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花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

花匠小妙招
2024-11-07 14:36

相比于陆地环境，鱼类赖以生存的水环境更加复杂多变，这对鱼类的渗透调节能力提出了更高的要求。硬骨鱼类的渗透调节主要通过激活参与离子运输的离子转运蛋白和通道实现[1-3]。而溶质载体转运家族12(solute carrier family 12，SLC12)的成员编码阳离子-氯离子共转运体，参与细胞体积调节、氯离子浓度调节和血压调节等多个过程[4]，对于维持机体的稳态平衡至关重要。该家族内的基因高度同源，编码的蛋白主要分为两个功能分支，其一是Na+驱动的蛋白家族, 由Na+-Cl−协同转运蛋白(NCC)和Na+-K+-2Cl−协同转运蛋白(NKCC)组成；另一分支是K+驱动的K+-Cl−协同转运蛋白家族(KCCs)，由KCC1-KCC4组成[5-6]。

在硬骨鱼中，NCC一般分为2个亚型，NCC1和NCC2。其中，ncc1基因的表达主要集中在肾脏组织。如在广盐性的暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)中发现，ncc1在肾脏中高度表达，其表达量在由淡水转入海水的适应过程中逐渐下调；而适应于海水生活的红鳍东方鲀(T. rubripes)肾脏中ncc1的表达量相对于广盐性的暗纹东方鲀较低[7]。同样，在莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)的肾脏中也发现了淡水驯化过程中ncc1表达升高的趋势[8]。但在欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)中，鳃和肾脏ncc1的表达量在淡水与海水驯化2周后的个体之间不存在显著差异[9]，表明ncc1在不同物种中的渗透调节功能存在一定的差异。而ncc2主要在鳃组织中表达，对莫桑比克罗非鱼的研究表明，其编码蛋白主要位于淡水型离子细胞的顶端，主动参与离子吸收过程[10]，与血浆Na+和Cl−水平呈负相关，是鳃Na+和Cl−摄取过程的关键转运蛋白，对于跨上皮的Na+和Cl−摄取至关重要[1, 11]。在淡水驯化两周的欧洲鲈中，ncc2在鳃中的表达量与海水个体相比显著上调，推测ncc2通过吸收Na+和Cl−维持机体的离子稳态[2, 12]。在莫桑比克罗非鱼中，ncc2在鳃中的表达量在由海水向淡水的适应过程中也发生显著上调[8, 13]，表明NCC在广盐性鱼类适应淡水环境中发挥着重要作用。

多数硬骨鱼的NKCC也具有两个亚型，NKCC1和NKCC2，主要位于上皮细胞的基底外侧质膜上，主动参与离子分泌过程[10]。NKCC1主要在海水驯化的硬骨鱼鳃和板鳃类直肠腺的离子细胞的基底外侧发挥重要作用，NKCC2则在淡水驯化的硬骨鱼鳃、肾以及海水驯化的硬骨鱼肠道离子细胞的顶膜内表达[13-15]。底鳉(Fundulus heteroclitus)由半咸水环境转入海水环境后，鳃中nkcc1的表达呈现即时的上升，而由半咸水转淡水后nkcc1的表达量逐渐下降[16]。莫桑比克罗非鱼在三周的海水驯化过程中，nkcc1a在鳃、食道和肠中的表达量均显著上调[15]。同样，卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)在海水适应过程中，nkcc1a在鳃和肠中的表达水平显著上调[17]。欧洲鲈中的研究也表明，由海水转至淡水环境后nkcc1的表达量下降[18]。而nkcc2在适应海水生活的红鳍东方鲀肾脏集合管中高度表达，可能通过介导NaCl的再吸收参与红鳍东方鲀对于海水的适应过程[7]。上述结果表明，NKCC对于硬骨鱼类适应高渗环境至关重要。

花鲈(Lateolabrax maculatus)又称中国花鲈，俗称海鲈、寨花等，是一种广盐性的重要经济鱼类，也是渗透调节机制研究的理想模式鱼。本实验基于花鲈基因组、转录组等数据对花鲈ncc基因进行了鉴定，结合课题组前期已鉴定出的nkcc基因，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了ncc和nkcc各基因在海、淡水花鲈鳃组织中的表达模式，并通过原位杂交探究了其在海、淡水花鲈鳃组织中的表达定位。研究结果不仅有助于解析花鲈及其他广盐性鱼类的渗透调节与盐度适应机制，还为区分海、淡水养殖花鲈提供了分子标志物，在理论研究及服务养殖生产方面均提供了重要的基础数据。

1. 材料与方法

1.1 基因鉴定及系统进化分析

在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载人(Homo sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、红原鸡(Gallus gallus)、斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、底鳉、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、日本青鳉(Oryzias latipes)、欧洲鲈等几种常见脊椎动物的NCC氨基酸序列，使用TBtools软件的TBLASTEN比对到花鲈参考基因组(PRJNA407434)及全长转录组数据库(PRJNA515783)，获得候选核苷酸序列。使用ORF(open reading frame) Finder在线网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测氨基酸序列。使用BLASTP比对NCBI非冗余蛋白序列数据库进一步验证。选择花鲈和上述物种的NCC氨基酸序列进行系统进化分析，使用MEGA 7.0软件的NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树。

1.2 序列分析

使用ExPASy Prot-Param在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白分子量(MW，ku)和等电点(pI)。通过MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)在线网站进行保守结构域预测，并利用TBools软件使其可视化。使用CDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)预测花鲈ncc基因的特征结构域。使用NCBI和DNAMAN对蛋白序列进行同源比对分析。

1.3 盐度转换实验

实验所用的花鲈由青岛市黄岛区鲁海丰海洋牧场提供。驯化实验前，所用花鲈生活的水环境盐度为30.00 ± 0.50。随机选取30尾健康的花鲈成鱼[(40.50 ± 3.21) cm，(812.20 ± 25.71) g]平均分配到6个400 L的塑化桶中，分别为3桶海水组(SW，盐度：30.00 ± 0.50，pH：8.30 ± 0.30)、3桶淡水组(FW，盐度：0 ± 0.50，pH：7.50 ± 0.30)，每桶5尾鱼，驯化3周。在此期间于每日9：00和16：30投喂配合饲料，在投喂1 h后除粪便和残饵，每隔1 d换水，换水量为50%。驯化3周后进行盐度转换实验，将淡水组花鲈迅速转入海水中，记为FW-SW组；将海水组花鲈迅速转入淡水中，记为SW-FW组，在实验过程中温度[(16.00 ± 0.50) °C]、溶解氧[(7.10 ± 0.40) mg/L]等条件保持不变。

选取盐度转换前后的4个时间点(0 h、1 d、3 d和7 d)，每个时间点分别于FW-SW组和SW-FW组的3个桶中随机选取3尾鱼，用MS-222(200 mg/L)进行麻醉后捞出解剖，取鳃组织。一部分样品于液氮中进行速冻而后转移至−80 °C冰箱中保存，用于后续RNA的提取；另一部分于4% PFA中保存，固定12~24 h后换70%乙醇(DEPC水配)，固定样品保存于−20 °C冰箱中，用于原位杂交实验。实验过程中操作人员严格遵守中国海洋大学关于实验动物使用的伦理规范，并按照中国海洋大学伦理委员会制定的规章制度执行(审批号：20141201)。

1.4 RNA提取及qRT-PCR分析

用TRIzol(Invitrogen，美国)法提取花鲈鳃组织RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳来检测RNA的完整性，用BD1000核酸分析仪来测定RNA浓度。使用反转录试剂(HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper))(Vazyme，中国)将提取的RNA反转录为cDNA。使用Primer premier 5.0软件及Primer-BLAST网站设计花鲈ncc和nkcc基因特异性定量引物，花鲈18S rRNA基因作为内参[19]，引物序列见表1。qRT-PCR实验在StepOnePlusTM Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, 美国)上进行，以花鲈鳃组织cDNA为模板，使用试剂盒为ChamQ TM SYBR® Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed)(Vazyme，中国)，反应体系为2 × ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed) 5.0 µL，上下游引物各0.2 µL，模板cDNA 1.0 µL，ddH2O 3.6 µL，共计10 µL。qPCR反应程序：95 °C 30 s；95 °C 10 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，40个循环。每个时间点的鳃组织样品有3个生物学重复，每个样品设3个技术重复，并采用2−△△CT法计算花鲈ncc、 nkcc基因的相对表达水平。

表 1 实验用引物

Table 1. Primers sequence in the study

基因
genes引物(5′-3′)
primers (5′-3′) qPCR ncc1 F: TGGGGDGTGATCCTGTACCT R: AAGAAGTTGGAGATGATBGGAGC ncc2 F: GGGCGTATTTCATGATCTCC R: AATCCCGCATCATGTCAACG nkcc1a F: ACGCTCATCACCTGGAAGTC R: TCAGCGCTCAGTCACAAAC nkcc1b F: CGCAGAGACCGTCGTTGAGATG R: CAGCAGGATGAACAGGAGGACAATC nkcc2 F: ATCCTACGCCAAGTCTCCAG R: GCAGCCCACCAGTTGATAA 原位杂交探针
ISH probe sequences nkcc1a F: CCCAGGCTCTGACCTACCA R: AATCAGCGTCAGAGTCTTTAC ncc2 F: CTCATCCCTCCCAGTCCAGA R: ACTTTAGGGGCGGAAACGAG 1.5 原位杂交定位

使用Primer premier 5.0软件和Primer-BLAST网站设计花鲈ncc2和nkcc1a基因的探针合成引物，在上游、下游引物5′端添加SP6和T7启动子，引物序列见表1。以花鲈鳃组织cDNA为模板，使用2 × Phanta® Max Master Mix (Dye Plus)进行PCR反应，通过Sanger测序验证产物序列准确性，使用DIG RNA labeling kit (SP6/T7)(Roche Diagnostics，德国)试剂进行体外转录，分别合成DIG标记的正义、反义探针。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测所合探针的完整性，用BD1000核酸分析仪测定探针浓度，于−80 °C冻存备用。

固定好的花鲈鳃组织于电脑程控组织脱水机(PPDT-12C)中脱水、浸蜡，而后进行石蜡包埋。用LEICA-RM206切片机进行切片，切片厚度为7 µm，40 °C水浴展片后置于防脱载玻片上，37 °C烘箱过夜烘干。烘干后的组织切片分别于二甲苯和梯度乙醇中脱蜡、复水，使用合成的探针进行预杂交、杂交实验，利用NBT/BCIP显色液(Roche Diagnostics，德国)进行显色。梯度乙醇脱水和二甲苯处理后，中性树胶封片，自然晾干后使用显微镜(OLYMPUS BX53)拍照观察。

2. 结果

2.1 花鲈ncc基因的鉴定及序列分析

在花鲈中共鉴定得到2个ncc基因，即ncc1和ncc2。ncc1编码区长度为2 691 bp，编码896个氨基酸，预测蛋白分子量为98.07 ku，等电点为8.57。ncc2基因编码序列(CDS)编码区长度为3 120 bp，编码1 039个氨基酸，预测蛋白分子量为116.06 ku，等电点5.90。花鲈ncc1、ncc2基因cDNA 序列已经提交到GenBank，登录号为OP004349-OP004350。

2.2 氨基酸序列比对及同源性分析

将预测的花鲈NCC1氨基酸序列与其他几种脊椎动物进行同源比对，结果如图1所示，花鲈NCC1与欧洲鲈的同源性最高为85%，其次是底鳉80%，与其他硬骨鱼类的同源性为73%~79%，与高等脊椎动物的同源性较低为57%。预测的花鲈NCC1蛋白含有10个相对保守的跨膜螺旋区及5个N-糖基化位点，其中有3个位点(N1、N3、N5)在脊椎动物中高度保守，N2和N4两个位点只在硬骨鱼类中保守，N1位于跨膜螺旋区(图1)。其预测的蛋白结构如图2-a所示。将预测的花鲈NCC2氨基酸序列与其他物种进行同源比对，结果显示，花鲈NCC2与日本青鳉NCC2的两个亚型同源性最高为81%，与斑马鱼NCC2各个亚型之间的同源性为60~68%，与高等脊椎动物的同源性为58%(图3)。而花鲈NCC2蛋白含有11个较为保守的跨膜螺旋区及6个N-糖基化位点，其中有3个位点(N1、N4、N5)在脊椎动物中高度保守，另外3个位点(N2、N3、N6)仅在硬骨鱼类中高度保守，N1和N5位于跨膜螺旋区(图3)。其预测的蛋白结构如图2-b所示。

图 1 花鲈与其他物种NCC1氨基酸序列的多重比对

图中黑色框标注的TM1～TM10代表跨膜螺旋区，N1～N5代表糖基化位点；红色区域为完全相同区域，蓝色框为较高相似区域。

Figure 1. Multiple alignment comparisons of the NCC1 amino acid sequences of L. maculatus with other species

The black frame marked TM1-TM10 represents the transmembrane helical region, and N1-N5 represent the N-glycosylation sites; the red domains are identical domains, and the blue boxes are highly similar domains.

图 2 花鲈NCC1(a)、NCC2(b)的预测蛋白三维结构

Figure 2. Predicted three-dimensional structure of NCC1(a) and NCC2(b) of L. maculatus

图 3 花鲈与其他物种NCC2氨基酸序列的多重比对

图中黑色框标注的TM1～TM11代表跨膜螺旋区，N1～N6代表糖基化位点；红色区域为完全相同区域，蓝色框为较高相似区域。

Figure 3. Multiple alignment comparisons of the NCC2 amino acid sequences of L. maculatus with other species

The black frame marked TM1-TM11 represents the transmembrane helical region, and N1-N6 represent the N-glycosylation sites; the red domains are identical domains, and the blue boxes are highly similar domains.

2.3 系统进化分析

将其他几种脊椎动物的NCC氨基酸序列与花鲈NCC氨基酸序列一起构建系统进化树，结果显示，高等脊椎动物NCC聚成一枝，随后与硬骨鱼类NCC1聚为一枝，另一枝由硬骨鱼类NCC2组成，该聚类结果进一步验证了花鲈ncc基因命名的准确性 (图4)。

图 4 NCC氨基酸序列构建的系统发育树

图中用红色三角形标注花鲈在系统进化树中的位置。

Figure 4. Phylogenetic tree of NCC amino acid sequences

Red triangles are used to mark the NCC amino acid sequences of L. maculatus in the phylogenetic tree.

2.4 ncc和nkcc在海、淡水花鲈鳃组织中的表达水平分析

通过qRT-PCR对ncc1、ncc2在海、淡水花鲈鳃中的表达模式进行检测。结果显示，ncc1在海水(SW)、淡水(FW)花鲈鳃中的表达量无显著差异，而ncc2在淡水鳃组织中的表达量显著高于海水鳃组织的表达量，约为SW的3.22倍(图5-a)。

图 5 花鲈ncc (a)、nkcc (b)基因在海、淡水鳃组织中的相对表达水平

(a) 1. ncc1，2. ncc2， (b) 1. nkcc1a，2. nkcc1b，3. nkcc2；*表示差异显著，P <0.05。

Figure 5. Relative expression levels of ncc (a), nkcc (b) genes in seawater and freshwater gill tissues of L. maculatus

(a) 1. ncc1, 2. ncc2, (b) 1. nkcc1a, 2. nkcc1b, 3. nkcc2; * indicates significant difference, P < 0.05.

课题组前期已经鉴定出3个花鲈的nkcc基因(nkcc1a、nkcc1b和nkcc2)[20]。本实验通过qRT-PCR对nkcc1a、nkcc1b和nkcc2在海、淡水花鲈鳃中的表达模式进行检测。结果显示，nkcc1b和nkcc2在海水、淡水花鲈鳃中的表达量无显著差异，而nkcc1a在海水鳃组织中的表达量显著高于淡水鳃组织中的表达量，约为FW的2.13倍 (图5-b)，这与之前的研究基本一致[20]。以上结果表明，花鲈鳃组织中的ncc2与nkcc1a分别在适应淡水、海水的渗透调节过程中发挥重要作用。

2.5 花鲈ncc2、nkcc1a在盐度驯化中的表达量分析

为进一步探究ncc2、nkcc1a在海水、淡水驯化中过程中的表达模式，对花鲈在驯化中不同时间点的鳃组织进行qRT-PCR检测。在海水驯化(FW-SW)过程中，ncc2的表达量呈逐渐下调的趋势，由淡水转入海水后的1、3、7 d，ncc2的表达量分别下调至0 h的66.10%、51.60%与37.95%(图6-a)。相反，在整个淡水驯化(SW-FW)过程中，ncc2的表达量呈逐渐上调的趋势，由海水转入淡水后的1、3、7 d，ncc2的表达量分别上调为0 h的1.58倍、2.02倍与2.99倍。

图 6 花鲈鳃组织中的ncc2 (a)、nkcc1a (b)在盐度驯化过程中的相对表达水平

不同字母代表显著性差异，P <0.05。

Figure 6. Relative expression levels of ncc2 (a) and nkcc1a (b) genes in gill tissues of L. maculatus during salinity adaptation

(a) 1. FW 0 h, 2. FW-SW 1 d, 3. FW-SW 3 d, 4. FW-SW 7 d, 5. SW 0 h, 6. SW-FW 1 d, 7. SW-FW 3 d, 8. SW-FW 7 d. (b) 1. FW 0 h, 2. FW-SW 1 d, 3. FW-SW 3 d, 4. FW-SW 7 d, 5. SW 0 h, 6. SW-FW 1 d, 7. SW-FW 3 d, 8. SW-FW 7 d; different letters represent significant difference, P <0.05.

与之相反，整个海水驯化过程中，nkcc1a的表达量呈逐渐上调趋势，由淡水转入海水后的1、3、7 d，nkcc1a的表达量分别上调为0 h的1.81倍、1.83倍及2.13倍(图6-b)。相反在整个淡水驯化过程中，nkcc1a的表达量呈逐渐下调趋势，由海水转入淡水后的1、3、7 d，nkcc1a的表达量分别下调至0 h的63.50%、46.70%、51.10%。

2.6 花鲈ncc2、nkcc1a在海、淡水鳃中的原位杂交定位

通过原位杂交技术对花鲈ncc2、nkcc1a在海水、淡水鳃组织中的定位模式进行探究, T7为反义探针，SP6为正义探针。结果显示，ncc2主要定位于淡水花鲈鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮(图版-1)，而在海水花鲈鳃组织中几乎检测不到阳性信号(图版-3)；nkcc1a主要定位于海水花鲈鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮(图版-7)，在淡水花鲈鳃组织中鳃小片底部上皮中仅检测到少量的表达(图版-5)。结果表明，ncc2、nkcc1a分别编码淡水、海水花鲈鳃中关键的Na+及Cl−离子协同转运蛋白亚型。

图版花鲈ncc2、nkcc1a在海、淡水鳃组织中的原位杂交定位结果

1、3. ncc2反义探针在淡水、海水鳃组织中的定位结果；5、7. nkcc1a反义探针在淡水、海水鳃组织中的定位结果，2、4、6、8. 阴性对照；黑色箭头所示为部分阳性信号。

图版. Situ hybridization localization results of ncc2 and nkcc1a genes in gills of L. maculatus in seawater and freshwater, respectively

1, 3. the in situ hybridization results of antisense probes of ncc2 gene in gill tissues of L. maculatus in freshwater and seawater, respectively; 5, 7. the in situ hybridization results of antisense probes of nkcc1a gene in gill tissues of L. maculatus in freshwater and seawater, respectively; 2, 4, 6 and 8. negative controls; the black arrow indicates some positive signals.

3. 讨论

本研究首先从花鲈中鉴定出ncc1和ncc2基因，通过系统进化分析确定其命名的准确性。多物种的氨基酸序列对比结果表明该基因具有较高的保守性。蛋白结构分析显示，预测的花鲈NCC蛋白呈现二聚体结构，结合非洲爪蟾(Xenopus laevis)中的研究结果，NCC蛋白可能通过形成同源二聚体的方式发挥作用[21-22]。同时，预测的花鲈NCC1、NCC2蛋白中存在硬骨鱼中高度保守的糖基化位点(图1，图3)，这些位点对ncc的表达及其功能的发挥至关重要[23]。氯化物的亲和力修饰残基位于TM1-7区域(图3)内[24]，表明该区域可能在NCC2蛋白发挥Cl−的摄取功能中起到重要作用。

除此之外，qRT-PCR的结果显示，在花鲈适应海淡水环境变化时，ncc1在鳃中的表达量没有显著变化，而ncc2在淡水鳃组织中的表达量显著高于海水(图5)。这与在欧洲鲈中的研究一致，相对于海水组，淡水组花鲈鳃组织中ncc1的表达不存在显著差异，ncc2则显著高于海水组[9]。这表明ncc1在花鲈鳃组织渗透调节功能中贡献较少，而ncc2作为主要的亚型起到离子运输的作用。同时，ncc2的表达量在淡水适应过程中逐渐上调，海水适应过程中则逐渐下调(图6-a)，这与在多种硬骨鱼类中的研究结果一致，如暗纹东方鲀、红鳍东方鲀[7]、欧洲鲈[9] 、莫桑比克罗非鱼[15]等，表明低渗环境持续激活ncc2的表达，从而诱导上皮细胞顶端产生NCC2以摄取Na+和Cl−，维持机体离子平衡。而nkcc1a基因表达量的变化趋势则恰恰相反(图6-b)，海水的高浓度离子环境促使花鲈鳃组织产生NKCC1a分泌Na+和Cl−，维持离子稳态，这种海水适应过程中在鳃组织中的表达上升的趋势在欧洲鳗鲡和莫桑比克罗非鱼中同样存在[10, 25]。此外，ncc和nkcc还常作为离子细胞的标志物存在，在不同的离子细胞类型中表达。淡水驯化的罗非鱼鳃中的离子细胞群顶端主要由顶端表达NHE3(Na+/H+交换体-3)和NCC的细胞组成，实现离子吸收的机能[26]。同样的，在淡水驯化的欧洲鲈中，鳃的离子细胞顶端表达的NCC2与基底外侧NKA(Na+/K+-ATPase)耦合以吸收Na+和Cl−[2, 12]。而海水驯化的莫桑比克罗非鱼主要由鳃的离子细胞基底外侧的NKCC1a进行离子分泌[26]，对底鳉和大西洋鲑鱼的研究也表明NKCC1存在于鳃中离子细胞的基底外侧表面[27-28]。本研究中原位杂交的结果也显示ncc2和nkcc1a分别主要定位于淡水和海水花鲈鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮(图版)。这些结果表明在花鲈适应低渗环境时，NCC2参与了Na+和Cl−的摄取，维持在淡水环境中的离子平衡，而NKCC1a参与Na+和Cl−的分泌，对花鲈适应高渗环境至关重要。综上所述， NCC2、NKCC1a可分别作为淡水和海水型离子细胞的标志物，在花鲈的鳃组织渗透调节过程中发挥着重要作用，但其具体作用机制还需要进一步探索研究。