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L-氨基酸氧化酶的结构、底物谱、家族进化及应用研究进展 PDF
1）. 长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 130117； 2）. 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，苏州 215163； 3）. 上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢国家重点实验室，上海 200240
摘要
L-氨基酸氧化酶（LAAO）是一类生物体内参与氨基酸氧化代谢的重要氧化还原酶，能够以氧分子为电子受体催化L-氨基酸氧化脱氨，生成相应的酮酸、氨（NH3）和过氧化氢（H2O2）. 近期发现有些LAAO能够专一性识别特定氨基酸，而不受其他种类氨基酸的干扰，因而在手性胺类化合物拆分、α-酮酸生物合成、临床样本、食品及氨基酸发酵过程中氨基酸含量检测等领域都发挥着重要作用. 本文重点综述目前研究报道的底物专一性LAAO，总结并比较这些酶的酶学性质、结构功能，以及家族进化规律等，并进一步讨论这些酶在生物催化及氨基酸检测中的应用. 本综述将为底物特异性LAAO的分子机制研究及产业应用研究提供重要的素材和指导.
* 国家自然科学基金（31900911，21627812）, 江苏省自然科学基金（SBK2019041665）， 中国博士后面上基金（2019M660129）和长春中医药大学培育基金(2018KJ02)资助项目.
马富强. Tel: 0512-69588303, E-mail: mafuqiang318@sibet.ac.cn
杨广宇. Tel: 021-34207189, E-mail: yanggy@sjtu.edu.cn
L-氨基酸氧化酶（EC.1.4.3.2，L-amino acid oxidase，LAAO）是自然界中普遍存在的氧化还原酶类，能够催化氧化L-氨基酸脱氨生成相应的酮酸、过氧化氢和氨（图1）. 该类酶在生物体内分布广泛，在动物［
1］、植
物［2］、细
菌［3］、真
菌［4］、放线
菌［5］、藻
类［6］中都有相关报道. 细菌、真菌和植物等来源的LAAO主要与氮源的利用和转化有
关［7］. 大多数LAAO属于黄素蛋白家族（flavoproteins），以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）为辅因子. 自从1944年Zeller
等［8］首次对LAAO进行报道以来，科学家们对LAAO的研究已有半个多世纪的历史，对该类酶的酶学性质、分子结构、催化机制等都有较为深入的理解，并将该家族酶广泛应用于疾病治疗、生物合成、生物传感器等各个领域.
图1 L-氨基酸氧化酶催化氨基酸主链氨基（a）和侧链氨基（b）氧化脱氨的反应式
Fig. 1 L-amino acid oxidase catalyzes the oxidative deamination of amino acids. （a）LAAO oxidizes the α-carbon amine. （b）LAAO oxidizes the side-chain amine
LAAO的主要生理功能是参与氨基酸的转化和再利用，因此其底物谱通常比较宽泛，一种酶能够识别并催化多种天然氨基酸. 如来自哥伦比亚珊瑚蛇（Micrurus mipartitus）蛇毒的MipLAAO、来自金环蛇（Bungarus fasciatus）蛇毒的Bf-LAAO能够识别催化多种氨基酸［
9-10］. 近年来，科学家们陆续从不同来源的物种中鉴定出具有高度底物专一性的LAAO，如L-赖氨酸氧化酶、L-精氨酸氧化酶、L-色氨酸氧化酶、L-苯丙氨酸氧化酶、L-谷氨酸氧化酶、L-天冬氨酸氧化酶、甘氨酸氧化酶等，这些LAAO能够专一地催化特定种类的氨基酸，而不受其他种类氨基酸的干扰. 随着越来越多底物专一性LAAO的发现和深入研究，其应用领域也越来越广泛，如在手性胺类化合物拆
分［11-12］、α-酮酸生物合
成［12-13］、临床样本氨基酸含量测
定［14-15］、氨基酸发酵过程监
测［16］、食品营养成分检
测［17-18］等方面都具有重大应用潜力.
本文对目前已报道大多数的氨基酸氧化酶进行调研总结，重点对其中具有高度底物特异性的氨基酸氧化酶的来源、结构功能特征、酶学性质尤其是底物谱性质、家族进化关系进行总结和比较，进一步对这些酶在氨基酸检测、化合物合成方面的应用进行综述.
1 LAAO的结构功能
目前已进行结构表征的大多数LAAO为同源二聚体，具有相似的折叠方式，由α螺旋和β折叠共同组成3个主要结构域：FAD结合结构域（FAD-binding domain）、底物结合结构域（substrate-binding domain）和螺旋结构域（helical domain）（图2a）［
19］. 其中FAD结合结构域具有高度保守的三级结构，FAD辅因子结合在FAD结合结构域和底物结合结构域形成的空腔内，是活性位点的一部分，在催化过程中起到电子传递的作用. 螺旋结构域主要负责两单体二聚作用（
图2b
）［20］.
图2 LAAO晶体结构分析
Fig. 2 Analysis of crystal structures of LAAOs
（a）来自矛头蝮蛇(Bothrops atrox)的LAAO（BatroxLAAO）二聚体三维结构模型，每个单体包含3个结构域：底物结合结构域、FAD结合结构域、螺旋结构域. （b）BatroxLAAO二聚体的结合方式，FAD结合域和螺旋域参与二聚体形成. （c）Cr-LAAO的催化位点，FAD为黄色棒状分子，底物苯丙氨酸为黄色球状分子，催化残基His223和Gly464为绿色棒状分子. （d）Cr-LAAO与Ro-LAAO（同源性仅27%）的结构重叠显示二者具有类似的三维结构，RMSD 为5.8.
目前，对LAAO催化机制的研究尚不透彻，科学家们以不同来源LAAO为研究对象，提出了可能存在不同的催化残基组合，包括His223-Gly464（Calloselasma rhodostom）［
21］、H244-R386-E121（Escherichia coli
）［22］、R143-H2O-T313（Pseudomonas sp. P-501
）［23］等，说明了LAAO家族催化机制的复杂性. 以来源于马来亚蝮蛇（Calloselasma rhodostom）的Cr-LAAO为例，催化残基His223和Gly464，位于FAD结合结构域和底物结合结构域界面处（
图2c），该酶Gly464的羰基氧原子与底物的氨基形成氢键，His223夺取底物的质子化α-氨基的一个氢原子，去质子化之后的氨基氮原子上的孤对电子转移到α-碳原子上，而α-碳原子上的氢转移到FAD辅因子，底物被激活而形成亚胺（亚氨基酸）中间体，亚氨基酸经过自发水解，生成相应的α-酮酸和氨（
图3）［21］. 目前报道晶体结构的LAAO多数来源于蛇毒，近年来陆续有微生物来源的LAAO晶体结构被报道，如来源于硫化叶菌（Sulfolobus tokodaii）的天冬氨酸氧化
酶［24］、不透明红球菌（Rhodococcus opacus）的RoLAA
O［25］、假单胞菌（Pseudomonas sp. P-501）的苯丙氨酸氧化
酶［23］及绿色木霉（Trichoderma viride）的赖氨酸氧化
酶［26］. 通过比较不同来源的LAAO发现，虽然蛇毒来源和微生物来源的LAAO在氨基酸序列上同源性很低，但在三级结构上高度类似，例如Cr-LAAO与Ro-LAAO序列同源性仅为27%，但是对两种酶的晶体结构进行分子重叠却显示出高度的相似性（RMSD 5.8）（
图2d），这说明LAAO的三级结构对其发挥催化功能具有重要作用.
图3 来源于Calloselasma rhodostom的LAAO催化氧化L-苯丙氨酸的反应机理[
21]
Fig. 3 Catalytic mechanism for the oxidation of L-phenylalanine by L-amino acid oxidase from Calloselasma rhodostom[
21]
目前，除了以FAD为辅因子的LAAO之外，科学家们还解析了依赖磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）［
27］、半胱氨酸色氨酸醌（cysteine tryptophylquinone，CTQ
）［28］等其他辅因子的LAAO（
图4）. 这些酶具有与FAD依赖型LAAO不同的催化机制，可能是由不同的祖先蛋白趋同进化而
来［29］. 此外，这些新型LAAO大多具有较高的底物专一性，正逐渐得到越来越广泛的关注和研究.
图4 3种辅因子依赖氨基酸氧化酶的分子结构及推测催化残基
Fig. 4 Molecular structure and catalytic residue of cofactor-dependent amino acid oxidase
（a）CTQ依赖的赖氨酸氧化酶LεO（PDB：3WEV）的晶体结构，玫红色球棍分子结构表示辅因子CTQ.(b)CTQ依赖的赖氨酸氧化酶LεO的活性中心，绿色球棍分子结构表示推定催化残基Gln519、Lys530.（c）FAD依赖的赖氨酸氧化酶LαO（PDB：3X0V）的晶体结构，玫红色球棍分子结构表示辅因子FAD.（d）FAD依赖的赖氨酸氧化酶LαO的活性中心，绿色球棍分子结构表示推定催化残基Asp212、Asp315. （e）PLP依赖的精氨酸氧化酶RohP（PDB：6C3C）的晶体结构，玫红色球棍分子结构表示辅因子PLP.（f）PLP依赖的精氨酸氧化酶RohP的活性中心，绿色球棍分子结构表示推定催化残基Lys235、His34.
2 LAAO家族底物谱进化关系分析
目前缺少对LAAO的家族进化关系分析. 我们对本文中涉及的几种具有代表性的LAAO蛋白序列进行进化树分析，并考察进化树上相邻成员的同源性（图5）. 我们发现两种完全不同功能和来源的蛋白质同源性一般在20%以下. 本文涉及的LAAO大致由5种祖先蛋白进化而来，根据祖先蛋白的不同可以分为5个分支. 具体分析如下：
图5 LAAO家族进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic analysis of the LAAO protein sequences and the homology of the adjacent members in the evolutionary tree
进化树上标注了相邻成员的序列同源性. 蓝色字体表示PLP辅因子，红色字体表示CTQ辅因子，其余黑色字体表示FAD辅因子.
a. 第I分支均为FAD依赖的LAAO，包含了本文研究的大部分LAAO. 从底物特异性来看，第I分支同时包含宽底物谱和底物专一性的LAAO，这从侧面说明了宽底物谱和底物专一性的LAAO具有相同的进化起源.
b. 第II分支也均为FAD依赖的LAAO，从功能上看，第II分支既包含底物特异性的LAAO（色氨酸氧化酶vioA、Ok-AROD和Ps-AROD为精氨酸氧化酶，而Ap-LAAO和Ac-LAAO为宽底物谱的LAAO）. 值得注意的是，虽然色氨酸氧化酶vioA与来自第I分支的La-RebO同属色氨酸氧化酶，但二者并无明显的同源性，可能是由不同祖先蛋白经趋同进化而来.
c. 第III分支包含5个成员：Mm-GO、Mm-LεO、Ms-LεO、Ds-LεO以及Pf-LAAO，其中Pf-LAAO为FAD依赖的LAAO，其余4种LAAO的辅因子为CTQ. 值得注意的是，虽然Pf-LAAO为宽底物谱的LAAO，而Mm-LεO为底物专一性的赖氨酸氧化酶，但二者的序列同源性高达54%，说明它们是由同一个祖先基因进化而来，形成的功能不同、且依赖不同辅因子及不同催化机制的现代酶，这为酶分子进化提供了非常有价值的研究素材，对其进行深入的分子机制及进化轨迹研究，有望揭示LAAO进化的新规律.
d. 第IV分支均为特异性的天冬氨酸氧化酶且都以FAD为辅因子，包括Pp-LAspO、Lh-LAspO、Tl-LAspO和St-LAspO. 值得注意的是，谷氨酸和天冬氨酸在分子结构上非常类似，具有相同的侧链官能团，区别仅在于天冬氨酸相比于谷氨酸少一个亚甲基，但是已报道的天冬氨酸氧化酶对谷氨酸基本无活性（图6）. 相比之下，谷氨酸氧化酶 （Sp-LGOX和Ss-LGOX）属于第I分支，其对天冬氨酸也几乎无活性，上述现象说明这两类专一性的氨基酸氧化酶来源于不同的祖先蛋白，从而造成了这两类酶高度专一的底物偏好性. 深入研究这两类酶的底物结合识别模式，有助于揭示酶对高度类似底物特异性差异的分子机制.
图6 目前已报道的部分代表性LAAO的底物谱性质
Fig. 6 Substrate specificity properties of some typical LAAOs
每一行代表不同LAAO，每一列代表LAAO对20种天然氨基酸之一的相对比活力，右侧渐变条对应相应的数值0~100，代表同一种酶对不同底物的相对活力，以活力最高的底物为100%.
e. 第V分支为PLP依赖的精氨酸氧化酶Ind4及RohP，这类酶应该是单独一个祖先基因进化而来. 来源于第II分支的Ok-AROD和Ps-AROD也是底物专一性的精氨酸氧化酶，但与Ind4及RohP分别来源于不同祖先蛋白，也属于趋同进化的现象.
通过比对不同分支的底物谱性质可以发现，宽底物谱LAAO的进化关系较为复杂，分布于I、II、III等不同分支，说明了其起源的多样性. 以上这些现象说明了氨基酸氧化酶来源及功能进化的多样性，为进一步深入研究氨基酸氧化酶的家族进化及亚家族分类提供了线索.
3 LAAO的底物谱特征
3.1 宽底物谱的LAAO
目前发现的大多数LAAO（如几乎所有蛇毒来源的LAAO）都是宽底物谱的，能够识别并催化多种氨基酸. 但这些广谱LAAO的底物谱也各有不同：有的能够催化所有20种天然氨基酸，如来自海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra strain C2的Pf-LAAO［
30］和来自北里孢菌（Kitasatospora cheerisanensis）的Kc-LAA
O［31］（
图6），但它们对不同氨基酸表现出明显的偏好性，相对活力可以相差上百倍；有的只能催化部分氨基酸种类，如贝伦珊瑚蛇（Micrurus lemniscatus）蛇毒中的Ml-LAAO，能够识别L-酪氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸等多种疏水性氨基
酸［32］；加州海兔（Aplysia californica）中的Ac-LAAO能够识别L-精氨酸、 L-赖氨酸等亲水性的碱性氨基
酸［33］；也有一些宽底物谱的LAAO既能够识别疏水性氨基酸，也能识别亲水性氨基酸，如哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum ETS 323）中的Th-LAAO能够识别L-苯丙氨酸、L-丙氨酸等疏水性氨基酸，也能够识别 L-赖氨酸、L-谷氨酸等亲水氨基酸（
表1）［34］. 不同底物偏好性的LAAO为研究酶的底物特异性分子机制提供了丰富的素材.
表1 目前已发现的针对不同类型氨基酸的LAAO总结
Table 1 A summary of LAAO for different types of amino acids has been found so far
氨基酸类型包含氨基酸种类目前是否发现专一性LAAO 非极性脂肪族侧链氨基酸 G、A、P、V、L、I、M 除了G，其他均未发现 极性、不带电荷的侧链氨基酸 S、T、C、N、Q 均未发现 芳香族侧链氨基酸 F、W、Y F、W都有发现，Y未发现 带正电荷的（碱性）侧链氨基酸 K、R、H 均有发现 带负电荷的（酸性）侧链氨基酸 D、E 均有发现3.2 底物专一性LAAO
随着对LAAO研究的不断深入，越来越多的底物专一性LAAO被发现，这些底物专一性的LAAO大多是微生物来源的. 通过对目前已报道的底物专一性LAAO进行总结比较发现，底物专一性LAAO种类分布与底物氨基酸类型（极性、电荷等）呈现一定的规律性（表1）. 在非极性脂肪族侧链氨基酸中，除了特异性的甘氨酸氧化酶被发现外［
35-36］，其他如L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸等氨基酸都没有发现相应的专一性LAAO；所有的极性、不带电荷的侧链氨基酸（L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、 L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺）都尚未发现相应的专一性LAAO；在芳香族侧链氨基酸中，除了L-酪氨酸没有发现专一性的LAAO，L-苯丙氨酸、L-色氨酸都发现了多种专一性的LAA
O［37-39］；所有的酸性侧链氨基酸（L-天冬氨酸、L-谷氨酸）和碱性侧链氨基酸（L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸）也都发现了多种专一性的LAA
O［40-47］. 由此可见，目前发现的底物专一性LAAO多是针对具有带电或芳香族官能团侧链的氨基酸，这种现象可能与酶的底物选择性分子机制有关，即通过改变底物结合口袋的组成氨基酸残基来调节静电作用力、空间位阻等参数，可以比较容易地实现对带电或芳香族侧链氨基酸底物的专一性识别，而较难实现对侧链大小相差不大、不能产生较强的酶-底物作用力的其他氨基酸的专一性识别. 另外，有必要通过进一步的研究来考察自然界是否存在针对其他非极性侧链氨基酸的专一性LAAO，以及能否通过蛋白质工程手段获得对其他类型氨基酸具有专一性的LAAO突变体，这将对于深入了解底物特异性机制、探讨自然进化是否存在序列空间的盲区（即无法考察所有可能的突变类型）产生重要启发.
从底物专一性的严格程度上看，目前发现的底物专一性LAAO中，有些酶具有高度的专一性，只能特异性识别特定底物，对其他氨基酸，甚至是结构类似的氨基酸均无活性（表2）. 来自端链霉菌（Streptomyces endus）的谷氨酸氧化酶，对谷氨酸的比活力是6 U/mg，但对类似物谷氨酰胺、天冬氨酸，以及其他氨基酸均无活性［
48］；来自超嗜热古菌（Pyrococcus horikoshii OT-3）的天冬氨酸氧化酶，对天冬酰胺和谷氨酸，以及其他氨基酸也无明显活
性［49］；来自地中海海洋单胞菌（Marinomonas mediterranea NBRC 10302
8T）的赖氨酸氧化酶，对赖氨酸的比活力是36.9 U/mg，对精氨酸以及其他氨基酸均无活
性［14］. 这些例子为研究高度底物特异性识别机制提供了良好的素材. 相比于这些高度专一的酶，还有一些除了对偏好底物有较高的活性，对偏好底物的类似氨基酸也有一定活性（
表2）. 例如：来自紫色链霉菌（Streptomyces violascence）的谷氨酸氧化酶，除了对谷氨酸的比活力为60.3 U/mg，对谷氨酰胺也有一定活性，比活力为19.3 U/m
g［50］；来自黄绿木霉菌（Trichoderma cf. aureoviride Rifai VKM F-4268D）的赖氨酸氧化酶，除了对L-赖氨酸的比活力为 90 U/mg，对L-精氨酸和非蛋白质氨基酸L-鸟氨 酸也具有较弱活性，比活力分别为5.2 U/mg、 7.5 U/m
g［51］；来自假单胞菌（Pseudomonas sp. TPU 7192）的精氨酸氧化酶能够识别L-精氨酸，同时也能识别L-赖氨酸，比活力为0.019 U/m
g［15］. 还有些酶能够特异性识别带有芳香环侧链的底物，如来自紫色杆菌（Chromobacterium violaceum ATCC 12472
）［52］和海洋链霉菌（Streptomyces sp. TP-A0274
）［53］的色氨酸氧化酶能够识别L-色氨酸，也能够轻微识别L-苯丙氨酸，可能是由于两种氨基酸具有疏水的芳香环；来自鬼伞属真菌（Coprinus sp. SF-1）的色氨酸氧化酶，能够识别L-色氨酸，同时能够轻微识别L-苯丙氨酸和L-酪氨
酸［54］. 底物特异性的LAAO为我们研究底物特异性分子机制，以及探讨不同底物特异性LAAO的进化关系，也提供了重要的素材.
表2 本文中列举的不同底物特异性的LAAO的来源、底物特异性、比活力等酶学性质
Table 2 The source,substrate specificity and specific activity of LAAO with different substrate specificity listed in this paper
L-氨基酸氧化酶来源底物特异性比活力/(U·mg-1)参考文献 As-LAAO Aquimarina sp. strain antisso-27 宽谱（最优亮氨酸） 未报道 [3] Bf-LAAO Bungarus fasciatus 宽谱（最优酪氨酸） 41.99 [10] Pf-LAAO Pseudoalteromonas flavipulchra strain C2 宽谱（最优赖氨酸） 未报道 [30] Kc-LAAO Kitasatospora cheerisanensis 宽谱（最优谷氨酸） 未报道 [31] Ml-LAAO Micrurus lemniscatus snake venom 宽谱（最优酪氨酸） 800 [32] Ac-LAAO Aplysia californica 宽谱（最优精氨酸） 未报道 [33] Th-LAAO Trichoderma harzianum ETS 323 宽谱（最优苯丙氨酸） 未报道 [34] Sj-LαO-rAIP Scomber japonicus 专一（赖氨酸） 6.5 [43] Mm-LεO Marinomonas mediterranea 专一（赖氨酸） 未报道 [44] Tv-LαO Trichoderma viride Y244-2 专一（赖氨酸） 66.2 [45] Tc-LαO Trichoderma cf. aureoviride Rifai VKM F-4268D 专一（赖氨酸） 90 [51] Mm-N-LεO Marinomonas mediterranea NBRC103028T 专一（赖氨酸） 36.9 [14] Ps-AROD Pseudomonas sp. TPU 7192 专一（精氨酸） 0.19 [15] Ok-AROD Oceanobacter kriegii 专一（精氨酸） 未报道 [29] AncARODn0 Artificial design ,predicted ancestral gene 专一（精氨酸） 未报道 [29] AncARODn1 Artificial design ,predicted ancestral gene 专一（精氨酸） 未报道 [29] AncARODn2 Artificial design ,predicted ancestral gene 专一（精氨酸） 未报道 [29] RohP Streptomyces cattleya NRRL 8057 专一（精氨酸） 未报道 [27] Ind4 Streptomyces griseus ATCC 12648 专一（精氨酸） 未报道 [46] staO Streptomyces sp. TP-A0274 专一（色氨酸） 0.08 [55] vioA Chromobacterium violaceum ATCC 12472 专一（色氨酸） 未报道 [55] La-RebO Lechevalieria aerocolonigenes ATCC 39243 专一（色氨酸） 未报道 [37] TOD Coprinus sp. SF-1 专一（色氨酸） 362 [54] Cc-LPOX Coprinopsis cinereus 专一（苯丙氨酸） 6.04 [12] Ps-LPOX Pseudomonas sp. P-501 专一（苯丙氨酸） 102.5 [38] IL4I1 Humen 专一（苯丙氨酸） 3.236 [39] Se-GLOD Streptomyces endus 专一（谷氨酸） 6 [48] Sp-GLOD Streptomyces platensis NTU 3304 专一（谷氨酸） 未报道 [57] Ss-18-GLOD Streptomyces sp. 18G 专一（谷氨酸） 152.4 [40] Ss-Z-GLOD Streptomyces sp. Z-11-6 专一（谷氨酸） 50.8 [5] Ss-X-LGOX Streptomyces sp. X-119-6 专一（谷氨酸） 55.1 [41] Sv-GLOD Streptomyces violascence 专一（谷氨酸） 60.3 [50] Pp-LAspO Pseudomonas putida 专一（天冬氨酸） 未报道 [66] Ph-LAspO Pyrococcus horikoshii OT-3 专一（天冬氨酸） 3.2 [49] Tl-LAspO Thermococcus litoralis DSM 5473 专一（天冬氨酸） 3.86 [42] St-LAspO Sulfolobus tokodaii 专一（天冬氨酸） 0.98 [11] Ec-LAspO Escherichia coli 专一（天冬氨酸） 0.085 [47] Bs-GO Bacillus subtilis MT-2 专一（甘氨酸） 0.46 [35] Mm-GO Marinomonas mediterranea 专一（甘氨酸） 0.057 [36] HisOX Brevibacillus borstelensis KAIT-B-022 专一（组氨酸） 未报道 [60]4 应用
底物专一性LAAO由于具有能够特异性识别某一种氨基酸，而不受其他杂质成分的干扰、副产物少等优点，在α-酮酸制备、手性胺拆分及在临床、食品等领域中对氨基酸的检测都有广泛的应用前景.
4.1 LAAO在氨基酸检测中的应用
专一性LAAO能够特异性识别特定氨基酸，避免其他组分的干扰，是临床样本、食品、发酵样品中氨基酸检测的核心酶. 例如，L-色氨酸作为血清素的前体，与抑郁症、纤维藻等有关，被确定为诊断炎症性肠病的有用生物标志物.
Kameya等［
55］利用两种色氨酸氧化酶对人体血液中L-色氨酸的含量进行检测.
谷氨酸是世界上产量最大的氨基酸品种，是重要的食品增鲜剂及医药分子，同时也是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，是人体重要的生理指标，因此对其含量进行检测具有重要意义.
Maity等［
56］利用谷氨酸氧化酶开发了一种高灵敏度和选择性的L-谷氨酸传感器，用于人体血液中L-谷氨酸浓度的测定；Kusakabe
等［18］用谷氨酸氧化酶测定酱油中的L-谷氨酸含量；Chen
等［57］利用谷氨酸氧化酶开发了一种安培L-谷氨酸传感器，用于发酵过程中L-谷氨酸浓度的测定.
高糖血症是先天性赖氨酸代谢异常的疾病，通常伴随着许多其他先天性疾病，包括尿素循环紊乱、丙酮酸羧化酶缺乏症和有机酸紊乱［
58］. Matsuda
等［14］用地中海海洋单胞菌（Marinomonas mediterranea NBRC10302
8T）中的赖氨酸氧化酶检测血液中赖氨酸的含量；Isobe
等［59］用该酶与绿色木霉菌（Trichoderma viride Y244-2）中的赖氨酸氧化酶对L-赖氨酸检测进行了比较，并用超高效液相色谱法（UPLC）进行验证，发现前者更接近UPLC检测值，可能是由于前者的底物谱更专一. 赖氨酸还是一种重要的必需氨基酸，Ciriello
等［17］将赖氨酸氧化酶通过共价偶联固定在过氧化聚吡咯修饰的铂电极上，用来检测奶酪中的L-赖氨酸含量. 赖氨酸主要通过发酵法制备，对发酵过程中的赖氨酸产量进行实时监控具有重要意义. Romette
等［16］将赖氨酸氧化酶固定在明胶载体中，并固定在氧电极传感器上，用于连续流动系统中对发酵罐中L-赖氨酸的浓度进行测量.
L-组氨酸是一种必需氨基酸，人体无法自身合成，它必须在饮食中才能提供给身体，L-组氨酸广泛存在于肉类、家禽和鱼类中，少量的游离态存在于植物和发酵食品中. Kiba等［
60］将组氨酸氧化酶固定在树脂化聚乙烯醇的珠子上，利用含有固定过氧化氢酶的传感器对产生的过氧化氢进行检测，从而用来分析鱼肉中L-组氨酸的含量.
上述成功的案例表明，相比于传统的高效液相色谱（HPLC）或电喷雾离子法串联质谱法（MS-MS），基于氨基酸氧化酶的氨基酸检测方法具有操作简单、检测速度快、成本低、特异性高的优势［
15，17］.
4.2 LAAO在生物催化方面的应用
LAAO在手性胺拆分、α-酮酸制备等生物催化领域也有多种应用潜力. Singh等［
61］利用宽谱的氨基酸氧化酶对DL-氨基酸（DL-丙氨酸、DL-苯丙氨酸和DL-酪氨酸）进行拆分，反应1 h后D-丙氨酸光学纯度为100%，D-苯丙氨酸和D-酪氨酸分别为80.2%、84.1%. Bifulco
等［11］利用重组天冬氨酸氧化酶对DL-天冬氨酸进行拆分，反应24 h后，L-天冬氨酸几乎被完全氧化，D-天冬氨酸纯度高于99.5%. Zhang
等［12］利用苯丙氨酸氧化酶对DL-苯丙氨酸进行拆分，100 min内L-苯丙氨酸被完全氧化，并且利用苯丙氨酸氧化酶对L-苯丙氨酸催化转化成苯丙酮酸，8 h内转化率达97.4%（
图7）. Rao
等［31］利用宽谱的氨基酸氧化酶制备α-酮戊二酸，在最佳条件下，120 g/L的L-谷氨酸可制备103 g/L的α-酮戊二酸. Niu
等［13］利用谷氨酸氧化酶制备α-酮戊二酸，在最佳条件下反应24 h， 110 g/L的L-谷氨酸可制备104.7 g/L的α-酮戊二酸. α-酮酸制备过程中，涉及到过氧化氢的积累，从而影响α-酮酸的产量，因此在反应过程中，移除过氧化氢有利于提高α-酮酸的产量. Wu
等［62］通过在细胞内共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的级联生物催化促进工程，提高α-酮戊二酸的产量，在最佳条件下（谷氨酸氧化酶∶过氧化氢酶为2.1∶ 1 185），110 g/L的L-谷氨酸可制备106 g/L的α-酮戊二酸，转化率高达96%. 随着高活性、高稳定性的LAAO被不断开发，有望在多种重要精细化工品的生物催化领域起到重要作用.
图7 L-苯丙氨酸氧化酶在生物催化方面的应用
Fig. 7 Applications of L-phenylalanine oxidases in biocatalysis
图为D,L-天冬氨酸拆分过程，虚线框内为苯丙酮酸制备过程.
4.3 LAAO的催化机制研究及分子改造
天然LAAO在应用时往往存在催化活性不高、底物特异性不佳等问题，通常需要经过分子改造才能满足要求. 近年来，随着对多种LAAO晶体结构的陆续解析以及对该类酶构效关系认识的不断深入，使人们有能力通过蛋白质工程手段对LAAO进行分子改造，以提升其性能，满足实际应用的需求，同时进一步加深对LAAO家族结构-功能机制的理解. Chen等［
63］对来自拉塞尔蝰蛇（Russell’s viper）蛇毒的LAAO晶体结构进行了分析并推测H223为关键活性位点，结合关键位点饱和突变方法，探讨了其催化机制. 结果发现，残基H223并不是其催化活性所必需的，但是该残基对底物特异性有重要影响. 相比于野生型Dr-LAAO，突变体H223A和H223S对L-精氨酸有更高的偏好性，H223A突变型Dr-LAAO对L-精氨酸的催化效率是天然Dr-LAAO的5倍，H223S催化效率提高约3倍；相比之下，这两种突变体对其他氨基酸底物，如L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-甲硫氨酸的活性提升不明显，说明H223位点能够影响该酶的底物特异性. Daisuke
等［64］对来自地中海海洋单胞菌（Marinomonas mediterranea NBRC 10302
8T）的 L-赖氨酸氧化酶LodA进行催化活性改造，最终获得的突变酶LodA7mut较天然LodA活性无明显变化，但提高了底物专一性，对L-鸟氨酸的相对活性由15.1%降低为3.7%. Daisuke
等［65］对来自假单胞菌（Pseudomonas sp. AIU 813）的L-氨基酸氧化酶的晶体结构进行分析，结合关键位点饱和突变方法，鉴定出的单点突变C254I能够将该酶的氨基酸氧化酶活性提升5倍. 总体来说，人们对LAAO分子改造仍处于初级阶段，大多是基于晶体结构分析的关键位点进行定点突变，突变体的性能提升效果有限. 随着LAAO高通量筛选方法的建立，有望通过定向进化方法获得性能大幅度提升的突变体，从而推动LAAO的实际应用.
5 总结与展望
由于目前人们从自然界发现的底物专一性LAAO种类和数量仍较少，远远不能满足日益增长的氨基酸检测、生物化工方面的应用. 一方面能够通过宏基因组学技术从自然环境获取新酶资源，如基于序列预测的宏基因组挖掘和基于功能筛选的宏基因组筛选. 另一方面，利用蛋白质工程手段对天然酶进行分子改造，以获得催化活性提升、稳定性提升、底物专一性提升的突变酶［
66］，是目前LAAO研究的热点方向. 随着越来越多底物专一性LAAO的发现，该类酶将更加广泛地用于生物样本（血液、组织液、发酵产物、食品等）中的氨基酸检测，以及用于生物催化，如从外消旋的氨基酸中拆分光学纯氨基酸、催化合成α-酮酸等.
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