，可继续予头孢他啶抗感染，待药敏结果出来后再考虑是否更换抗生素，其余继续予吸氧、止咳化痰等对症治疗。

2023-11-16

目前患者病情好转，不适症状明显改善，今日患者及家属要求出院，经请示科室主任后并交代注意事项后带药出院。

2023-11-22

左脚血培养检出：洛菲不动杆菌

案例分析

2023年11月14日，肺病科患者左脚血培养报阳后，笔者在生物安全柜内将血液用注射器抽出，转种于血平板和麦康凯平板，并同时涂片进行革兰染色镜检，该细菌为革兰阴性杆菌（图2）。

图2

根据专家共识的报告分级，血培养报警后，涂片结果是一级报告。一般是1 h内发出。快速鉴定和直接药敏结果是二级报告。最终鉴定和正式药敏结果是三级报告，即最终报告[1]。

在确认血培养中生长的细菌为革兰阴性杆菌后，笔者迅速审核了相关结果，并立即通过电话将这一重要信息告知了临床医生，历时20分钟。患者目前正在接受头孢他啶的抗感染治疗，其病情已显著改善，且头孢他啶对抗革兰阴性菌的有效性已得到证实。因此，临床继续使用头孢他啶进行抗感染治疗，待药敏测试结果出来后再考虑是否需要更换抗生素。

经过24小时的培养，细菌在血平板上长成：圆形、凸起、光滑、不透明的粘液型小菌落，如图3。

图3

该细菌在麦康凯平板上不生长，如图4。

图4

革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，用美华MA120非发酵药敏鉴定板进行鉴定。24小时后，生化反应未发现变化，同时阳性对照孔也无细菌生长，将培养时间延长至48小时后，依然如此。

为了对该细菌进行确诊，我们对菌落进行了分纯保留，然后将原始平板送至外院进行进一步的检测。

本菌的鉴定过程耗时较长，笔者在将标本送至外院进行检测前，积极与临床医生进行了沟通。临床医生表示理解并支持我们的工作。为了深入了解病因，临床医生再次对患者进行了详细的询问，了解到：患者在入院前于家中宰鱼，不慎割伤手部，此后他出现了高热的症状。然而，此事是否与血液感染有关仍存疑虑，具体原因有待进一步调查。

由于细菌已进入衰亡期，为了确保检测结果的准确性和可靠性，外院的检验团队对该细菌进行分纯后，进行了质谱分析。遗憾的是，经过连续两天的多次质谱分析，得分始终维持在4-5分之间，且结果均存在较大差异，令人感到十分困惑。（图5-6）

图5 第一天质谱结果

图6 第二天质谱结果

该细菌富含黏液，其细胞外的荚膜蛋白成分可能会对胞内蛋白的分析产生干扰，从而导致鉴定结果的不稳定。这可能是质谱鉴定得分较低的原因之一。鉴于质谱结果的不可靠性，外院检验团队不得不继续采用生化鉴定方法。在历经两次梅里埃生化鉴定的严谨审查之后，终于成功地确认了此细菌的身份——洛菲不动杆菌（图7）。

图7

同时，笔者亦对纯化后的细菌进行了详尽的生化鉴定。经过长达72小时的培养，鉴定结果也同样为洛菲不动杆菌（图8）。洛菲不动杆菌在Simmons枸橼酸盐琼脂上不生长,不分解D-葡萄糖产酸，不产生β-木糖苷酶和γ谷氨酰转移酶，不液化明胶，不溶解马和羊血[2]，该细菌生化反应均符合洛菲不动杆菌特征。且该细菌与陈东科老师《实用临床微生物学检验与图谱》中洛菲不动杆菌的光滑型菌落图高度相似。

生化鉴定和菌落形态，均符合洛菲不动杆菌。笔者审核结果，并电话通知临床。

图8

洛菲不动杆菌广泛分布于水、土壤、人体皮肤、口腔黏膜呼吸道和生殖泌尿道等部位，通常情况下不致病。流行病学调查显示引起洛菲不动杆菌感染的原因主要为 : 1. 重症患者，免疫力低下；2.广谱抗生素广泛应用，如3代头孢、碳青霉烯类；3.侵入性治疗大量开展，尤其是机械通气[3]。患者9年前因鼻咽癌在外院行放化疗，免疫力低下，属于洛菲不动杆菌的易感人群。

洛菲不动杆菌具有引起下呼吸道感染的潜在危险，在严重情况下甚至可能引发肺炎。然而，其病原性远不止于此，还可能导致尿路感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症以及烧伤创面的感染。因此，洛菲不动杆菌被视为医源性感染领域中不可忽视的重要病原体之一。[4]

鉴于洛菲不动杆菌普遍存在于土壤或水中，且近年来不断有水生动物感染洛菲不动杆菌致病的报道[5-6]，如鼠、鸭感染洛菲不动杆菌死亡、奶牛生乳中分离出洛菲不动杆菌、兔感染洛菲不动杆菌死亡，以及2016-2017 年四川省普遍发生裂腹鱼(Schizothoraxsp.)因感染洛菲不动杆菌造成皮肤溃烂和内脏出血[7]。

结合患者因宰鱼而引发的手部受伤情况，考虑患者可能是因为接触了被洛菲不动杆菌感染的鱼类而遭受传染。

尽管细菌最终确定为洛菲不动杆菌，但本案例仍存在一个疑点：该细菌是否为污染菌？

该患者同时送了左脚和右脚血液进行培养，但只有左脚血液报阳。

根据专家共识：两瓶血培养出现一瓶阳性，一瓶阴性，应首先分析细菌的种类。若检出皮肤定植菌，一般考虑是污染菌；若检出革兰阴性杆菌倾向于感染。[1]

该菌属于革兰阴性杆菌，倾向于感染。且该患者白细胞(WBC)12.54×10^9/L↑，中性粒细胞百分比(NEU%) 90.2%↑，超敏C反应蛋白(hs-CRP)17.7mg/L↑，均提示患者目前有细菌感染。我们就此问题与临床进行了沟通，临床也倾向于认定该菌是病原菌。

知识拓展

从血培养中分离到的细菌，除了是病原菌外，还有可能是标本采集或转运过程中进入培养瓶的非致病微生物。常见污染菌包括痤疮丙酸杆菌（目前名为Cutibacterium acnes，痤疮皮肤杆菌）、微球菌属、芽孢杆菌属（不包括炭疽芽孢杆菌）、凝固酶阴性葡萄球菌（不包括路邓葡萄球菌）、气球菌属、棒杆菌属（不包括杰氏棒杆菌）等。[1]

通常情况下，那些定居于人体皮肤表层及其毛囊内的细菌，有可能在采集过程中潜入血培养瓶，从而引发假阳性的结果。

图源：pixabay

当血培养单次阳性瓶检出金黄色葡萄球菌或其他条件致病菌时，我们建议与临床医生和实验室人员展开深入沟通，共同分析病情。在综合评估的基础上，可以考虑重复采血培养以获取更准确的结果。

若两瓶均为阳性但检出不同细菌，例如阳性杆菌和微球菌，我们认为这可能是污染菌的存在。对于这种情况，我们建议再次采集血液样本进行培养。若其中一瓶为金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌等常见致病菌，而另一瓶则为皮肤定植菌，我们也建议及时与临床医生沟通，以便更好地了解病情并制定相应的治疗方案。

案例总结

从2023年11月14日在血培养标本中检出一种革兰阴性杆菌，到2023年11月22日最终确认该菌为洛菲不动杆菌，历经长达8天的时间。尽管在这样艰难的鉴定过程中，临床方面或许难免会有些许抱怨，但我们必须承认，检验科微生物室在这方面已经付出了极大的努力。面对如此难以捉摸的细菌，我们有责任寻求更有效的解决方案，以期能够取得突破性的进展。

此案例再次证实了血培养一级报告的重要性，临床医生根据涂片结果进行经验性用药，这对于患者迅速康复具有显著的促进作用。

专家点评

广东阳春市中医检院验科副主任技师：李锋

血培养阳性属于危急值，对患者的健康至关重要。血培养报警后，我们需结合临床和实验室数据来判断是否为病原菌。一旦确认为病原菌，我们需在一小时内将革兰染色结果涂片报告临床，为临床用药方案的制订提供方向。

在该案例中，微生物人员在发现血培养细菌后，及时上报，并在鉴定细菌遇到困难时能够与临床保持良好沟通，及时将样本送往上级医院进行鉴定，整体表现非常出色。

参考文献：

[1]2022【指南与共识】血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识

[2]陈东科等主编，实用临床微生物学检验与图谱，北京：人民卫生出版社，2011:633—633.

[3]王蕾蕾，尚涛；孕产妇洛菲不动杆菌致无症状菌尿及产后出血 1例报告并文献复习；中国医学工程；第20卷第8期 2012年8月

[4]濮本恒华群；97株洛菲不动杆菌的分布及耐药分析；中国厂矿医学2009年12月第22卷第6期

[5] CAO S Q, GENG Y, YU Z H, et al. Acinetobacter lwoffii, an e⁃ merging pathogen for fish in Schizothorax genus in China [ J ]. Transboundary and Emerging Diseases, 2018, 65 ( 6 ): 1816 - 1822.

[6] 李成伟, 王均, 苏航, 等. 黑斑蛙腐皮病病原分离､鉴定及致病性研究 [J]. 江苏农业科学, 2020, 48(17): 174 - 178. LI C W, WANG J, SU Hang, et al. Isolation, identification and pathogenicity of pathogen from skin fester disease of Pelophylax nigro⁃ maculatus [ J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2020, 48 ( 17 ): 174 - 178.

[7]彭志锋, 张菡等:野生疣鼻天鹅洛菲不动杆菌的分离鉴定与药物敏感性分析;野生动物学报报 Chinese Journal of Wildlife 2022, 43 (4): 1089 -1093

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编辑：徐少卿审校：陈雪礼