黄精的化学成分、炮制与结构修饰研究及黄精属植物系统发育分析
摘要
目的:研究中国药典3种法定基原黄精植物多糖及醇提物指纹图谱的差异;并对滇黄精传统“九蒸九制”及不同炮制方法中各成分的转化进行研究;同时,以3种基原黄精为原料,对多糖的提取、纯化、不同的化学修饰方法、结构分析、抗氧化、降血糖等方面进行系统研究及利用叶绿体基因组序列研究黄精属及其相关类群的系统发育关系,为黄精药材质量评价和临床应用提供参考。方法:(1)采用水提醇沉法从水中提取黄精多糖,利用三氟乙酸(TFA)水解后,使用PMP柱前衍生化方法衍生单糖产物,随后建立3种法定基原黄精多糖的色谱指纹图谱,同时以定位酶切技术(糖苷酶)对黄精多糖进行特征水解,采用凝胶色谱法,分析多糖中糖苷键的结构差异。(2)采用HPLC对三种基原黄精的醇提物化学成分进行比较研究,探讨3种法定基原黄精中醇提物化学成分的差异。(3)采用400 MHz核磁共振(NMR)指纹图谱技术,测定3种法定基原黄精的全成分信息1H-NMR指纹图谱,结合化学计量学进行化学模式识别分析。(4)采用红外光谱结合PCA对滇黄精“九蒸九制”炮制及不同方法炮制后的化学成分的转化进行识别研究,同时采用HPGPC、HPLC和UV法对不同炮制品多糖的组分差异、指纹图谱的差异及多糖的含量变化进行研究。(5)采用热水浸提法提取滇黄精多糖,用氯磺酸-吡啶法及氢氧化钠-乙酸酐法对其进行修饰,采用苯酚-硫酸法测定了滇黄精多糖及其修饰衍生物的总糖含量;用红外光谱和核磁共振技术对修饰前后的多糖进行表征;并通过化学分析法、PMP-HPLC、HPGPC对滇黄精修饰前后的理化性质进行了比较研究,同时测定滇黄精多糖及其修饰衍生物在抗氧化和降血糖活性方面的差异。(6)对滇黄精、卷叶黄精及玉竹的叶绿体基因组进行测序、分析及比较;同时基于Genbank数据库,下载黄精属及相关类群的叶绿体全基因组序列共52条,构建NJ树,推断其系统发育。结果:(1)3种基原黄精的多糖PMP-HPLC指纹图谱存在差异。PCA和HCA分析表明,黄精和多花黄精的多糖色谱指纹较为接近,而滇黄精与二者差异明显。多糖酶解结果显示,三种多糖均存在β-1,4-葡萄糖苷键,黄精多糖和多花黄精多糖中存在β-1,3-葡萄糖苷键,而滇黄精多糖则不含。(2)建立了3种基原黄精药材醇溶性成分的HPLC指纹图谱,黄精基原植物HPLC指纹图谱相似度较好。其HPLC色谱均存在一定差异,多花黄精与黄精、滇黄精差异较大;尤其是多花黄精醇溶性成分更为丰富。指纹图谱结合化学计量学方法HCA和PCA分析显示,多花黄精与黄精、滇黄精能明显分开,黄精与滇黄精的化学成分相似性更高,归为一类;多花黄精单独归为一类。(3)3种法定基原黄精药材的1H-NMR指纹图谱差异性较明显,能够真实、全面地准确反映黄精中的各种特征性差异成分和内在的品质,其主要的差异判别成分为有机酸类及饱和脂肪酸类;主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)及聚类分析(HCA)三种分析均可将3种法定基原的黄精加以准确区分。(4)随着炮制次数的增加,滇黄精的颜色、气味和质地逐渐发生变化,由生品的黄白色逐步变为黑色;不同滇黄精炮制品的IR平均指纹光谱和二阶导数指纹图谱的差异明显,PCA模式可将不同批次炮制的滇黄精加以区分为3类;HPGPC显示滇黄精炮制品的多糖组成分布与生品的差异性较大;各炮制品之间的差异性也明显不同,随着炮制次数的增加,小分子多糖组分比例明显减少,而大分子多糖组分则随炮制次数的增加逐渐溶出;HPLC结果表明,在炮制后,滇黄精不同炮制品的指纹图谱存在差异,主要表现在图谱上的某些峰位和峰面积有所差异;PMP-HPLC检测炮制的滇黄精,均没有Man,Rib,Gal UA,Glc UA与Arab;含量测定结果表明,滇黄精生品的多糖含量最高,随着炮制次数的增加,多糖含量逐渐下降。(5)不同取代度的清除作用:硫酸化滇黄精多糖对羟基自由基、DPPH自由基氧化作用的清除作用明显强于滇黄精多糖,但还原力明显低于滇黄精多糖,而对超氧阴离子的氧化清除作用两者相差不大。S-PKP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制性均有明显的增强。S-PKP与PKP两者相比,其中的总糖含量明显减少,单糖及其组成的种类和摩尔比不同。(6)A-PKP1-1,A-PKP1-2与A-PKP1-3的取代度依次分别为0.2113,0.4287,0.5328。不同种类和取代度的乙酰化滇黄精多糖对羟基自由基、DPPH自由基的氧化清除作用抑制能力强于滇黄精多糖,但还原的能力低于滇黄精多糖,而对超氧阴离子的自由基清除作用两者抑制能力相差不大;A-PKP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力均有明显的增强。三种A-PKP与滇黄精多糖相比,其多糖含量有明显的减少,单糖的种类和摩尔比不同。(7)滇黄精与卷叶黄精的叶绿体基因结构较为相似;研究结果支持APG系统对相关科属的处理,黄精属应从百合科中移出,归属于天门冬科。结论:(1)3种法定基原黄精物种的多糖组成、糖苷键及醇溶性成分存在差异,所建立的方法简便、准确、重复性好,可用于黄精多糖中糖类的组成分析及黄精药材的质量评价(2)炮制前后滇黄精的色泽、性味、化学成分的组成、多糖分子量、含量和单糖组成均发生变化,为滇黄精炮制的机理研究及规范化炮制提供一定的依据。(3)滇黄精多糖经化学修饰后通过改变多糖的极性而增加了其抗氧化活性,不同修饰方法的滇黄精多糖的抗氧化活性与降血糖活性不同。(4)本研究对部分黄精属植物叶绿体基因组结构进行了解析,并探讨了黄精属及近缘物种的系统发育关系,为黄精属的分类提供依据。展开▼
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