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花鲈irak4基因cDNA的克隆与表达分析

花匠小妙招
2024-09-17 19:34

先天免疫系统作为普遍存在于各类机体中的重要防御机制，一直为人们所关注。其主要通过免疫细胞表面的模式识别受体识别病原生物表面的病原体相关分子模式来启动[1]。作为模式识别受体的重要成员，Toll样受体可识别多种病原生物，并能连接先天性免疫和特异性免疫系统[2-3]。白介素1受体相关激酶4 (interluekin-1 receptor associated kinase-4，IRAK4)是Toll样受体家族信号通路中的重要接头分子[4]，通过复合物MyD88/IRAK4/IRAK1/TRAF6将免疫信号传递给NF-κB，引起促炎细胞因子表达[5]。IRAK4所在家族各成员的蛋白结构类似[6-8]，均含有一个保守的N端死亡结构域(death domain，DD)和中央激酶区域(kinase domain，KD)。在哺乳动物中，DD结构域与MyD88相互作用，KD结构域则与其催化活性有关[9-10]。在哺乳动物TLR信号通路中，MyD88必须结合IRAK4的DD结构域才可使得IRAK4接受TLRs信号，磷酸化下游IRAK1。否则，IRAK1无法磷酸化，信号将被阻断。例如，在缺失IRAK4的巨噬细胞中，白介素因子诱导的NF-κB的活性明显被削弱，而IRAK1和IRAK2共同缺失则削弱不明显[11]。在小鼠(Mus musculus)中，激酶失活的IRAK4则明显抑制了NF-κB的激活，而IRAK4基因缺陷则严重阻断了IL-1/TLR信号通路，使炎症因子表达降低，不能有效抵抗病原生物的攻击[12]。因此在IL-1R/TLRs介导的最佳炎症信号通路中必须存在IRAK4[13]。IRAK4分子还可以与T细胞结合来诱发炎症，还能激活NADPH氧化酶诱导p38MAPK信号转导。这些发现表明，IRAK4不但在先天免疫的TLR信号通路中起重要作用，还参与了机体的特异性免疫以及细胞内其他信号通路的调节。

IRAK4的结构、功能及参与的信号传导途径等在哺乳动物中的研究较为透彻，但在鱼类中的研究还非常局限。目前，已经克隆得到了斑马鱼(Danio rerio)、大黄鱼(Larimichthys crocea)[14]、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)[15]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[16]等多种鱼类的irak4基因。并对irak4基因在不同病原生物刺激下鱼体中的表达量进行了表征，其中斑马鱼受迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后irak4表达量增加[17]；注射灭活鳗弧菌(Vibrio anguillarum)后，半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) irak4在脾脏和头肾中表达升高[18]；松江鲈(Trachidermus fasciatus)经脂多糖刺激后，irak4在皮肤、脾脏、血液、大脑及肝脏中表达量显著增加[19]；感染传染性脾肾坏死病毒的鳜(Siniperca chuatsi)脑细胞中的irak4表达降低[20]。因此，鱼类irak4在抵抗不同病原菌的过程中发挥着重要作用。

花鲈(Lateolabrax maculatus)经济效益高，养殖量日益增多，是中国南方地区重要的经济鱼类[21]。但随着养殖方式的改进、养殖密度的增加，病害问题频繁发生。基于IRAK4的免疫作用，对花鲈Irak4的研究可为其病害防治提供部分理论支持。因此，本研究通过克隆、荧光定量分析及瞬时转染真核细胞系等技术对参与免疫过程的重要因子IRAK4进行了研究。克隆鉴定了花鲈irak4基因cDNA序列并分析了其序列结构及组织分布，表征了感染细菌后花鲈irak4的表达模式，获得了外源性Irak4转染的HEK-293T细胞以及花鲈头肾原代培养细胞，并分析了外源性Irak4在真核细胞中的表达特征。本研究为阐明该基因在花鲈抵御病原感染过程中的作用提供理论依据，为进一步研究花鲈免疫机制提供重要参考。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

花鲈采自中国水产科学研究院南海水产研究所珠海斗门基地，鱼体体质量控制在(150±10) g，暂养所用海水盐度为15，水温为(26±2) ℃。3 d内，每日更换一次养殖池内1/3海水。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)与哈维弧菌(V.harveyi)由中国水产科学研究院南海水产研究所渔业生物病害防治研究室馈赠。无乳链球菌及哈维弧菌分别用脑心浸液培养基与2216E肉汤培养基在28 ℃下培养18 h，转速180 r·min–1，之后用磷酸盐缓冲液制备得到1×108 CFU·mL–1的菌悬液。扩增质粒所用载体为大肠杆菌(E.coli) DH5α，购自TaKaRa公司。人胚肾细胞293T (HEK-293T)购自广州锐博生物科技有限公司。花鲈头肾原代培养细胞由本实验室培养。

1.2 实验方法 1.2.1 总RNA提取和cDNA合成

选取3尾健康花鲈麻醉并迅速解剖，取头肾、脾脏等组织速冻于液氮中。按照Trizol (Invitrogen，美国)说明书对花鲈总RNA进行抽提，之后溶于经RNA酶处理的超纯水中，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用NanoDrop 2000/2000c分光光度计测定浓度及纯度，使用SMARTTM RACE cDNA合成试剂盒(Clontech，美国)逆转录合成cDNA，用于基因的扩增及验证。取1 μg总RNA，用PrimeScriptRT Regent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)合成cDNA，用于荧光定量表达量检测。

1.2.2 lmirak4全长的扩增

Lmirak4相应的EST序列由本实验室花鲈转录组测序结果筛选获得，采用降落PCR[22]，以花鲈3' RACE cDNA为模板，设计并合成特异性引物(IRAK4-rF: 5-GCTGCGAGTTCAGTTCCACCAAG-3和IRAK4-rR: 5-CTTGGAGTATCTGCACAGCAACCATC-3)，扩增目的基因3'末端。并利用引物IRAK4-head (5-ATGAATAATTCAGTAACTTCCGCCAC-3)及IRAK4-toe (5-TCACTGCATGTACCTTTTAACATCT-3)，进行常规PCR验证lmirak4基因cDNA开放阅读框(ORF)的正确性。

1.2.3 序列分析及多重序列比对

利用NCBI数据库Blast软件进行序列分析。用SMART软件预测Lmirak4蛋白结构域和功能域。利用ExPASY软件预测Lmirak4氨基酸序列的理论等电点及分子量。利用NetPhos 2.0 server查找磷酸化位点。用texshade软件对IRAK4在不同物种中的同源序列进行多重序列比对。

1.2.4 lmirak4组织表达分析

以得到的lmirak4 cDNA，设计实时定量PCR引物(IRAK4-qF:5-CTGGAAATATGTTATTGTG-3和IRAK4-qR: 5-GTAACTTGTGACTCTTTA-3)，经预实验检测，其扩增效率为95.5%。内参基因选用β-actin，其引物序列为β-actin-qF: 5-CAACTGGGATGACATGGAGAAG-3和β-actin-qR: 5-TTGGCTTTGGGGTTCAGG-3[23]。

对花鲈不同组织(头肾、肌肉、肠、鳃、脑、脾脏、心脏和肝脏)中lmirak4基因的表达量进行检测。反应总体系为12.5 μL，其中SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa) 6.25 μL、cDNA模板1 μL、上游引物qF和下游引物qR各0.5 μL、双蒸水补足至12.5 μL。反应条件为94 ℃预变性30 s；94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环；溶解温度从55 ℃升至97 ℃；40 ℃冷却5 min。使用Roche Light-Cycler 480Ⅱ实时定量PCR仪进行PCR，在Excel 2010中，用2–ΔΔCt法计算基因相对表达量。结果用SPSS 21.0软件分析，表示为“平均值±标准差(X¯±SD" role="presentation">X¯±SD)”，并进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析，P<0.05为差异显著。

1.2.5 花鲈细菌刺激实验

采用哈维弧菌和无乳链球菌进行免疫刺激，以检测lmirak4基因表达变化情况。本实验设置2个实验组和1个对照组，每组随机选取30尾健康花鲈，分别置于3个水泥池中饲养。稳定3 d后，腹腔注射[24] 200 μL (1×108 CFU·mL–1)哈维弧菌或200 μL (1×108 CFU·mL–1)无乳链球菌菌悬液作为实验组，腹腔注射等体积PBS作为对照组。注射后分别于第0、第6、第12、第24、第36、第48、第72和第96小时取样，3组重复。将鱼麻醉后取其头肾、肝脏和脾脏于液氮中保存。按照1.2.1方法提取3种组织的总RNA并合成cDNA，荧光定量的表达分析、反应体系、反应程序、内参基因及数据处理方法同1.2.4。

1.2.6 真核表达载体pEGFP-N3/Lmirak4构建及鉴定

本实验采用ABM公司的Ligation-Free Cloning System试剂盒构建pEGFP-N3/Lmirak4真核表达载体。根据pEGFP-N3载体序列和lmirak4的ORF末端序列，设计引物GFP-IRAK4-F (5-TCAGATCTCGAGCTCAAGCTT_" role="presentation">AAGCTT_ATGAATAATTCAGTAACTTCCGCC-3，划线部分为Hind Ⅲ酶切位点)及GFP-IRAK4-R (5-ATGGTGGCGACCG GTGGATCC_" role="presentation">GGATCC_CTGCATGTACCTTTTAACATCTCTG-3，划线部分为BamHⅠ酶切位点)。以lmirak4的ORF为模板，将得到的两端具有载体部分序列及酶切位点的cDNA片段构建到载体pEGFP-N3，并送上海生工公司测序保证其序列正确性，之后转化大肠杆菌DH5α (TaKaRa公司)扩增备用。

1.2.7 pEGFP-N3/Lmirak4转染HEK-293T细胞及花鲈头肾细胞

HEK-293T细胞培养在含10% FBS、1%青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，培养箱温度为37 ℃，二氧化碳(CO2)体积分数为5%。转染前按2×105个细胞每孔铺板于预先放置细胞爬片的无菌6孔细胞培养板中，待细胞长至60%~70%密度时进行转染。本实验选用Lipofectamine 3000 transfection试剂盒进行转染，以每孔2.5 μg pEGFP-N3/Lmirak4重组质粒、5 μL P3000TM、3.75 μL Lipofectamine 3000及250 μL DMEM培养液混匀制备成混合反应液。混合反应液静置15 min后加入DPBS清洗过的培养孔中，再添加含10% FBS的DMEM培养基进行细胞培养，第6小时后更换新鲜培养基。通过荧光显微镜在488 nm激发波长下，观察Lmirak4-EGFP融合蛋白的表达及其在细胞内的定位。

花鲈头肾细胞原代培养采用组织培养法，培养基为含15% FBS、1%青链霉素混合液的L15培养基，培养温度为28 ℃。转染前按8×104 CFU·mL–1的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，第24小时后进行转染。转染方法与检测方式同上。

2. 结果

2.1 lmirak4的cDNA序列特征

通过克隆得到的DNA序列ORF长942 bp，经进化树分析及氨基酸序列比对，将此基因命名为lmirak4。预测lmirak4基因编码313个氨基酸，理论分子量约34.97 kD，理论等电点为5.65。SMART分析表明，Lmirak4氨基酸序列含有1个N端死亡结构域(8~104 aa)和1个中央蛋白激酶结构域(S_TKc) (185~312 aa)，含18个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点、2个酪氨酸磷酸化位点(图1)。

图 1 lmirak4的核酸和氨基酸序列

起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)用方框标出；单下划线标注为N端死亡结构域序列；双下划线标注为中央蛋白激酶结构域序列

Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence of lmirak4

The initiation code (ATG) and the termination code (TGA) are boxed. The N-terminal death domain is underlined, and C-terminal protein kinases domain site is double underlined.

用TEXshade软件对不同物种的Lmirak4氨基酸序列进行多重序列比对(图2)，Lmirak4与其他物种Lmirak4序列高度保守。其中Lmirak4与条石鲷 Irak4相似度最高(84%)，与黄鳝(Monopterus albus)、条斑胡椒鲷(Plectorhinchus goldmanni)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)、红笛鲷(Lutjanus sanguineus)等鱼类的Irak4相似度达83%，与虹鳟(Oncorhynchus mykiss) Irak4相似度为67%。与其他动物的IRAK4同源性为：牦牛(Bos mutus) 52%，德国牧羊犬(Canis lupus familiaris) 52%，小鼠(Mus musculus) 51%，人(Homo sapiens) 51%。

2.2 lmirak4的组织表达分析

利用实时定量(qPCR)技术对lmirak4在花鲈8种组织中的mRNA含量进行检测，结果表明lmirak4在被检测组织中均出现表达，花鲈头肾组织中表达量最高，鳃和肝脏中表达量较高，肌肉组织的表达量最低(图3)。

图 3 Lmirak4在各组织表达情况

图中纵坐标值为平均值，误差棒为标准差，不同的字母表示各组之间具有显著差异(P<0.05)

Figure 3. Expression of lmirak4 in different tissues

Relative expression of lmirak4 was calculated with the 2–ΔΔCt method. Each bar represents the X¯±SD" role="presentation">X¯±SD (n=3). Different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.3 lmirak4在细菌刺激下的表达分析

为研究lmirak4在细菌刺激时的表达变化，本实验选取了脾脏、头肾和肝脏这3个免疫组织。经哈维弧菌和无乳链球菌注射刺激后，lmirak4在3个免疫组织中均出现了明显的表达升高，但各组织中lmirak4表达模式存在一定差异(图4)。

图 4 注射细菌后lmirak4表达水平的变化

a、b、c分别代表脾脏、头肾和肝脏中lmirak4经哈维弧菌和无乳链球菌刺激后的相应时间点的表达水平；经2–ΔΔCt法分析后，平均值±标准偏差(n=3)表示于纵坐标，不同的字母表示相应对比组之间具有显著差异(P<0.05)

Figure 4. Relative expression level of lmirak4 post-bacteria infection

a, b and c represent the expression level of lmirak4 in spleen, head-kidney and liver after bacteria infection. With the analysis of 2–ΔΔCt method, X¯±SD" role="presentation">X¯±SD (n=3) was shown on the Y bar. Different letters indicate significant difference (P<0.05).

经哈维弧菌刺激后，脾脏中lmirak4在第6小时开始出现表达升高，第12小时处达到最高值(为PBS组的9倍)，随后表现为下降趋势，但在48 h内仍显著高于PBS对照组的表达量(图4-a)。头肾中lmirak4表达量一直显著高于PBS组，其在第6小时表达明显升高，第24小时达到峰值(约为PBS组的7倍)，随后表达量开始下降并维持在一定水平(图4-b)。肝脏中lmirak4在实验周期内同样保持着较高的表达水平，在第6小时表达量最高，随后趋于稳定。

无乳链球菌刺激后，脾脏中lmirak4于第24小时才开始表达升高，在第36小时达到最高值(为PBS组的4.2倍)，之后其表达量与对照组相同，没有出现明显的诱导效应(图4-a)。头肾中lmirak4在第6小时就开始诱导表达并达到最大值，随后表达量逐渐下降，直至趋于PBS组水平(图4-b)。肝脏中lmirak4在第12小时出现表达升高，随后其表达波动较大，但整体表达量处于较高水平(图4-c)。

2.4 pEGFP-N3/Lmirak4重组质粒在细胞中的表达

通过共聚焦显微镜检测观察，在转染pEGFP-N3/Lmirak4重组质粒后的HEK-293T细胞与花鲈头肾细胞中均可观察到绿色荧光信号，说明GFP标记的Lmirak4融合蛋白在HEK-293T细胞与花鲈头肾细胞中均成功表达(图5)。

图 5 细胞转染荧光信号图

pEGFP-N3组为转染空载体pEGFP-N3质粒的对照组，GFP/IRAK4组为转染pEGFP-N3/Lmirak4重组载体的实验组；蓝色代表细胞核位置，红色为细胞膜位置，绿色为GFP蛋白标签或者融合GFP标签的IRAK4蛋白的位置

Figure 5. Cell transfection fluorescent signals

Empty plasmid pEGFP-N3 was used as the control, named as Pegfp-N3 group. Recombinant plasmid Pegfp-N3/Lmirak4 was used as the treatment group. Red, green and blue show localization of Rab7-Red, the GFP tag or GFP-tagged Lmirak4 and nucleus, respectively.

在HEK-293T细胞中(图5-a)，携带pEGFP-N3质粒的细胞表现出较强的绿色荧光信号，且分布均匀。细胞核、细胞膜与蛋白信号视图叠加后显示，pEGFP-N3蛋白广泛分布于细胞中。携带pEGFP-N3/Lmirak4重组质粒的细胞绿色蛋白荧光强度较弱，视图重叠后发现绿色荧光与DsRed标记的细胞质位置一致，且多分布于DAPI染色的细胞核周边。这表明外源性pEGFP-N3/Lmirak4蛋白在HEK-293T细胞中表达量较低，且主要存在于细胞质中。在花鲈头肾细胞中(图5-b)，携带2种质粒的细胞其绿色荧光信号强度基本相同。但是与携带pEGFP-N3质粒对照组相比，携带pEGFP-N3/Lmirak4质粒的细胞能够成功表达外源蛋白的细胞数较少。

3. 讨论

随着养殖密度增加，花鲈病害频繁发生，通过对参与机体免疫调控通路TLR/IL-1中关键分子IRAK4的研究，可为研究花鲈抗病害机制提供部分数据。本研究克隆了lmirak4序列，通过BLAST比对，目标序列与已发表的各物种irak4属同源基因，且其含有保守的N端死亡结构域和中央蛋白激酶结构域，因此将其归为IRAK4家族，命名为lmirak4基因。N端死亡结构域可用于结合上游MyD88分子，中央蛋白激酶结构域有多处丝氨酸与苏氨酸磷酸化位点，可磷酸化激活下游分子。多重序列比对结果显示，Irak4在鱼类中高度保守。Lmirak4与其他鱼类一致性高达83%，与哺乳类动物相比，一致性高达51%，说明IRAK4在生物体进化过程中具有保守性，Lmirak4可能与其他鱼类和哺乳类的IRAK4基因功能类似。

qPCR结果表明，lmirak4在花鲈各组织中均有表达，在头肾组织中表达量最高，在肝脏和鳃中表达量次之，在肌肉组织中表达量最低，说明lmirak4存在组织表达差异性(P<0.05)。在哺乳类动物的肝脏和肾脏中，IRAK4出现最高表达量[25]；在鱼类肝脏、脾脏、头肾中，irak4出现最高表达量[15,26-29]。头肾和脾脏是鱼类的主要淋巴器官，而鱼类肝脏也具有大量的巨噬细胞[30]，其irak4表达量普遍较高也说明了鱼类Irak4是参与免疫过程的重要因子。因此本实验选取了肝脏、脾脏和头肾作为菌刺激实验的材料。

哈维弧菌是海水养殖鱼类主要的病原菌[31]，无乳链球菌是一种广泛分布于自然界的条件致病菌[32]。经这2种菌刺激后，lmirak4在花鲈头肾、脾脏和肝脏3个免疫组织中均出现显著的表达升高。在注射后第6小时迅速接收到信号后，lmirak4 mRNA含量出现波动变化，但整体水平高于对照组。在其他硬骨鱼类中也发现了类似的结果，如引言中所述的斑马鱼、半滑舌鳎和松江鲈[17-19]。因此本实验说明lmirak4同其他鱼类的irak4基因功能类似，也参与了机体的抗菌过程。但不同组织中表达峰值的时间点有所不同，可能是因为各免疫组织的应激时间不同。此外，3个检测组织中哈维弧菌对lmirak4表达的诱导效果要显著高于无乳链球菌。这与花鲈频繁遭受哈维弧菌侵害现象相符，说明哈维弧菌对花鲈刺激更为强烈。哈维弧菌属于革兰氏阴性菌，lmirak4表达升高程度的不同，可能是由于TLR通路对不同性质革兰氏菌的识别能力不同所致。在鱼类TLR通路免疫研究中，阴性菌导致的TLR通路因子表达升高的研究结果较多，而阳性菌刺激鱼体的研究较少。如麦瑞加拉鲮(Cirrhinus mrigala)被嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后，tlr5表达显著升高[33]；哈维弧菌感染花鲈后，tlr5表达水平升高的效果在大部分时间点要显著高于无乳链球菌感染[34]；注射副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)后，大黄鱼血细胞和肝中的tlr3表达出现明显升高[35]。本研究结果表明，lmirak4参与了花鲈机体的抗菌过程，且哈维弧菌和无乳链球菌对其诱导效果不同。

信号通路中关键因子的亚细胞定位对理解其蛋白功能至关重要，因此本实验采用瞬时转染方式将lmirak4转染至HEK-293T细胞和花鲈头肾细胞中。所用的pEGFP-N3真核表达载体可保证目的基因与自身编码的绿色荧光蛋白GFP同时表达[36]。细胞转染结果表明，外源性Lmirak4在2种细胞中均成功表达。在HEK-293T细胞中，外源性Lmirak4转染表达成功率与对照组无明显差异，但是在单个细胞中其表达量较少，且观察到的绿色荧光多分布在细胞质中，与已知哺乳动物IRAK4行使功能的位置相符，表明Lmirak4蛋白降低了载体表达量，影响了重组蛋白的存在位置。在鱼类细胞中，外源性Lmirak4也成功表达，但能够表达的细胞数量较少，且并未观察到明显的定向分布。说明外源性Lmirak4能够在花鲈头肾细胞中表达，但pEGFP-N3可能不是其最佳表达蛋白载体，还需要进一步探讨。此结果可以为进一步研究Irak4在花鲈细胞中的功能提供参考。

综上，本研究克隆了lmirak4 cDNA全长，通过分析其氨基酸序列特征及其在不同细菌刺激下的表达模式，验证了lmirak4参与花鲈抵抗细菌侵染的过程，这为深入探讨花鲈免疫机制提供了基础。通过瞬时转染技术发现外源性Lmirak4主要存在于细胞质中，所得的外源性Lmirak4转染的花鲈头肾原代培养细胞和HEK-293T细胞可为进一步研究lmirak4基因结构功能、表达规律及其上下游因子提供材料。