藏药大花红景天抗氧化应激药效物质辨识研究
藏药大花红景天抗氧化应激药效物质辨识研究
【摘要】： 近年来,心血管疾病(Cardiacvascular diseases,CVD)较高的发病率及致死率严重威胁着人们的生命健康。《中国心血管病报告2017》显示,中国CVD患病率和死亡率呈逐年上升趋势,CVD死亡占居民疾病死亡构成比首位,心血管疾病的防治研究工作持续成为业内研究焦点。在我国,青藏高原地区因其地理环境因素成为心血管疾病高发区,其中以高原红细胞增多症最为常见。氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基增多(或)清除能力降低导致ROS在体内或细胞内蓄积而引起的氧化应激损伤过程,是CVD发生发展的重要影响因素。目前,通过抑制过度氧化应激是防治此类疾病的一个重要途径。因此,如何发现可有效防治心血管疾病药物研究迫在眉睫。大花红景天Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba为景天科红景天属多年生草本植物,藏药“索罗玛保”(),为《中国药典》2015版(一部)收载品种,具有益气活血,通脉平喘的功效。现代药理研究表明,其具有显著地抗衰老、抗氧化、改善心血管功能、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力等多方面药理功能。本文以防治高原心血管疾病常用藏药大花红景天为研究对象,对其干预心血管疾病过程中关键影响因素——氧化应激进行研究,初步揭示该药抗氧化应激潜在分子作用机制,为其治疗心血管疾病进一步研究提供理论依据。目的1.采用细胞实验,考察大花红景天肠吸收液抗氧化应激药效作用;在此药效基础上,采用UHPLC-LTQ-Orbitrap串联质谱法对大花红景天药材提取物及其肠吸收液进行分析,鉴别得到大花红景天经肠吸收成分。2.基于肠吸收液成分分析结果,采用网络药理学方法,对大花红景天抗氧化应激损伤作用分子机制进行预测,得到其潜在的活性成分及作用靶标;后采用分子对接技术对网络药理学中预测得到的作用成分及靶标进行对接验证,进一步揭示其可能的抗氧化应激药效活性物质及其作用机制。方法1.采用外翻肠囊法,制备大花红景天含药肠吸收液和空白肠吸收液,以H9c2心肌细胞为研究对象,过氧化氢(H_2O_2)溶液作为造模剂进行氧化应激模型建立,考察大花红景天含肠吸收液对H_2O_2所致H9c2心肌细胞存活率、形态、凋亡的影响。2.在证明大花红景天肠吸收液细胞有药效基础上,应用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对大花红景天药材提取液、肠吸收液和空白肠吸收液进行快速分离检测,获取化合物相应一级分子离子峰及二级碎片信息,通过Xcalibar2.0软件推导化合物分子式,并通过部分对照品、查阅文献以及数据库对碎片离子进行解析,最终对化合物进行定性分析,鉴别经肠吸收成分。3.基于UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析结果,以大花红景天经肠吸收入体成分为研究对象,采用OpenBabelGUI软件设定格式转换得到成分InCHI号信息,将成分InCHI号导入BAT-MAN数据库平台,获取成分靶标信息;基于STRING数据库构建靶标与靶标之间的相互作用关系;将靶标信息导入DAVID数据库,进行功能通路富集分析,得到与氧化应激相关的GOTERM_BP_ALL和KEGG_PATHWAY信息数据。通过提取富集与氧化应激功能和通路相关的核心靶标,结合BATMAN-TCM的靶标预测结果,从含药肠吸收液成分中筛选与氧化应激相关的化学成分,应用Cytoscape 3.5.1软件绘制相应的“成分-靶标-通路-功能”网络图。4.为进一步对大花红景天抗氧化应激网络药理学预测结果进行验证,选择网络中成分及作用靶标,通过相应的结构处理,采用Maestro 11.1软件,对其成分进行能量优化,优化力场为OPLS_2005,相应的作用靶蛋白修饰、去水分子、加氢等优化,并以原配体为中心生成对接的活性位点,最后进行成分配体与蛋白受体分子反向对接。结果1.大花红景天肠吸收液可增加H9c2心肌细胞存活率、维持细胞形态和减少细胞凋亡,表明其具有良好的抗氧化应激损伤作用,进而表明大花红景天良好的抗氧化应激作用,且在一定程度上表明大花红景天通过介导氧化应激反应以达到治疗心血管疾病的作用。2.在正负离子模式下,分别对大花红景天药材提取液、肠吸收液和空白肠吸收液进行成分定性鉴别,通过大花红景天成分数据库及公共数据库搜索,共识别出其药材提取液中成分56个;对比药材提取液、空白肠吸收液、含药肠吸收液分析,初步鉴别得到经肠吸收入体原型成分47个;采用12个对照品进行比对,鉴定原药材提取液中成分有10个,包括红景天苷、酪醇、没食子酸、没食子酸乙酯、儿茶素、山奈素、山奈酚、咖啡酸、原儿茶酸和香草酸。3.网络药理学分析结果,成功建立了“成分-靶标-通路-功能”网络图。结果从肠吸收液成分中筛选出红景天苷、大花红天素、没食子酸乙酯、儿茶素等43个与氧化应激相关的化合物,富集到58个与氧化应激相关的核心靶标,主要干预细胞凋亡、钙信号通路和神经活性配体-受体相互作用等三条作用通路,涉及细胞死亡、调节氧化还原酶活性、氧化还原酶活性的正调控、氧化应激反应以及一氧化氮代谢过程等生物学过程,从而发挥抗氧化应激损伤的保护作用。4.分子对接结果显示,大花红景天抗氧化应激网络中能进行有效对接的成分42个,作用靶标40个;成分配体与靶标受体对接Glide gscore评分分值绝对值大多大于5,表明各个成分配体均能很好的与相应的作用靶标受体结合,且部分配体与受体之间结合具有相应的文献报道,表明本方法的准确性和可靠性,从而提高网络药理学预测分析结果的准确性和可靠性,进一步验证该药抗氧化应激潜在的分子作用机制。结论本研究结合细胞实验研究、UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析、网络药理学以及分子对接技术等多学科技术研究发现,藏药大花红景天具有良好的抗氧化应激作用,有效揭示了大花红景天抗氧化应激潜在的药效物质基础及分子作用机制,初步阐明其防治心脑血管疾病可能的分子机制。本研究整合多学科技术的研究思路与方法为藏医药防治高原红细胞增多症等心血管疾病研究提供一定的参考。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
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