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IDSC 2024丨鲁炳怀教授：社区获得性肺炎病原精准诊断，tNGS能否代替mNGS？

花匠小妙招
2024-11-05 16:56

编者按：社区获得性肺炎（CAP）是一种常见的呼吸道感染疾病，其病原体诊断对于指导临床治疗至关重要。随着分子诊断技术的发展，传统的微生物检测方法正逐渐被更先进的技术所补充，如宏基因组二代测序技术（mNGS）和靶向二代测序技术（tNGS）。在近日举行的IDSC第十届学术大会上，中日友好医院鲁炳怀教授带来了《社区获得性肺炎病原精准诊断：tNGS能否代替mNGS》的精彩报告，现整理如下。

CAP病原微生物诊断临床应用现状

CAP的病原微生物诊断面临诸多挑战。可导致CAP的病原体非常复杂，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等各种各样的病原体类型，其临床表现及病原学诊断存在较大差异。然而，CAP的临床症状、影像学检查通常缺乏特异性，如肺侵袭性真菌病与肺结核、非结核分枝杆菌感染、肺诺卡菌病等鉴别诊断困难；目前临床应用的大多数感染或炎症标志物的特异性也比较有限，且无法判断具体的病原体信息；传统的涂片镜检无法判断菌种及药敏信息，而病原培养等待时间较长；病理学检测则需采集组织样本，为有创性操作，并且同样难以明确病原类别。

mNGS在病原学检测中的应用与问题

mNGS技术在感染性疾病的精准诊治中发挥了巨大作用，国内已经在重症、急诊、感染、检验、呼吸、神经、儿科等多个学科中均推出了相应的专家共识，用以指导mNGS的规范应用和解读。

然而，mNGS在肺部感染诊断中仍存在一些问题，尽管mNGS能够检出更多少见病原体，加深我们对CAP病原体的认识。但对其检测结果的解读仍需谨慎。例如惠普尔养障体常导致慢性腹泻，很难解释呼吸道标本的检出；非结核分枝杆菌（NTM）的检出首先要排除污染与定植的情况；此外，mNGS让我们重新认识一些病原体在真实世界中的情况，如鹦鹉热衣原体、钩端螺旋体等少见病原体。而对其他的病原，如疱疹病毒、细环病毒是否有真正感染病原，也需要进一步研究确认。

NGS技术可以提供高通量检测，但临床样本中病原体的载量常较少，核酸富集对于检出更多的病原体更有价值。目前常采用两种富集方式：（1）通过差速离心、差异裂解、甲基化抗体处理等措施，降低人源基因比例的“反向富集”；（2）通过多重PCR扩增、探针捕获等方法的“正向富集”。

扩增子/探针捕获法的病原tNGS检测

tNGS正是上述的“正向富集”测序方法，通过设计特异性引物，采用多重PCR建库体系，对目标序列进行靶向扩增富集，然后应用二代或三代测序技术进行高通量测序，实现对病原广谱精准检测。与mNGS相比，tNGS在某些样本类型中显示出更高的敏感性，尤其是在人源细胞含量较高的样本中。

一项较大样本（2146分组织或体液标本）的研究表明，tNGS在肺组织、腹膜液、其他组织、骨和伤口活检标本中的检出率显著高于Sanger测序；tNGS测序阳性标本中，有19%为多种微生物感染，这是Sanger测序无法分析的；增加tNGS检测后，阳性率提高了87%[1]。此外，还有研究表明tNGS在分枝杆菌菌种鉴定和耐药基因检测方面也显示出优势[2-3]。中国不同地区的NTM感染率存在差异，其中南部地区和沿海地区的感染率较高[4]。tNGS技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药基因检测方面具有广泛的应用前景，能够覆盖多种结核一线和二线药物耐药基因。

tNGS技术在临床应用中具有多项优势，包括：（1）相对广谱，病原范围100-400种，可满足98%的临床需求Panel；（2）超敏，排除宿主干扰，比mNGS更敏感，最低检测限可达到100 copies/mL，无宿主序列影响；（3）高效，性价比高，可实现DNA+RNA共检；（4）精准，可提供病原和耐药鉴定的精准分型，弥补mNGS细分病原亚型和耐药基因的不足。

有研究显示，tNGS和mNGS对下呼吸道感染标本的微生物检出率无显著差异，且两种方法检出的微生物分布整体一致；在特殊病原体检测方面，tNGS的灵敏度更高[5]。然而，tNGS的敏感性与标本人源背景的高低相关，使其在不同类型的样本中均能发挥较好的性能。当采集样本为肺泡灌洗液等人源细胞含量较高的样本类型时，tNGS敏感性会优于mNGS；当采集样本为脑脊液等人源细胞含量较低的样本类型时，mNGS敏感性可能会优于tNGS。两种NGS检测技术各有优势，tNGS简化了生信分析和结果解读，而mNGS具有更广的检测谱。

另外要注意的是，无论是mNGS还是tNGS，都需要联合传统病原学检测。因为mNGS或tNGS检测到病原核酸并不意味着即为致病菌，应同时送检传统病原学检测，通过联合多种手段的结果互相印证，做出正确诊断；尤其是在所检出病原微生物的序列读数较低、与临床表现不符、检测到少见或罕见病原微生物时，需要结合其他检测手段进行验证。

考虑到tNGS的检测价格较低，未来在社区获得性肺炎病原诊断中相较mNGS具有优势，但是mNGS可检测新发病原体。

鲁炳怀教授进一步分享了中日友好医院成为全国10家LDT（Laboratory Developed Test，实验室自建项目）试点医疗机构，促进mNGS等新型病原诊断技术的落地；同时介绍了具体的使用tNGS辅助诊治的感染案例，以及该院2023年的真菌、分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺卡菌等分离株的检出情况，强调需要加强传统检测手段。

总结

tNGS作为一种新兴的病原诊断技术，在CAP的病原精准诊断中展现出巨大潜力，其用于CAP的病原诊断检出率与mNGS一样优于传统病原学检测方法。研究显示tNGS和mNGS对下呼吸道感染标本的微生物检出率无显著差异，且两种方法检出的微生物分布整体一致；在特殊病原体检测方面，tNGS的灵敏度可以做得更高。但我们需要客观、科学看待tNGS和mNGS二者的优劣势。例如mNGS的检测谱更广、病原覆盖面更全、检测流程也相对更简单，但对生信分析以及结果解读的要求较高；tNGS能在一次检测中兼顾DNA/RNA型病原体，更具卫生经济学价值，并且简化了生信分析和结果解读，但在文库制备环节更耗时且检测谱需要不断优化。

参考文献

[1]Flurin L, Wolf MJ, Mutchler MM, Daniels ML, Wengenack NL, Patel R. Targeted Metagenomic Sequencing-based Approach Applied to 2146 Tissue and Body Fluid Samples in Routine Clinical Practice. Clin Infect Dis. 2022;75(10):1800-1808. doi:10.1093/cid/ciac247

[2]Application of Targeted Next Generation Sequencing Technol_x0002_ogy in the Diagnosis of Mycobacterium Tuberculosis and First Line Drugs Resistance Di_x0002_rectly from Cell-free DNA of Bronchoalveolar Lavage Fluid, Journal of Infection (2023)

[3] 陈华，陈品儒，李艳阳，邓政先，许柳清，梁锋，胡锦兴．靶向高通量测序鉴定非结核分枝杆菌菌种的应用价值[J/OL]．中国防痨杂志.

[4]Liu CF, Song YM, He WC, et al. Nontuberculous mycobacteria in China: incidence and antimicrobial resistance spectrum from a nationwide survey. Infect Dis Poverty. 2021;10(1):59. Published 2021 Apr 29. doi:10.1186/s40249-021-00844-1

[5]Li S, Tong J, Liu Y, Shen W, Hu P. Targeted next generation sequencing is comparable with metagenomic next generation sequencing in adults with pneumonia for pathogenic microorganism detection. J Infect. 2022;85(5):e127-e129. doi:10.1016/j.jinf.2022.08.022