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响应槲皮素诱导的美国白蛾GST基因鉴定及表达分析

花匠小妙招
2024-11-02 09:45

植物通过产生多种多样的次生代谢物质抵御植食性昆虫的取食和危害。槲皮素是植物中广泛分布的一种黄酮类次生代谢物质，在植物的抗虫过程中发挥重要作用[1]。例如，槲皮素显著降低瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae）的孵化率、化蛹率和羽化率[2]；对棉铃虫（Helicoverpa armigera）[3]和亚洲小车蝗（Oedaleus asiaticus）[4]的生长发育和存活均产生不利影响。同时，植食性昆虫也进化出一套以解毒酶系为主的反防御机制以减轻或避免次生代谢物质的毒害，从而提高对寄主的适应能力[5]。

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是昆虫体内关键的解毒酶之一，属于超基因家族酶系，主要分布在昆虫的中肠、马氏管和脂肪体中[6−7]。GSTs通过催化还原型谷胱甘肽与疏水性有毒物质进行轭合反应，使有毒化合物的水溶性增加，从而更容易排出体外，最终达到解毒的作用[8]。研究表明槲皮素可以诱导昆虫的GSTs活性和基因的转录表达。高希武等[9]使用添加0.01%槲皮素的人工饲料连续饲养棉铃虫1到4代，发现棉铃虫中肠的GSTs活性升高了4 ~ 18倍；进一步研究表明槲皮素诱导GST基因的上调表达是导致GSTs活性增加的主要机制[10]。Zhang等[11]的研究发现0.5%和1.0%的槲皮素能显著诱导家蚕（Bombyx mori）中肠GSTs的活性，其中一个GST基因（GSTe8）的表达水平显著上调。牟少飞等[12]的研究发现，低剂量（0.01%）的槲皮素诱导B型烟粉虱（Bemisia tabaci）的GSTs活性，而较高剂量（0.1%和1.0%）的槲皮素却抑制GSTs的活性。也有研究发现槲皮素（0.1 mmol/L）抑制杨扇舟蛾（Clostera anachoreta）头部和中肠的GSTs活性[13]。可见槲皮素对不同的昆虫作用不同，不同剂量的槲皮素对同一昆虫作用也不同。

美国白蛾（Hyphantria cunea）属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Erebidae）（原灯蛾科Arctiidae）[14]，是我国重大外来入侵物种，也是典型的多食性害虫[15]。美国白蛾在世界范围内的寄主植物有630多种[16]，在我国有300多种[17]。为阐明美国白蛾对寄主植物中槲皮素的适应策略，我们前期开展了槲皮素对美国白蛾幼虫生长发育及解毒酶活性影响的研究。结果表明：0.5%的槲皮素能显著降低美国白蛾幼虫的存活率、化蛹率和性比，延长幼虫的各发育历期；同时显著诱导了GSTs、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ABC transporters） 3种解毒酶的活性，推测美国白蛾通过诱导解毒酶的活性来增强对食物中槲皮素的降解能力[18]。为进一步明确美国白蛾GST基因响应槲皮素诱导的转录表达模式，我们构建了0.5%槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组（未发表，Genbank登录号：PRJNA798672），通过筛选和鉴定转录组中显著响应槲皮素诱导的GST基因，对这些GST基因进行系统发育分析，并通过荧光定量PCR技术研究槲皮素对这些GST基因诱导的剂量效应和时间效应，为探明GST基因在美国白蛾解毒和适应槲皮素中发挥的作用奠定理论基础，同时也有助于揭示美国白蛾的寄主适应机制和多食性的生存策略。

1. 材料与方法

1.1 槲皮素人工饲料的配制

依据槲皮素对美国白蛾毒力测定的研究结果[18]，以及美国白蛾喜食寄主桑中槲皮素的浓度范围[19−20]，本研究将槲皮素的诱导质量分数范围设置为0.5% ~ 4.0%。在室温下，称取0.1677 g槲皮素（纯度 ≥ 98%；源叶生物，上海）溶于5 mL 20%的二甲基亚砜（DMSO；百瑞极，北京）溶液中。将上述溶液加入15 g刚配制完的液体人工饲料中，混合均匀，分装倒入养虫盒（100 mL），因人工饲料中添加了琼脂，待其冷却，0.5%的固体槲皮素人工饲料配制完成。按比例增加槲皮素的含量，以同样方法配制1.0%、2.0%、4.0%的槲皮素人工饲料，以添加5 mL 20% DMSO溶液的人工饲料作为对照饲料（CK）。

1.2 供试昆虫及处理

美国白蛾幼虫为实验室人工饲养种群，采用人工饲料饲养，人工饲料的配制参照文献[21]。饲养条件设定为：温度（25 ± 1） ℃，湿度55% ~ 70%，光周期16L∶8D。

取健康的刚蜕皮的4龄幼虫，饥饿处理12 h后，分别转入不同质量分数的槲皮素人工饲料（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）和对照饲料（CK），饲养24 h后收集试虫。10头幼虫为一个重复，设置3个生物学重复。另外，再取一批健康的刚蜕皮的4龄幼虫，饥饿处理12 h后，转入0.5%的槲皮素人工饲料和对照饲料（CK），饲养24、36、48、72和96 h后分别收集试虫。10头幼虫为一个重复，设置3个生物学重复。收集的所有试虫，均保存于−80 ℃冰箱用于逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。

1.3 响应槲皮素诱导的GST基因的筛选与鉴定

本研究基于前期构建的0.5%槲皮素诱导和正常饲养的美国白蛾中肠转录组（GenBank 登录号：PRJNA798672，未发表），在得到的差异表达基因注释结果中，通过查找“glutathione-S-transferase”关键词，获得显著响应槲皮素诱导的候选GST基因。通过NCBI的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测候选GST基因的开放阅读框（open reading frame，ORF），并翻译成氨基酸序列用于后续构建系统发育树。通过与NCBI的NR数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行BLASTX比对，鉴定候选GST基因是否为对应的GST基因。

1.4 GST基因系统发育分析

使用MEGA X软件[22]将鉴定的GST氨基酸序列分别与7种鳞翅目昆虫（家蚕Bombyx mori、棉铃虫Helicoverpa armigera、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、斜纹夜蛾Spodoptera litura、粉纹夜蛾Trichoplusia ni、柑橘凤蝶Papilio xuthus、甜菜夜蛾Spodoptera exigua）的GST氨基酸序列进行多序列比对。使用PhyloSuite软件[23]中的IQ-TREE程序[24]，采用最大似然法构建系统发育树，各分支的置信度经由bootstrap 法1000次循环检验[25−26]。使用在线工具 iTOL（https://itol.embl.de/）对发育树进行美化。

1.5 RT-qPCR检测

将1.2中保存的试虫置于冰上解冻，解剖取出中肠进行RNA提取。按照RNeasy ® Plus Mini Kit（QIAGEN，德国）试剂盒的说明书分别提取不同质量分数槲皮素处理24 h样品和0.5%槲皮素处理不同时间样品的总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，使用超微量紫外分光光度计NanoDrop8000（Thermo，美国）检测RNA的浓度和纯度。将完整性、纯度和浓度均合格的RNA按照PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（宝生物，大连）的说明书合成cDNA第一链，作为RT-qPCR实验的模板，保存于−20 ℃冰箱备用。

使用Primer Premier 5.0软件设计GST基因的RT-qPCR引物，GAPDH和EF1α作为内参基因[27]，引物均由生工生物（上海）合成。通过10倍梯度稀释cDNA 模板的方法，计算各引物的扩增效率，经验证，符合要求的引物序列见表1。根据TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒（宝生物，大连）配制RT-qPCR反应体系（25 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板2 μL，灭菌水8.5 μL。热循环条件设定为 95 ℃预变性30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循环40次。最后将RT-qPCR产物升温至95 ℃制作溶解曲线，检测是否有引物二聚体。空白对照以无菌水代替 cDNA 模板，用于检测体系是否出现污染。RT-qPCR反应在CFX96（Bio-Rad，美国）PCR仪中运行。每个处理设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。

表 1 RT-qPCR引物序列信息

Table 1. RT-qPCR primer sequence information

基因
Gene 引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′−3′) 扩增效率
Amplification efficiency/% 相关系数
Correlation coefficient HcGST-E1 F-CGAGAGCAAGACACACCTGA
R-ATAGAGACGCGTGCTTTGGT 93.2 0.997 HcGST-E3 F-ACCCGCTACATACTATCCCGA
R-AACGTTGATCCACTGTCGCT 110.0 0.996 HcGST-S1 F-ATGTGAGGGCTTTAGGTGAGG
R-TCAGCCCATTGTTCAGGAGTT 96.2 0.997 HcGST-S2 F-CGGTAGCATGGTCGACTACTT
R-ACGGACTTTCTTGAGGGCAG 93.3 0.994 HcGST-O1 F-GGTGATCCACTCCCGTCATAC
R-GGCATTAAGCGCCAAGACAG 103.4 0.996 GAPDH F-GACTGGCATGGCTTTCAGAG
R-CATCGTAGCTAGCGGGTTTG 96.5 0.999 EF1α F-TTATCGTCGCTGCTGGTACT
R-GAGTGTGAAAGCGAGCAGAG 103.5 0.999 1.6 数据分析

采用2−ΔΔCT法[28]计算每个基因的相对表达量。数据均以平均值 ± 标准误表示，采用单因素方差分析不同质量分数槲皮素诱导后GST基因相对表达量的差异显著性，并使用Tukey法进行多重比较（P < 0.05）。使用独立样本t检验分析RT-qPCR验证结果和槲皮素诱导不同时间GST基因相对表达量的差异显著性（P < 0.05）。采用Excel 2019统计分析数据。采用GraphPad Prism 8.0作图和分析差异显著性。

2. 结果与分析

2.1 响应槲皮素诱导的GST基因的筛选与鉴定

从转录组间的差异表达基因中，共筛选出6个显著响应槲皮素诱导的GST基因。经BLASTX鉴定，6个GST基因均为美国白蛾中新鉴定的GST基因，鉴定结果见表2。6个GST均具有完整的ORF，编码蛋白质长度范围为203 ~ 283个氨基酸。根据GST基因被发现的顺序和系统发育树聚类结果，GST基因分别被命名为HcGST-E1、HcGST-E2、HcGST-E3、HcGST-S1、HcGST-S2和HcGST-O1。6个基因的序列信息均已提交至NCBI数据库，GeneBank登录号为OM287126、OM323334 ~ OM323338。在0.5%槲皮素的诱导下，HcGST-E1、HcGST-E3和HcGST-O1显著上调表达，HcGST-S1和HcGST-S2显著下调表达。

表 2 响应槲皮素诱导的美国白蛾GST基因的BLASTX结果

Table 2. BLASTX results of quercetin-induced GST genes in Hyphantria cunea

基因名称
Gene name 登录号
Accession
No. 转录水平
Transcription level 编码蛋白长度
Encoded protein
length/aa 同源性比较最佳匹配结果 Homology comparison of best match result 蛋白质名称
Protein name 物种
Species E值
E value 一致性
Identity/% 登录号
Accession
No. HcGST-E1 OM323338 表达上调2.02倍
Up-regulated
expression 2.02 times 228 Glutathione-S-
transferase epsilon 海灰翅夜蛾
Spodoptera
littoralis 4.00 × e−123 73.68 AYM01156.1 HcGST-E2 OM323336 表达下调0.34倍
Down-regulated
expression 0.34 times 216 Glutathione S-
transferase
epsilon 13 甜菜夜蛾
Spodoptera
exigua 1.00 × e−113 72.64 ASN63944.1 HcGST-E3 OM323337 表达上调10.26倍
Up-regulated
expression 10.26 times 216 Glutathione S-
transferase 1 烟草天蛾
Manduca sexta 2.00 × e−103 65.28 XP_030020682.1 HcGST-S1 OM287126 表达下调0.29倍
Down-regulated
expression 0.29 times 203 Glutathione S-
transferase 2-like 棉铃虫
Helicoverpa
armigera 2.00 × e−81 61.76 XP_021186026.1 HcGST-S2 OM323334 表达下调0.19倍
Down-regulated
expression 0.19 times 204 Glutathione S-
transferase
sigma 4 甜菜夜蛾
Spodoptera
exigua 2.00 × e−93 65.84 ASN63950.1 HcGST-O1 OM323335 表达上调2.17倍
Up-regulated
expression 2.17 times 284 Glutathione S-
transferase 8 小线角木蠹蛾
Streltzoviella
insularis 3.00 × e−116 60.34 QLI62204.1 2.2 6个GST基因系统发育分析

了解GST基因的家族分类，有助于深入分析每个基因的具体功能。本研究构建了美国白蛾6个GST基因与其他7种鳞翅目昆虫GST基因的系统发育树，结果如图1所示。系统发育树显示，6个显著响应槲皮素诱导的GST基因主要分布在Epsilon、Sigma和Omega 3类胞质型GST家族。其中，HcGST-E1、HcGST-E2、HcGST-E3属于GST Epsilon家族，HcGST-S1、HcGST-S2属于GST Sigma家族，HcGST-O1属于GST Omega家族。

图 1 美国白蛾与其他鳞翅目昆虫的GST基因系统发育树

Bm.家蚕；Ha.棉铃虫；Sf.草地贪夜蛾；Sl.斜纹夜蛾；Tn.粉纹夜蛾；Px.柑橘凤蝶；Se.甜菜夜蛾；Hc.美国白蛾。不同颜色代表不同GST基因家族；红色字体基因代表本研究鉴定的6条GST基因。节点处的数值为分支支持度。Bm, Bombyx mori; Ha, Helicoverpa armigera; Sf, Spodoptera frugiperda; Sl, Spodoptera litura; Tn, Trichoplusia ni; Px, Papilio xuthus; Se, Spodoptera exigua; Hc, Hyphantria cunea. Different colors represent different GST gene families. The red font genes represent the 6 GST genes identified in this study. The values at the node indicate branch support.

Figure 1. Phylogenetic tree of GST genes of Hyphantria cunea and other lepidoptera insects

2.3 槲皮素对美国白蛾GST基因诱导的剂量效应

由于设计的HcGST-E2的引物扩增效率不符合RT-qPCR实验要求，因此本研究只测定了槲皮素对5个GST基因的诱导剂量效应。5个GST基因在不同质量分数槲皮素诱导后的相对表达量如图2所示。各实验质量分数（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%）槲皮素均能显著诱导HcGST-E1的上调表达（图2a），而且随着槲皮素质量分数升高表达水平也逐渐升高。0.5%、1.0%、2.0%槲皮素显著上调HcGST-E3的表达水平（图2b）；这两个基因的表达水平均在2.0%槲皮素下达到最高，分别为对照组的3.07倍（P < 0.000 1）和4.22倍（P < 0.000 1）。HcGST-O1只在0.5%槲皮素诱导下显著上调表达，为对照组的1.74倍（P < 0.01）（图2c）。然而，HcGST-S1和 HcGST-S2被不同质量分数槲皮素诱导后下调表达，HcGST-S1在4.0%槲皮素下表达水平最低，为对照组的0.16倍（P < 0.01）（图2d）；0.5%和1.0%槲皮素显著下调HcGST-S2的表达水平，在0.5%槲皮素下表达水平最低，为对照组的0.15倍（P < 0.000 1）（图2e）。可见，不同质量分数槲皮素对各GST基因的诱导作用不同。

图 2 不同质量分数槲皮素诱导24 h后美国白蛾5个GST基因的相对表达水平

条形柱上的*代表不同质量分数槲皮素诱导后，GST基因相对表达量与对照组差异显著，*代表P < 0.05，**代表P < 0.01，***代表P < 0.001，****代表P < 0.000 1。下同。The * on the bar represents that the relative expression level of GST gene is significantly different from the control after induction with different mass fractions of quercetin. * represents P < 0.05, ** represents P < 0.01, *** represents P < 0.001, **** represents P <0.000 1. The same below.

Figure 2. Relative expression level of five GST genes of Hyphantria cunea after 24 h induction with different mass fractions of quercetin

本研究比较了0.5%槲皮素诱导美国白蛾中肠GST基因的表达水平与转录组（0.5%槲皮素诱导）中差异表达GST基因的表达水平，结果如图3所示。在0.5%槲皮素下，除了HcGST-E3，RT-qPCR中其余GST基因的表达水平变化倍数与RNA-seq中的基本一致。虽然HcGST-E3在转录组中的表达水平显著高于RT-qPCR中的上调倍数（P < 0.000 1），但二者与对照组相比均表现为上调表达趋势，这些结果验证了转录组数据的可靠性。

图 3 0.5%槲皮素诱导下美国白蛾中肠GST基因在转录组和RT-qPCR中的表达水平

虚线为对照组（CK）的相对表达水平。ns代表同一基因的两种表达量变化倍数差异不显著。The dotted line is the relative expression level of control group. ns represents there is no significant difference between the two expression multiples of the same gene.

Figure 3. Relative expression level in RNA-seq and RT-qPCR of GST genes in midgut of Hyphantria cunea induced by 0.5% quercetin

2.4 槲皮素对美国白蛾GST基因诱导的时间效应

为探究槲皮素不同诱导时间对美国白蛾中肠GST基因表达的影响，本研究测定了3个上调表达的GST基因被0.5%槲皮素诱导24、36、48、72和96 h后的相对表达量，结果见图4。HcGST-E1在槲皮素诱导24和96 h时显著上调表达，分别为对照组的1.99倍（P < 0.000 1）和1.59倍（P < 0.05）（图4a）。HcGST-E3在槲皮素诱导后24、36和96 h显著上调表达，在36 h时上调表达水平最高，为对照组的10.21倍（P < 0.01），但在72 h时显著下调表达（P < 0.01）（图4b）。HcGST-O1在槲皮素诱导24和36 h时显著上调表达，分别为对照组的1.74倍（P < 0.01）和2.25倍（P < 0.05）（图4c）。可见，3个GST基因往往在较低质量分数槲皮素诱导后的2 ~ 3 d内上调表达，但随着时间的延长，3个基因的表达水平并不总是被诱导上调。

图 4 0.5%槲皮素诱导24 h、36 h、48 h、72 h和96 h后美国白蛾3个GST基因的相对表达水平

Figure 4. Relative expression level of three GST genes of Hyphantria cunea after 24, 36, 48, 72, and 96 h induction with 0.5% quercetin

3. 结论与讨论

昆虫的GSTs在内源和外源化合物的解毒中发挥关键作用，也参与细胞内运输、激素生物合成和预防氧化应激等生物过程[29]。昆虫胞质类GST基因包括Epsilon、Sigma、Omega、Delta、Zeta和Theta家族，Epsilon和Delta家族是昆虫中所特有的[30−31]。本研究从槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组中鉴定出6个差异表达的GST基因，3个为Epsilon家族，2个为Sigma家族，1个为Omega家族。Sun等[32]从核型多角体病毒感染的美国白蛾转录组中鉴定出了18个差异表达的GST基因，其中5个为Epsilon家族，7个为Sigma家族，3个为Delta家族，其余3个为微粒体GST基因。Feng等[33]在黏质沙雷氏菌感染的美国白蛾转录组中鉴定了3个差异表达的GST基因，2个属于Sigma家族，1个属于Epsilon家族。可见，有毒物质或病原等不利因子主要诱导美国白蛾GST基因的Epsilon和Sigma家族成员差异表达。Yamamoto等[34]在体外重组表达了美国白蛾一个Sigma GST基因的蛋白，发现RhcGST能催化谷胱甘肽与GST的通用底物1-氯-2，4-二硝基苯和脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛的反应；该研究还发现，与家蚕[35]的Sigma GST相比，RhcGST对有机磷杀虫剂杀灭硫磷具有更高的亲和力。综上，我们推测美国白蛾这两个家族的GST基因对外源有毒物质的解毒代谢和病原的免疫反应等方面发挥重要作用。在本研究中，一个Omega家族GST基因（HcGST-O1）也显著上调表达，表明该基因可能特异性参与美国白蛾对槲皮素的解毒代谢反应。

本研究发现槲皮素对美国白蛾中肠GST基因的诱导表达具有剂量效应。不同质量分数槲皮素诱导HcGST-E1、HcGST-E3和 HcGST-O1显著上调表达，而抑制HcGST-S1和HcGST-S2的表达。家蚕中肠GSTe8基因只在0.5%和1.0%的槲皮素下被显著诱导表达[11]。杨小舟蛾（Micromelalopha troglodyta）中肠的GST基因MtGSTd2、MtGSTo1和MtGSTs1分别被0.01 mg/g、0.01 ~ 1 mg/g和0.001 ~ 10 mg/g 的单宁酸诱导表达，而MtGSTt1和MtGSTz1被不同剂量单宁酸抑制表达[36]。这些结果表明：不同质量分数槲皮素可能诱导GST家族不同成员参与解毒反应；同时，不同GST家族可能参与不同种类次生物质的解毒代谢。家蚕[37−38]、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）[39−40]和舞毒蛾（Lymantria dispar）[41−42]的GST基因被植物次生物质诱导过表达参与次生代谢物质的胁迫已经被证明。在本研究中，HcGST-E1、HcGST-E3和HcGST-O1能被不同质量分数槲皮素诱导显著上调表达，因此我们推测这3个基因可能是参与美国白蛾解毒代谢槲皮素的关键GST基因。然而，在槲皮素作用下HcGST-S1和HcGST-S2基因下调的机理还有待进一步研究。Han等[43]推测GST基因下调表达可能是一种应激反应，大量的GST基因上调表达需要有部分基因下调以避免对虫体内还原型谷胱甘肽的过量消耗。

在本研究中，3个上调表达的GST基因均在24或36 h内被诱导显著上调表达，其中，2个GST基因在诱导36 h时上调倍数最高，随后3个基因表达水平恢复为对照水平。这与我们前期在生理生化水平得到的研究结果相一致，即0.5%槲皮素诱导36 h时，美国白蛾幼虫中肠的GSTs活性最高[18]。在黏质沙雷氏菌对美国白蛾GST基因表达影响的研究中也发现类似结果，3个GST基因均在黏质沙雷氏菌侵染的20或40 h时显著上调表达，随着时间的延长，GST基因的表达甚至被抑制[33]。本研究中随着诱导时间的延长，HcGST-E1和HcGST-E3在96 h时上调表达，可能是美国白蛾体内槲皮素积累到一定水平再次诱导这两个基因参与解毒代谢。

综上所述，本研究从美国白蛾中肠转录组中鉴定了6个响应槲皮素诱导的GST基因，其中HcGST-E1、HcGST-E3和HcGST-O1的表达水平被不同质量分数槲皮素诱导后显著升高，暗示这些基因是参与美国白蛾解毒代谢槲皮素的关键GST基因。HcGST-E2基因由于引物设计问题没有进一步研究，后期将重新设计引物，对该基因进行系统研究。此外，我们将进一步明确这些基因在美国白蛾各组织中的表达模式，进而克隆关键GST基因的启动子序列，以期明确美国白蛾GST基因对槲皮素解毒代谢的表达调控机制。筛选鉴定的关键GST基因及调控因子可作为害虫防治新靶标，为进一步完善美国白蛾的防控体系提供科学指导和新思路。