黄秋葵花多糖的结构、免疫调节活性及机制研究
黄秋葵花多糖的结构、免疫调节活性及机制研究
【摘要】： 黄秋葵(Abelmoschus esculentus L.)为锦葵科秋葵属一年生草本植物,其全身是宝,果、花和叶皆可食用。黄秋葵花资源丰富,目前仅部分用于制作花茶等粗加工产品,其余被丢弃,造成了资源的浪费。本课题组前期研究发现,黄秋葵花营养丰富,富含多糖和黄酮等活性成分,值得深度研究和开发。多糖是黄秋葵花中的主要活性物质之一,具有免疫调节、抗氧化和肠道菌群调节等多种生物活性。然而,目前对黄秋葵花多糖的研究主要集中于提取分离及初步结构分析,缺乏对其分离纯化以及结构鉴定的系统研究;未见其体内免疫调节活性以及通过体内和体外两方面研究免疫机制的研究报道。鉴于此,本论文对黄秋葵花多糖进行分离纯化,制备获得其纯化组分,并采用多种现代分析手段对其理化性质和结构进行表征;采用体内、体外模型和转录组学,揭示黄秋葵花多糖的免疫调节活性及分子机制。本研究可为黄秋葵花多糖的研究和应用提供科学依据,为黄秋葵花的资源化利用提供新途径。主要研究内容如下:(1)黄秋葵花多糖的提取、纯化和理化性质分析。采用水提醇沉、DEAE-52与Sephacryl~(TM) S-500柱纯化,制备获得黄秋葵花多糖纯化组分AEFP22,其中性糖含量为64.16%,糖醛酸含量为35.68%;HPSEC鉴定发现其为均一对称峰,重均分子量为2.741×10~5 Da;流变性测定发现其溶液出现剪切稀化,为典型的假塑性流体;Zeta电位测定结果显示其电位值为-7.04 m V,且其在溶液中发生分子团聚,平均粒度分布围绕在228.3 nm处;热重分析表明其具有较好的热稳定性。(2)AEFP22的结构解析。采用多种现代分析技术(NMR、GC-MS、HPLC、IR、SEM和AFM等)和刚果红实验鉴定其结构。IR结果显示其具有一般多糖的红外特征吸收峰,且为酸性吡喃糖;PMP-HPLC鉴定发现其由Rha、Gal A和Gal组成,摩尔比为1:1.02:0.86;GC-MS结合NMR解析获得其链结构如下:a:b=1:6.5其具有三股螺旋结构,分子间相互缠绕,呈不规则团聚状态,分子链高度为0.5-2 nm,且为无定型结构。(3)AEFP22的体内免疫调节活性研究。采用CTX致免疫抑制小鼠模型研究其对小鼠的免疫器官、非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫等的影响。结果显示,60和120 mg/kg BW/day剂量AEFP22可显著提高脾脏与胸腺指数(p<0.01),改善CTX诱导的脾脏、胸腺的组织病变;30、60和120 mg/kg BW/day剂量AEFP22可显著增强CTX致免疫抑制小鼠的单核-巨噬细胞功能(p<0.05);60和120 mg/kg BW/day剂量AEFP22可显著提高血清溶血素和免疫球蛋白水平(p<0.05),显著提高迟发型超敏反应强度、血清细胞因子及NO水平(p<0.05),显著增强免疫抑制小鼠血清、肝脏和肾脏中的GSH-Px、SOD和CAT活力,降低MDA含量(p<0.05);表明AEFP22对CTX致免疫抑制小鼠有较好的免疫调节活性。(4)AEFP22的体内免疫调节机制研究。基于转录组学探讨AEFP22对免疫抑制小鼠脾脏基因表达的影响,推测其可能的分子机制,并进行分子生物学验证。差异表达基因(DEGs)分析结果发现,Model vs AEFP22组和Normal vs Model组分别含有43和47个免疫相关DEGs,且大部分DEGs在两组中呈相反的调节趋势,可见,这些反向调节的DEGs可能为AEFP22免疫调节作用的潜在调节位点;GO分析显示,这些DEGs主要参与T和B细胞增殖和分化、巨噬细胞功能、免疫球蛋白和细胞因子分泌、髓细胞分化和特定通路调控;KEGG富集分析显示,AEFP22主要影响MAPK、抗原处理、提呈和补体系统通路来发挥免疫调节作用;经RT-PCR验证转录组学结果可靠,western-blot验证信号通路关键蛋白的表达变化情况,推测AEFP22通过影响TLRs-MAPK-NF-κB信号通路,进而发挥免疫调节活性。(5)AEFP22的体外免疫调节机制研究。采用小鼠体外脾细胞模型研究发现,62.5、125和250μg/m L剂量AEFP22可极显著增强脾细胞活力(p<0.01);62.5、125和250μg/m L剂量AEFP22可显著提高细胞G_2/M与S+G_2/M期的比例(p<0.05),可与Con A/LPS协同作用,促进脾淋巴细胞增殖(p<0.05);250μg/m L剂量AEFP22可极显著提升CD4~+T细胞,CD19~+B细胞比例(p<0.01),促进脾淋巴细胞分化;125和250μg/m L剂量AEFP22可显著提高脾淋巴细胞IL-2、IL-4、IFN-γ、Ig A、Ig G、Ig M和NO水平(p<0.05);RT-PCR结果显示,250μg/m L剂量AEFP22可极显著促进i NOS、TLR4、My D88和TRAF6 m RNA的表达(p<0.01);阻断前后western-blot结果显示,250μg/m L剂量AEFP22可通过促进TLR4、My D88、TRAF6的蛋白表达,提升ERK、JNK、p38的磷酸化水平,促进转录因子NF-κB的入核转运,激活TLR4-MAPK-NF-κB信号通路发挥免疫调节作用。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2021
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