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管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析

花匠小妙招
2024-09-16 12:37

管花肉苁蓉Cistanche tubulosa (Schenk) Wight为列当科肉苁蓉属植物，自然分布于新疆南疆[1]，在新疆和田地区大面积人工栽培[2]。管花肉苁蓉具有极高的药用价值，其肉质茎为《中国药典》2020年版收载药材肉苁蓉的来源之一[3]。针对管花肉苁蓉肉质茎的研究日益增多，但是对其花的生物学研究相对较少。管花肉苁蓉花期为4～5月[4]，主要具有白、红、紫3种花色。管花肉苁蓉具有丰富的花色，但是其花色调控机制未见报道。花色与花瓣组织结构、色素的种类、含量与分布有关，受环境因子和遗传因素调控[5]。植物花中的色素主要包括黄酮类化合物、类胡萝卜素和甜菜碱3大类[6]，其中黄酮类化合物作为苯丙烷类的二级代谢产物在植物中广泛存在，能够展现出淡黄色至蓝色，具有最广泛的颜色范围[7]。黄酮类化合物的种类与含量影响许多植物的花色，如芍药Paeonia lactifloraPall.的3个品种中，黄金轮中主要含有查耳酮使花显现为黄色，玉楼红星中主要含有黄酮、黄酮醇使花显现为白色，红艳争辉中主要含有有色的花色素苷使花呈现为紫红色[8]。花色是许多观赏植物的重要特征，也是吸引传粉昆虫的关键因素[9]，研究表明传粉昆虫访问频率最高的为深紫色肉苁蓉植株[10]。对管花肉苁蓉花中黄酮类化合物合成基因进行生物学研究有利于阐明管花肉苁蓉花色调控机制，为利用基因工程技术改良花色提供理论依据，促进其形成更丰富的花色，增加观赏性，扩大应用范围。

黄酮类化合物的生物合成途径起始于苯丙烷途径，苯丙氨酸首先在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）作用下转化为肉桂酸，肉桂酸经肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumarate- coenzyme A ligase，4CL）催化反应生成4-香豆酰辅酶A[11]。1分子的4-香豆酰辅酶A与3分子的丙二酰辅酶A经查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）催化生成柚皮素查耳酮，柚皮素查耳酮具有黄酮类化合物的基本骨架，在查耳酮异构酶、黄烷酮-3-羟化酶、二氢黄酮醇4-还原酶等作用下生成多种黄酮类化合物如异黄酮、黄酮醇、花青素等[12]。CHS作为黄酮类化合物生物合成途径的关键酶，调控植物中黄酮类化合物的含量，对植物花色也有重要调控作用[13]。如日本龙胆Gentiana scabra BungeCHS转录后基因沉默能抑制花色素苷的生物合成并使花冠裂片特异性白化[14]，毛花猕猴桃Actinidia eriantha Benth.CHS基因沉默降低花瓣中花色素苷含量且使红色花瓣颜色变淡[15]。因此，本研究从管花肉苁蓉花中克隆得到1条CtCHS基因，并对其进行生物信息学分析、原核表达与纯化、酶活性分析、亚细胞定位分析及3种颜色花中的表达分析，探究CtCHS蛋白的功能和CtCHS基因的表达模式，初步探索CtCHS与管花肉苁蓉花色的关系，为管花肉苁蓉花色调控机制研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

管花肉苁蓉花于2018年5月采自新疆和田地区于田县，采样时遵循随机原则，选取生理状态良好、株高一致的管花肉苁蓉。白、红、紫3种花色的管花肉苁蓉各取3株，经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为管花肉苁蓉C. tubulosa (Schenk) Wight，经液氮速冻后干冰保存运至北京。大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，大肠杆菌BL21（DE3）化学感受态细胞购自北京全式金生物技术股份有限公司；pET-28a、pCAMBIA1300-35S-GFP载体购自武汉转导生物实验室有限公司。丙二酰辅酶A购自Sigma公司，4-香豆酰辅酶A、柚皮素查耳酮购自上海源叶生物科技有限公司，柚皮素购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器

Nanodrop 2000C分光光度计（Thermo Fisher公司，美国）；梯度PCR仪（Eppendorf公司，德国）；CFX 96荧光定量PCR仪、UVP凝胶成像仪、凝胶电泳仪、蛋白电泳仪（BioRad公司，美国）；EnSpire酶标仪（PerkinElmer公司，美国）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；DHZ-D型大容量全温振荡器（太仓市实验设备厂）；THZ-82A型水浴恒温振荡器（江苏科析仪器有限公司）；AIRTECH超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（TOMY公司，日本）；Milli Q纯水仪（Millipore，美国）；LC-20A高效液相色谱仪（Shimadzu公司，日本）；UPLC-Q-Exactive-Orbitrap高分辨质谱（Thermo Fisher公司，美国）；FV1200激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）。

2 实验方法

2.1 RNA提取与cDNA合成

管花肉苁蓉花经液氮研磨后通过RNA提取试剂盒（Norgen，Cat 17200）提取总RNA，通过NanoDrop 2000C检测RNA浓度和质量，挑选A260/A280比值在1.8～2.1的RNA样品用于逆转录合成cDNA。使用M-MLV逆转录酶（Promega，M170B）将检测合格的总RNA反转录为cDNA，实验操作均按照说明书进行。

2.2 CtCHS基因的克隆

根据本课题组的管花肉苁蓉花转录组数据[16]筛选出1条具有完整开放阅读框的CtCHS，利用SnapGene软件根据基因序列设计特异性引物（表1）。以管花肉苁蓉花cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为2×Phanta Max Buffer 25 mL，dNTP Mix （10 mmol/L）1 mL，上下游引物（10 mmol/L）各2 mL，cDNA 2 mL，Phanta Max Super- Fidelity DNA Polymerase 1 mL，ddH2O 17 mL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃反应延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA纯化试剂盒（诺维赞，Cat DC301-01）进行胶回收，再通过快速克隆试剂盒（诺维赞，Cat C601-01）将回收的DNA片段与pCE2 TA/Blunt-Zero载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃过夜培养后挑选单克隆菌株划线送公司测序。

2.3 生物信息学分析

通过ProtParam在线软件分析蛋白理化性质；利用Prot Scale在线工具分析蛋白亲水性/疏水性；运用在线工具SOPMA预测蛋白二级结构；利用在线分析软件SWISS-MODEL预测蛋白三级结构；采用在线软件TMHMM预测蛋白的跨膜结构；运用DNAMAN软件将CtCHS与其他物种CHS氨基酸序列进行同源性比对；利用MEGA-X软件构建系统进化树，采用邻接法（neighbor-joining，NJ），通过泊松校正法计算进化距离，Bootstrap重复次数为1000次。

2.4 CtCHS原核表达与纯化

根据CtCHS序列设计带有酶切位点BamH Ⅰ、XhoⅠ的引物，PCR扩增相应目的片段。利用内切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ酶切pET-28a载体和目的片段，通过5 min Universal Ligation Mix（诺维赞，Cat C311-01）连接目的片段与载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单克隆菌株测序，测序正确后提取质粒。将测序验证后的pET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，参考丁宁等[17]的方法以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）低温诱导蛋白表达并通过Ni2+亲和色谱柱（Cytiva，Cat 17531901）纯化蛋白，经超滤管（Millipore，30 000）离心浓缩蛋白并脱盐后保存于20 mmol/L KPB缓冲液（pH 8.0，含1 mmol/L EDTA）中，置于−80 ℃冰箱长期保存备用。

2.5 CtCHS酶活性分析

CtCHS酶反应体系：100 mmol/L KPB（pH 7.5）468 mL、1 mmol/L丙二酰辅酶A 10 mL、5 mmol/L 4-香豆酰辅酶A 2 mL，CtCHS重组蛋白20 mL，于37 ℃水浴反应12 h后800 mL醋酸乙酯萃取3次，氮气流吹干后溶于100 mL甲醇。利用高效液相色谱仪检测产物，条件为Ultimate LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 mm），柱温30 ℃，上样量为10 mL，以水（A）和乙腈（B）作为流动相，洗脱梯度：0～10 min，30% B；10～20 min，30%～60% B；20～25 min，60%～70% B；25～30 min，70%～80% B；30～35 min，80%～100% B；35～40 min，100% B；40～46 min，100%～30% B。体积流量为1 mL/min，在290 nm波长处检测。

利用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS进一步检测，液相条件为Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18色谱柱（100 mm×3.0 mm，1.7 mm），柱温40 ℃，柚皮素查耳酮和柚皮素对照品上样量为4 mL，酶反应产物上样量为7 mL，以水（A）-乙腈（B）作为流动相，洗脱梯度：0～5 min，30% B；5～15 min，30%～60% B；15～20 min，60%～100% B；20～25 min，100% B；25～31 min，100%～30% B。体积流量为0.3 mL/min。质谱条件为电喷雾离子源，以氮气为载气，鞘气压力3.5 MPa，辅助气压力1.0 MPa，喷雾压力3500 V，毛细管温度350 ℃，辅助气加热温度200 ℃，正负离子模式，扫描离子范围m/z为100～1500，Full MS分辨率为35 000，dd-MS2分辨率为17 500，（N）CE/stepped nce设置为35、60。

2.6 CtCHS蛋白亚细胞定位

根据CtCHS序列及无缝克隆原理设计带有酶切位点Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ的引物，PCR扩增相应目的片段。利用限制性内切酶Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ酶切pCAMBIA1300-35S-GFP质粒，通过无缝克隆试剂盒（诺维赞，Cat C115-01）连接目的片段与载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单克隆菌株测序，测序正确的菌株提取质粒。利用PEG4000将pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS、pCAMBIA 1300-35S-GFP质粒分别转化拟南芥原生质体，弱光下培养8～10 h，在激光共聚焦显微镜下观察CtCHS蛋白的亚细胞定位。

2.7 CtCHS表达模式分析

根据CtCHS序列利用DNAMAN设计实时荧光定量引物，以F-box为内参基因，引物序列见表1，通过实时荧光定量PCR检测不同颜色的管花肉苁蓉花中的CtCHS相对表达量。利用TransStart Green qPCR SuperMix（全式金，AQ101-02）以SYBR Green荧光染料法测定，反应体系：2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 mL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.2 mL，cDNA模板0.5 mL，无核苷酸酶水4.1 mL，采用两步法进行反应，反应程序参考董先娟等[18]的方法。每个样品包含3个生物学重复，重复3次实验。实验数据通过Excel进行分析，以2−ΔΔCt法计算CtCHS相对表达量，利用GraphPad Prism 8进行显著性分析并绘制柱状图。

3 结果与分析

3.1 CtCHS基因的克隆

利用管花肉苁蓉花转录组数据筛选出4条注释为“chalcone synthase”的序列，通过NCBI的Blast比对发现仅有一条序列具有CHS基因的全长且FPKM大于10。根据该序列设计特异性引物，以管花肉苁蓉花cDNA为模板，PCR扩增得到约1200 bp片段（图1）。将PCR产物胶回收，与pCE2 TA/Blunt-Zero载体连接，测序结果与转录组分析相符，将该基因命名为CtCHS，序列长度为1173 bp，编码390个氨基酸。

3.2 CtCHS的生物信息学分析

3.2.1CtCHS理化性质与跨膜域分析采用在线软件ProtParam分析CtCHS基因编码蛋白的理化性质，CtCHS编码390个氨基酸，分子式为C1908H3041N511O562S22，相对分子质量为42 836.54，理论等电点为5.85，不稳定系数II为43.24属于不稳定蛋白，总平均亲水性（GRAVY）为−0.052，属于亲水性蛋白。进一步运用Prot Scale在线工具分析蛋白亲水性/疏水性，分析结果显示CtCHS蛋白亲水性/疏水性最大值为2.422（342），最小值为−2.489（119）。CtCHS基因编码的氨基酸肽链中亲水性氨基酸残基数量多于疏水性氨基酸残基，属于亲水性蛋白。采用在线软件TMHMM预测蛋白的跨膜结构，CtCHS蛋白无跨膜结构域。

3.2.2CtCHS蛋白二级结构与三级结构的预测运用在线工具SOPMA预测蛋白二级结构，结果如图2-A所示，44.87%的α-螺旋、31.03%的随机卷曲、15.64%的延伸链和8.46%的β-折叠组成了CtCHS蛋白的二级结构。利用在线分析软件SWISS-MODEL预测蛋白三级结构，以水稻CHS1的晶体结构为模板，预测CtCHS蛋白三维结构，结果如图2-B所示，管花肉苁蓉CtCHS与水稻CHS1一致性为83.55%。

3.2.3序列比对及系统进化树分析运用DNAMAN软件将CtCHS与其他物种CHS氨基酸序列进行同源性比对，结果如图3-C所示，CtCHS氨基酸序列与芝麻Sesamum indicum L.（XP_011091402.1）、金鱼草Antirrhinum majus L.（P06515.1）、通泉草Mazus pumilus (N. L. Burman) Steenis（AAN05791.1）、沟酸浆Erythranthe lewisii G. L. Nesom & N. S. Fraga（AHJ80976.1）、白苏Perilla frutescens (L.) Britton（O04111.1）、拟南芥Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.（NP_196897.1）中CHS的氨基酸序列高度相似，相似度依次为90.93%、90.68%、90.18%、89.42%、89.42%、81.61%。此外，多序列比对还表明CtCHS具有保守催化残基Cys164、His303、Asn336。为进一步了解管花肉苁蓉CtCHS在植物CHS家族中的进化位置，将CtCHS与其他植物的CHS蛋白利用MEGA-X软件构建系统进化树，结果如图3-D所示，管花肉苁蓉CtCHS与沟酸浆E. lewisii（AHJ80976.1）ElCHS亲缘关系较接近。

3.3 CtCHS原核表达与纯化

将pET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），通过IPTG低温诱导蛋白表达。利用镍离子亲和色谱柱纯化蛋白，纯化蛋白经10% SDS-PAGE检测，结果如图3所示，CtCHS蛋白条带出现在40 000附近，与CtCHS蛋白相对分子质量42 800相符。

3.4 CtCHS酶活性分析

为了鉴定CtCHS的功能，将纯化的CtCHS蛋白与丙二酰辅酶A、4-香豆酰辅酶A共同孵育反应并利用HPLC和MS检测产物。自然条件下柚皮素查耳酮在溶液中不稳定，容易环化为柚皮素，因此选择柚皮素查耳酮和柚皮素作为标准品对照。HPLC检测结果如图4-A、B所示，酶反应产物与柚皮素标准品的保留时间相近，紫外吸收光谱中均在289 nm处有最大吸收，而与柚皮素查耳酮的保留时间、紫外吸收光谱均不同，而作为阴性对照的高温灭活CtCHS蛋白与底物孵育后的产物中无柚皮素查耳酮、柚皮素。进一步通过质谱检测，一级质谱（图4-C、D）表明酶反应产物具有[M－H]−峰m/z 271.060 97，而柚皮素具有[M－H]−峰m/z 271.060 91。对比MS2图谱（图5-E、F），CtCHS酶反应产物与柚皮素均有m/z 107、151、177的特征碎片峰，与文献报道相符[19]，表明CtCHS具有查耳酮合酶活性，能将丙二酰辅酶A与4-香豆酰辅酶A催化反应为柚皮素查耳酮。

3.5 亚细胞定位分析

为研究CtCHS蛋白在细胞中的作用位置，构建pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转化拟南芥原生质体观察其亚细胞定位。结果如图5所示，作为对照的pCAMBIA1300-35S-GFP蛋白分布于细胞核和细胞质中，而pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS融合蛋白则主要分布于细胞质，表明CtCHS蛋白可能在植物细胞的细胞质中发挥功能。

3.6 CtCHS表达模式分析

利用qRT-PCR检测CtCHS在白、紫、红3种颜色管花肉苁蓉花中的相对表达量，结果如图6所示，CtCHS在紫、红色花中表达量均显著高于白色花中表达量。相比白色花，紫色花中CtCHS表达量是其8.44倍，红色花中CtCHS表达量是其3.21倍，这些结果表明CtCHS表达量变化可能与管花肉苁蓉花色差异有关，表达量越高花色越深，表达量越低花色越浅。

4 讨论

CHS是黄酮类化合物生物合成途径的关键酶，在许多植物中都与花色调控有关，如石竹Dianthus chinensis L.[20]、碧冬茄Petunia× hybrida Hort. ex Vilm.[22]的花色都受CHS的调控。管花肉苁蓉主要具有白、红、紫3种花色，但是尚未见其花色调控机制的报道。本研究通过管花肉苁蓉花转录组数据分析利用RT-PCR克隆出1条CtCHS基因，并对其进行生物信息学分析，结果表明CtCHS与沟酸浆（AHJ80976.1）ElCHS氨基酸序列相似度较高且有较近的亲缘关系。CHS是一种Ⅲ型聚酮合酶（PKS Ⅲ），研究发现CHS具有保守的Cys-His-Asn催化三联体[23]。本研究中，氨基酸序列比对分析表明CtCHS具有保守的催化残基Cys164、His303、Asn336，表明CtCHS可能具有典型的查耳酮合酶功能。利用大肠杆菌原核表达CtCHS蛋白进行酶活性分析，以HPLC和MS检测，发现CtCHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮。

CHS在许多植物中参与黄酮类化合物的合成，但是不同物种中亚细胞定位不同。如红花Carthamus tinctoriusL. CtCHS1[24]、广东桑Morus atropurpureaRoxb. MaCHS[25]、紫茎泽兰Eupatorium adenophorumSpreng. EaCHS[26]均定位于细胞质，而黄牡丹Paeonia delavayivar. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS[27]、茄子Solanum melongenaL. SmCHS[28]则定位于细胞质和细胞核，在葡萄Vitis viniferaL.中VvCHS定位于细胞质、细胞核和细胞壁[29]。本研究中，利用pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转化拟南芥原生质体观察到CtCHS蛋白主要定位于细胞质中，可能在细胞质中催化生成柚皮素查耳酮促进黄酮类化合物的积累。

苯丙烷途径由4-香豆酰辅酶A分支为黄酮类化合物合成途径和木脂素生物合成途径，CHS催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮启动黄酮类化合物的生物合成途径，是该途径的第一个关键酶[30]。因此，高表达的CHS有利于植物积累更高含量的黄酮类化合物从而产生颜色更深的花，如玉簪Hosta plantaginea (Lam.) Aschers中紫花品种CHS表达量高于白花品种，将玉簪HpCHS转化烟草获得过表达植株，相比于野生型烟草，过表达烟草花瓣颜色更深，总花色素苷含量更高[31]。本研究中，CtCHS基因的表达量高低与管花肉苁蓉花色深浅相关，在颜色较深的紫色花、红色花中高表达，在颜色浅的白色花中低表达，CtCHS的表达差异可能是管花肉苁蓉具有不同花色的原因之一。

总之，本研究从管花肉苁蓉花中克隆了一条CtCHS基因并对其进行生物信息学分析，利用大肠杆菌外源表达获得CtCHS重组蛋白，通过酶活性分析证明CtCHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮，发现CtCHS基因在紫、红色花高表达，在白色花低表达。这些结果表明CtCHS基因可能调控管花肉苁蓉产生不同花色，有利于管花肉苁蓉花色调控机制的进一步研究，为后续研究CtCHS在管花肉苁蓉花色调控中的作用提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：邱海玲，王方明，米芯雨，张泽坤，杜宇，史社坡，王晓晖，屠鹏飞．管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析 [J]. 中草药, 2023, 54(23): 7797-7805.

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