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南林895杨抗虫转基因研究

花匠小妙招
2024-11-08 00:55

【摘要】： 本研究以南林895 杨叶片为材料,在建立高效组培再生体系的基础上,采用根癌农杆菌介导法,开展了抗虫基因苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的遗传转化研究,取得的主要进展如下: 1.高频组培再生体系的建立:通过对基本培养基的筛选,激素种类和浓度的调整,培养条件的选择等,获得了高效分化再生培养基为MS+6-BA0.5mg/L + TDZ0.002mg/ L,分化率为100%,每个叶盘产生大量的丛生芽,为遗传转化工作提供了坚实的基础; 2.遗传转化中选择压的确定:所用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因,　在遗传转化中采用卡那霉素作为筛选转化植株的选择剂。经过对比试验,结果表明采用Kan 20mg/L 作为筛选时的选择压。 3.　遗传转化体系的优化:研究了影响根癌农杆菌转化的各个因素,得出最优转化条件是:预培养3d,菌液浓度OD600 1.0～1.3 左右,侵染时间20　min,共培培养基中加AS　120～200　mg/L,pH 调为5.8,不去除CoCl2·6H2O,共培养温度设为28℃,共培养4d。在此优化的转化体系下,美洲黑杨的转化率由4.5%增加到28.7%,提高了6 倍; 4.转抗虫基因植株的获得和分子检测:在经卡那霉素严格筛选获得的22 株转Bt 基因和5 株转CpTI 基因的再生植株进行PCR 检测,结果转Bt 基因的Kanr 再生植株DNA样品中有18 株呈阳性,转CpTI 基因的Kanr 再生植株DNA样品中有1 株呈阳性,试验结果初步证明目的基因已被导入到美洲黑杨杂种基因组中; 5.转基因杨树的移栽:选取培养一个月的试管苗,移栽前炼苗3～4d,移栽的8 株转Bt 基因、1 株转CpTI 基因和1 株对照植株全部成活,移栽成活率100%。　

【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005

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