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Comparison of the microbial community in the rhizosphere of peanuts between saline

花匠小妙招
2024-11-02 09:58

摘要: 花生属豆科固氮作物，具较强的抗旱耐盐性，土壤微生物在盐碱土生态系统中具有重要的生态功能。以花生平作、花生/棉花间作为对象，通过16S rRNA基因克隆文库技术分析了黄河三角洲滨海盐碱地花生旺盛生长期不同含盐量盐碱地和非盐碱地0-40cm根层非培养土壤微生物群落组成及其多样性，分析了盐碱地花生根层土壤细菌群落与非盐碱地花生根层土壤细菌群落的差异，为揭示盐碱地花生根层土壤微生物的多样性以及土地利用变化与生态环境效应间的关系奠定基础。利用免培养技术直接从土壤样品提取总DNA，针对细菌基因组16S rRNA基因的V3高变区进行PCR扩增；利用焦磷酸测序的方法对V3高变区PCR产物进行高通量测序，并对测序数据进行生物信息学分析。结果表明，（1）黄河三角洲滨海盐碱土较高含盐量土壤中根层土壤微生物种类、优势种群数量和群落功能多样性较非盐碱土壤较为丰富。（2）盐碱土花生平作或花生//棉花间作两种种植方式基本不影响二者0-40cm根层土壤微生物优势类群；不同土壤类型和种植模式下，花生和棉花根层土壤中优势菌群均为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）4种菌群，其总丰度为80%-90%。非盐碱土壤中花生根层的酸杆菌门（Acidobacteria）丰度是盐碱土壤中的3倍以上，嗜热油菌纲（Thermoleophilia）和放线菌纲（Actinomycetales）丰度远高于各种盐碱土壤花生平作和花生//棉花间作两种植模式下的花生根层土壤；非盐碱土平作花生0-40cm土层中Rubellimicrobium、Pontibacter和Lamia细菌则显著缺失。（3）土壤类型对土壤微生物菌群类型影响较大，聚类分析表明，10个土壤样本依据土壤含盐量高低和根系分布深度聚为3类，即非盐碱土壤归为1类，盐碱土壤根系密集分布层0-20cm、20-40cm各归为1类。

Comparison of the microbial community in the rhizosphere of peanuts between saline-alkali and non-saline soil at different soil depths and intercropping cultivation in the Yellow River Delta

DAI Liangxiang1 , KANG Tao2 , CI Dunwei1 , DING Hong1 , XU Yang1 , ZHANG Zhimeng1 , ZHANG Dai3 , LI Wenjin2

Abstract: The peanut or groundnut (Arachis hypogaea L.) is an important nitrogen fixing legume worldwide, which is strongly drought and salt resistant. Soil microbiomes play an important ecological role in the saline-alkaline soil ecosystem. Many factors could shape the rhizosphere microbiome, but the effects of soil salinity, intercropping patterns, and soil depth on the composition of bacterial communities for peanuts are largely unknown. In this study, to compare and analyze the difference in rhizosphere bacterial communities between saline-alkali and non-saline soil, the soil in which the peanuts were grown, under single cropping and intercropping, were used as experimental materials. The different soil bacterial community compositions and diversities from 0-40 cm soil of saline-alkali and non-saline land in the saline-alkali coastal areas of the Yellow River Delta were analyzed using 16S rRNA gene clone library technology. Thus, our study has laid a solid foundation for further functional investigation into the diversity of soil rhizosphere microbiomes from different soil types and the relationship between land use change and ecological environmental effects. The total DNA was extracted from the soil samples using free culture technology, and PCR amplification was performed on the high variation area of V3 in the 16S rRNA gene of the bacterial genome. Pyrosequencing was used to analyze the high variation area of V3, and a bioinformatics analysis was performed to further analyze the sequencing data. All analyzed samples were characterized by diverse bacterial communities, and the relative proportions of phylum, family, and genus. The results showed:(1) Rhizospheres grown in saline-alkali soils contained more bacterial diversity, dominant species, and community functional diversity than non-saline grown ones. (2) Single cropping or intercropping patterns appeared to not affect the dominant bacterial communities in the 0-40 cm rhizosphere soil. Proteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, and Acidobacteria were significantly abundant rhizosphere microbiomes in all soil types, and accounted for more than 80%-90% of the community. In addition, the abundance of Acidobacteria in non-saline soils were more than three times of these in saline-alkali land, and Thermoleophilia and Actinomycetales were more abundant in non-saline soil than those in single cropping and intercropping of saline-alkali land. However, Rubellimicrobium, Pontibacter, and Lamia were relatively less in the 0-40 cm soil of signaling cropping non-saline land. (3) Soil types appeared to affect the types of microbiomes in the rhizospheres. All the samples were largely divided into three classes:non-saline land, 0-20 cm, and 20-40 cm rhizospheres according to the soil salinity and depth of root distribution by clustering analysis.

黄河三角洲位于我国山东省, 东经118°07-119°18, 北纬36°55-38°12, 是黄河在利津县以下以及向下冲积而成的扇形三角洲。黄河三角洲不仅有大量的物种资源, 而且土地、矿产、温光等自然资源也很丰富[1-2]。但生态环境相对脆弱, 盐渍化土地面积高达18万hm2, 严重影响了该区域经济的可持续发展以及农业开发前景[3], 探讨治理机理和开发途径对盐渍化土地的开发利用具有指导性意义。

土壤盐碱化是世界性难题, 由于土壤有机质含量、酸碱度、水分及土壤母质的不同, 与此环境相适应的土壤微生物种类各异。以往对盐碱地土壤微生物的研究主要集中在耐盐碱微生物的分离、盐碱极端微生物的生态特征、不同植物群落土壤微生物的时空动态和区系特征[4-5]、湿地土壤不同深度层次微生物特征[6-7]、微生物量与土壤酶[8]、不同植物群落土壤养分与微生物活性以及不同改良措施及植被对盐碱地土壤微生物的影响效果等方面[9-11], 关于黄河三角洲地区土壤微生物多样性研究多集中在米草[12]、柽柳[13]、白蜡、刺槐、臭椿林地[14]、碱篷、茵陈蒿、白茅、芦苇[15]等耐盐碱或盐生草本、灌木和乔木类植物, 有关盐碱土壤种植粮油经类作物尤其是花生根层土壤微生物数量、种群结构、优势菌群以及盐胁迫与土壤微生物活动之间的生态关系的研究鲜见报道, 为此, 本试验以黄河三角洲滨海盐碱土为对象, 利用焦磷酸高通量测序技术直接从土壤中提取总DNA, 构建细菌16S rRNA基因克隆文库, 对黄河三角洲盐碱地花生旺盛生长期根层土壤微生物的菌群结构进行分析, 旨在为进一步了解盐碱土壤微生物的多样性、结构、功能与演化等问题, 以及维护盐碱地生态系统的稳定平衡提供土壤微生物方面的参考依据。

1 材料与方法1.1 试验地点选择

试验地点分别设置在山东省花生研究所莱西试验田和东营市不同地理位置的利津县汀罗镇毛坨村和垦利县青坨村, 莱西市地处东经120°12′-120°40′, 北纬36°34°-37°09′, 东营市为东经118°07 ′-119°10′, 北纬36°55′-38°10′。莱西试验田土壤类型为潮土, 东营市利津县汀罗镇毛坨村和垦利县青坨村的土壤类型均为盐化潮土。

1.2 试验设计

田间条件下, 以非盐碱土壤平作花生田为对照, 设置不同含盐量土壤花生平作、花生/棉花间作两种种植方式, 花生播种日期均为5月10日, 田间管理均同于一般高产花生田和棉花田。

土壤含盐量差异以东营市不同地理位置的利津县汀罗镇毛坨村和垦利县青坨村两处不同含盐量土壤为试材, 以山东省花生研究所莱西试验田的中等肥力非盐碱土壤为对照。于花生生长旺盛期(荚果膨大期、8月13日)分别采集各种植方式下, 花生根层和棉花根层0-20cm、20-40cm的土壤样本。

1.3 土样采集

于花生荚果膨大期(2015/8/13), 同时分别采集不同试点花生根层(距花生、棉花主根10-15cm处)0-40cm的多点混合土壤样本(表 1)。土壤样品采集方法采用"S"型5点混合样本法, 分别采集各处理0-20cm、20-40cm的土壤样本, 将每个样点同一层次的土样混合均匀后, 立即装入无菌袋中, 置于-20℃冰箱保存备用。

表 1 供试土壤样品性状与处理Table 1 Characteristics and treatment of soil samples for test

样品编号
No. 土层深度
Soil depth/cm 采样地点
Sampling site 种植方式
Planting method 采样位置
Sampling location 土壤含盐量
Salt contents in soil/(g/kg) 有机质含量
OM/(g/kg) 全氮
Soil total nitrogen content/(g/kg) 速效氮
Soil available nitrogen content/(mg/kg) 速效磷
Soil available phosphorus content/(mg/kg) 速效钾
Soil available potassium content/(mg/kg) pH 阳离子交换量
CEC cmol(+)/kg 花生1 0-20 东营毛坨花生单作花生根层 5.27 6.57 0.542 52.54 9.71 111.47 8.6 7.56 花生2 20-40 4.45 4.14 0.415 39.34 7.82 99.26 8.4 7.21 花生3 0-20 东营青坨花生单作花生根层 3.99 11.2 0.982 67.24 14.62 86.34 8.4 6.78 花生4 20-40 4.26 7.63 0.698 52.13 9.08 72.17 8.2 6.89 花生5 0-20 青岛莱西花生单作花生根层 0.59 12.75 1.311 88.63 30.84 146.32 7.3 10.89 花生6 20-40 0.67 9.13 0.962 74.36 15.43 130.21 7.2 11.25 花生7 0-20 东营毛坨花生/棉花生根层 5.27 6.57 0.542 52.54 9.71 111.47 8.6 5.27 花生8 20-40 花间作 4.45 4.14 0.415 39.34 7.82 99.26 8.4 7.21 花生9 0-20 东营毛坨花生/棉棉花根层 5.27 6.57 0.542 52.54 9.71 111.47 8.6 5.27 花生10 20-40 花间作棉花根层 4.45 4.14 0.415 39.34 7.82 99.26 8.4 7.21有机质含量(Organic matter content, OM); 土壤阳离子交换量(Cation exchange capacity, CEC)

1.4 土壤DNA提取

收集所得土壤样品利用OMEGA土壤总DNA提取试剂(OMEGA soil DNA kit)盒进行提取。所得DNA采用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

1.5 16S rRNA文库构建及高通量测序

稀释后的基因组DNA利用引物340F:CCTACGGGNBGCASCAG以及805R:GACTACNVGGGTATCTAATCC对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增。扩增程序如下:95℃预变性3min; 30个循环包括(95℃, 30sec; 50℃, 30sec; 72℃, 60sec); 72℃, 7min。PCR产物使用1.5%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测; 根据PCR产物浓度进行等浓度混样, 充分混匀后使用0.5×TBE浓度1.5%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物, 割胶回收目标条带。产物纯化试剂盒使用QIAGEN公司的MinElute胶回收试剂盒。最后使用HiSeq2500进行250PE测序。

1.6 生物信息学分析

测序得到的原始数据(Raw Data), 存在一定比例的干扰数据(Dirty Data), 为了使信息分析的结果更加准确、可靠, 使用SOAPdenovo对原始数据进行拼接、过滤, 得到有效数据(Clean Data)。

然后基于有效数据进行OTUs(Operational taxonomic units)聚类和物种分类分析, 并将OTU和物种注释结合, 从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析, 同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上, 可以进行一系列的基于OTUs、物种组成的聚类分析, PCoA和PCA统计比较分析, 挖掘样品之间的物种组成差异, 并结合环境因素进行关联分析。

2 结果与分析2.1 样本的有效序列数据量和物种丰度统计

表 2看出, 供试样本序列条数在1716596-2863616间, 花生6样品序列条数最小, 花生4样品最大, 10个样本的序列条数和有效序列条数总和分别为21617593、16497920。在样品相似度为0.97的情况下进行多样品物种丰度统计, 21617593条序列中有16497920条序列相似性标准匹配到参考数据库, 共分为21736个OTUs, 样品中物种分布的均匀度为76.32%。

表 2 土壤样本的有效序列统计Table 2 Statistics results of effective sequences for ten soil samples

样本
Sample 序列条数
Number of sequences 平均长度
Average length 有效序列条数
Number of sequences 花生1 2711148 147.7781 2050516 花生2 2690541 148.9583 1914100 花生3 2090194 146.6363 1649279 花生4 2809336 148.9284 2060354 花生5 1916650 146.4963 1552399 花生6 1716596 148.0418 1374934 花生7 2124037 146.1088 1658917 花生8 1872477 146.468 1454283 花生9 1822998 146.7011 1388186 花生10 1863616 147.4135 1394952 Total 21617593 147.35306 16497920

2.2 Alpha多样性分析

表 3所示, 10个样本的goods_coverage测序深度指数均在99.83%以上, 估计群落中OTUs个数的chao1和ACE菌群丰富度指数分别在11461.02-15167.3和11317.56-15010.0间, Shannon多样性指数为9.01-10.29, Simpson指数均大于0.9932, PD whole_tree指数为181.32-254.29, Observed_species指数均在9050个以上。除花生1样品的Shannon多样性指数相对最大外, 花生2样品的chao1和ACE菌群丰富度指数、Simpson指数、PD_whole_tree指数和Observed_species指数均最高, 而花生5和花生6样品中chao1和ACE菌群丰富度指数、Shannon指数、Simpson指数、PD_whole_tree指数和Observed_species指数均较小。可见, 黄河三角洲滨海盐碱土壤中无论是花生平作还是花生/棉花间作的种植方式, 花生、棉花0-40cm根层土壤微生物种类和优势种群的数量丰富, 土壤微生物群落功能多样性较非盐碱土壤花生根层微生物群落丰富, 尤以土壤含盐量较高的花生平作种植方式下花生1和花生2样本更为丰富。

表 3 土壤样本多样性分析指数Table 3 Analysis of soil samples diversity index

样本
Sample 样本文库覆盖率
Goods_coverage 群落丰富度指数多样性指数细菌多样性指数 Chao1 Ace Shannon Simpson PD_whole_tree observed_species 花生1 0.998758 14742.19 14646.16 10.28939 0.99747 240.3792 12140 花生2 0.998618 15167.30 15010.00 10.06734 0.99694 254.2856 12550 花生3 0.998562 12984.01 12861.86 9.70221 0.99445 216.5552 10404 花生4 0.998725 14496.95 14148.00 9.63288 0.99461 234.6009 11508 花生5 0.998573 11461.02 11317.56 9.00983 0.99322 181.3245 9050 花生6 0.998302 12730.14 12515.34 9.77441 0.99583 198.8082 10130 花生7 0.998650 12742.46 12632.72 9.81843 0.99563 213.1567 10446 花生8 0.998341 13240.50 13083.32 9.74712 0.99450 217.7642 10649 花生9 0.998335 13069.32 12955.76 10.15951 0.99716 218.7934 10703 花生10 0.998302 13314.23 13175.68 10.04322 0.99613 225.3842 10873

2.3 盐碱地土壤花生根层微生物群落结构分析2.3.1 在门级别的菌落结构分析

图 1可以看出, 无论是不同盐碱程度土壤还是不同种植方式, 花生、棉花根层土壤微生物类群从门水平上均可归为11个菌门, 其中以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)等4种为主要菌群, 其总丰度占80%-90%, 并尤以变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)相对丰度最大, 二者丰度高达70%-80%。但盐碱土与非盐碱土两土壤类型间, 其土壤微生物主要优势类群丰度在门水平上存在差异, 花生和棉花间作种植方式基本不影响二者0-40cm根层土壤微生物优势类群。花生3、花生4、花生5、花生6和花生8土壤样品中变形菌门(Proteobacteria)丰度较低, 在26%-31%间, 以花生4最低; 花生1、花生2和花生9样品中变形菌门(Proteobacteria)丰度较高, 在39%-43%间, 且以花生1中最高。放线菌门(Actinobacteria)的丰度值以花生3、花生4、花生7和花生8土样较高, 在43%-50%间, 其余土样的丰度值相近, 均在32%-40%间。花生5、花生6两样本酸杆菌门(Acidobacteria)丰度为16%-20%, 显著高于其他8个土壤样本的3%-8%, 但其绿弯菌门(Chloroflexi)丰度仅为2%-4%, 显著低于其他样本。花生3、花生4、花生5、花生6样本的厚壁菌门(Firmicutes)丰度较高且花生4样本的丰度达12%以上, 是其余样本丰度的3-6倍。青岛莱西非盐碱土壤0-40cm花生根层酸杆菌门(Acidobacteria)丰度值远高于其他土壤根层样本, 但绿弯菌门(Chloroflexi)丰度明显低于其他土壤样本。

图 1 各样本在门水平的菌落结构柱状图Fig. 1 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of phylum

盐碱土壤0-20cm花生根层和棉花根层土壤中, 变形菌门(Proteobacteria)丰度均高于20-40cm土层中, 其余优势菌群在土壤类型和不同作物根层0-40cm土层间分布差异不明显。不同土壤类型间的优势菌群丰度存在较大差异, 中度盐碱土以变形菌门(Proteobacteria)丰度值较高, 轻度盐碱土和非盐碱土花生根层以放线菌门(Actinobacteria)丰度较高, 酸杆菌门(Acidobacteria)主要分布于非盐碱土壤的花生根层。

2.3.2 在纲和目级别的菌落结构分析

图 2可以看出, 无论是不同含盐量的盐碱土壤还是非盐碱土壤, 其细菌主要有α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、纤维粘网菌纲(Cytophagia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)等10种菌群, 此10种菌群在盐碱土壤中的丰度为80%左右, 在非盐碱土壤中的丰度略低为70%;两类土壤中均以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)的丰度较高, 二者占40%-55%;非盐碱土壤花生根层中的嗜热油菌纲(Thermoleophilia)的丰度高于盐碱土壤3倍以上, 其γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和酸微菌纲(Acidimicrobiia)均明显低于盐碱土壤花生、棉花根层3倍以上; 高含盐量盐碱土壤的平作花生根层和花生//棉花间作的花生及棉花根层的芽孢杆菌纲(Bacilli)均明显低于非盐碱土壤。

图 2 土壤样本在纲、目级别的菌落结构柱状图Fig. 2 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of class and order

由图 2可知, 放线菌目(Actinomycetales)是盐碱地花生平作和花生//棉花间作方式下二者根层土壤中的主要优势菌群, 其丰度在20%-32%, 而非盐碱土壤中仅为15%-20%;其次为根瘤菌目(Rhizobiales), 其在各类型土壤、不同种植方式下的花生根层和棉花根层均在5%-14%;盐碱土壤中的酸微菌目(Acidimicrobiales)高于非盐碱土壤的5倍以上, 但其中Gaiellales菌目低于非盐碱土壤的5倍以上; 红螺菌目(Rhodospirillales)在各类型土壤中几乎无差异, 均占5%左右; 鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)在花生//棉花间作种植方式下明显升高, 相对丰度在5%左右, 而其余类型土壤样品中仅占2%-3%;其余诸如假单胞菌目(Pseudomonadales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、黏球菌目(Myxococcales)等菌群在不同类型盐碱土壤和非盐碱土壤间丰度优势差异不大, 其相对丰度总和不足10%。

2.3.3 在科级别的菌落结构分析

由图 3可知, 不同类型盐碱土壤和非盐碱土壤花生根层、花生//棉花间作的棉花根层, 土壤微生物菌群在科级别的优势菌群差异主要表现在类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)和放线菌科(Gaiellales)等5种微生物类群, 其中, 非盐碱土壤中的类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)显著低于盐碱土壤的5倍以上, 而其放线菌科(gaiellales)远高于盐碱土壤的5倍以上, 红螺菌科(Rhodospirillaceae)略高于盐碱土壤的2倍左右, 其余诸如黄单胞杆菌科(Xanthomonadaceae)、中华杆菌科(Sinobacteraceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、放线菌目的小单孢菌科(Micromonosporaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)等6种土壤微生物菌群相对丰度总和在10%左右。可见盐碱土壤花生根层土壤中放线菌科(gaiellales)的相对丰度显著降低, 而类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)的相对丰度显著增加。

图 3 土壤样本在科级别的菌落结构柱状图Fig. 3 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of family

2.3.4 在属级别的菌落结构分析

图 4可见, 无论是花生平作、还是花生//棉花间作, 盐碱土壤花生根层和棉花根层土壤微生物种类、优势种群数量和群落功能多样性在属级别较非盐碱土壤丰富, 主要为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、假单胞菌(Pseudomonas)、红平红球菌(Rhodoococcus)等, 盐碱土壤样品中除嗜酸细菌类群如Candidatus Koribacter、Actinomadura、Phycicoccus和Candidatus Solibacter丰度较低外, 其余类群均较丰富。而非盐碱土壤样品中Rubellimicrobium、Iamia、Pontibacter、Inquilinus菌群丰度极低外, Steroidobacter、Lysobacter、Actinomadura、Pseudochrobactrum、Afifella和Catenuloplanes均较低, 且Candidatus Solibacter丰度显著高于盐碱土。非盐碱土壤0-40cm土层中均未发现Rubellimicrobium属和Pontibacter属细菌, 且0-20cm土层中无Lamia属细菌。盐碱土花生根层土壤微生物在属水平上更为丰富。

图 4 土壤样本在属级水平的菌落丰度变化图Fig. 4 Histogram of microflora structure from ten samples at the level of genus

2.4 Beta多样性分析

由图 5可知, 主成分1(PC1)可以解释所有变量方差的47.02%, 主成分2(PC2)可以解释所有变量方差的11.55%, 前两个主成分共解释了总变异的58.57%, 第3至第10主成分的方差贡献率较小, 均低于10.0%, 尤其第10主成分的方差贡献率接近0(图 5)。表明不同来源的10个土壤样品在PC1和PC2上均存在明显的空间分异, 10个土壤样品的土壤微生物群落可明显分为3簇:花生5、花生6样品聚为一簇, 花生2和花生4聚为一簇, 其余花生1、花生3、花生7、花生8、花生9和花生10为一簇(图 5)。花生5、花生6样本与其他样本的相似度差异较大, 其与第一、二主成分均为正相关关系, 而其余盐碱土花生//棉花根层土壤微生物类群均与第二主成分相关性较高, 其中, 花生3、花生5、花生7和花生9土壤微生物菌群与第二主成分为正相关关系, 花生1、花生2和花生4土壤微生物菌群则与第二主成分为负相关关系(图 5)。表明, 土壤类型对土壤微生物类菌群类型影响较大, 10个土壤样本依据土壤含盐量高低和根系分布深度聚为3类, 即非盐碱土壤归为1类, 盐碱土壤根系密集分布层0-20cm、20-40cm各归为1类, 花生//棉花间作下的花生或棉花根层不影响其土壤微生物菌群类型。OTU丰度聚类仅与土壤类型和盐碱土壤根系密集分布层深度有关, 而与其花生//棉花间作下的花生或棉花根层无关。

图 5 土壤微生物主成分分析Fig. 5 Microbial principal component analysis

3 讨论

盐度和碱度是影响不同盐碱程度盐碱土壤中微生物群落结构的显著因素, 土壤电导度(EC)和pH对盐碱土壤细菌群落结构的影响力最大, 极端盐碱土壤中分布着大量的喜盐碱细菌, 非耐盐碱细菌不占有优势[16-19]。盐碱地土壤细菌具有丰富物种、遗传和发育系统多样性, 不同盐碱程度土壤中的主要细菌为耐盐碱的细菌菌株, 并且均是耐硫酸盐的细菌。变形菌纲(α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群, 其余依次是放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门和疣微菌门, Marinobacter, Halomonas和Pseudomonas这些嗜盐菌普遍存在于盐碱土中[16-19]。天津滨海盐碱土壤细菌以乳杆菌属、芽孢杆菌属为主, 放线菌以链霉菌属占优势, 真菌以青霉属为主[20]。本试验条件下, 土壤类型、含盐量高低均影响0-40cm根层土壤微生物活性、菌落结构、功能类群和根层土壤微生物群落多样性。黄河三角洲滨海盐碱土壤中花生//棉花间作种植方式下, 花生和棉花根层土壤微生物种类和优势种群的数量、群落功能多样性均较中等肥力非盐碱土壤平作花生根层微生物群落丰富, 尤以较高含盐量土壤中更为丰富。

生物改良措施是通过种植植物, 增加地表覆盖面积, 减少地表水分蒸发, 增加土壤根系数量及微生物活性, 从而改善土壤理化性质。生物改良措施被认为是最具生态效益和经济效益的措施, 同时也是国内外盐碱地治理的发展趋势之一。关于不同植被(植物)尤其是盐生植物对盐碱地微环境、植物生长季养分吸收等因子对土壤改良的响应已有较为系统的论述[21], 有关生物措施对盐碱土壤微生物群落结构的影响研究表明, 松嫩草地不同植被覆盖下土壤微生物数量存在较大差异。羊草群落土壤细菌、真菌和放线菌数量较芦苇群落、虎尾草群落、碱茅群落、碱蓬群落以及盐碱裸地均有所提高[22]。

在黄河三角洲盐碱环境中种植一定种类的盐生植物, 会提高微生物的种类、数量和种群变化, 而且柽柳对微生物的影响较大, 且耐盐细菌的比例显著下降, 随着连续种植时间的增加, 微生物总数的减少以及真菌数量的增加, 细菌与真菌的比值显著变小, 并且氨化细菌、自生固氮菌、硝化细菌和亚硝化细菌等生理类群微生物的数量也逐渐下降[23]。马旭龙等[24-25]研究结果表明, 盐碱地种植油葵、甘草、锦鸡儿等植物可改善盐碱地根际土壤微生物的群落组成, 优化盐碱地微生物的群落结构, 显著提高土壤微生物群落功能多样性, 且不同植物品种对盐碱地微生物群落结构的作用存在差异, 可筛选出更适宜改善盐碱地土壤质量的植物品种, 也是盐碱地生态恢复的一项有效措施。不同含盐量的盐碱土和非盐碱土中, 花生、棉花根层土壤微生物均以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)等4种菌群为优势菌群, 其总丰度占80%-90%, 尤以变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)相对丰度最大, 二者高达70%-80%。盐碱土花生和棉花根层芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度显著高于非盐碱土壤约2倍; 非盐碱土壤花生根层酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度是盐碱土壤花生根层的3倍以上。盐碱土壤花生、棉花根层γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和酸微菌纲/目(Acidimicrobiia)丰度是非盐碱土壤花生根层的3-5倍, 而非盐碱土壤花生根层中的嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和Gaiellales菌目(Thermoleophilia)的丰度是盐碱土壤3-5倍以上; 盐碱土壤花生和棉花根层Gaiellales菌目低于非盐碱土壤的5倍以上, 而酸微菌目(Acidimicrobiales)高于非盐碱土壤的5倍以上。类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)在盐碱土壤中的丰度高于非盐碱土壤的5倍以上, 而放线菌科(Gaiellales)低于盐碱土壤的5倍以上; 非盐碱土壤0-40cm土层中均未发现Rubellimicrobium属和Pontibacter属细菌, 且0-20cm土层中无Lamia属细菌, 与前人研究结果基本一致[10, 26-29]。本研究所选土壤类型虽均为潮土类, 其所处地理位置基本相同, 但土壤耕种历史和利用方式的差异, 亦会影响本研究条件下的花生、棉花根层土壤微生物的菌群结构, 加之, 土壤样品的生物学重复少, 其代表性可能有一定的局限性。因此, 有关盐碱土花生根际土壤微生物活性、菌落结构、功能类群、与非盐碱土花生根际微生物群落多样性及功能的差异, 以及发掘利用还有待深入研究。

4 结论

试验结果表明, 黄河三角洲滨海盐碱土高含盐量土壤中根际土壤微生物种类、优势种群数量和群落功能多样性较非盐碱土壤丰富, 尤以土壤含盐量较高土壤更为丰富。黄河三角洲滨海盐碱土中以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)等4种菌群为优势菌群, 其总丰度占80%-90%。盐碱地花生//棉花间作影响二者根层微生物群落的组成, 花生单作根层土壤厚壁菌门(Firmicutes)丰度是花生//棉花间作花生根层的5-6倍, 但间作条件下, 花生根层土壤变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)丰度值均低于花生单作根层土壤丰度值5%左右。土壤类型对土壤微生物菌群类型影响较大, 依据土壤含盐量高低和根系分布深度聚为3类, 即非盐碱土壤归为1类, 盐碱土壤根系密集分布层0-20cm、20-40cm各归为1类。盐碱土的培肥改良和作物增产与作物根际微生态环境密切相关, 盐碱土根际微环境的改变与农艺措施的关系有待深入研究。