DNA条形码技术在我国常见蓟马种类识别及西花蓟马传播扩散趋势分析中的应用
导 师: 张桂芬
学 校: 中国农业科学院
专 业: 生物安全
关键词: 缨翅目 西花蓟马 DNA条形码 分子鉴定 系统发育树 传播扩散趋势 条形码识别系统
分类号: S433
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
缨翅目(Thysanoptera)昆虫统称为蓟马(thrips)，其中有1%的蓟马种类可以对农作物造成严重危害。近几年来，随着国际贸易往来的增多，生物入侵事件频频发生，棕榈蓟马Thrips palmi(Karny)、西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)等已广泛传入各地，成为当地主要害虫，对农林业生产造成了巨大影响。本实验围绕蓟马种类多、个体微小、行踪隐蔽，极易随果蔬、花卉、苗木等贸易活动传播扩散，对农林业生产造成严重威胁，却难以准确快速鉴定的问题，采用DNA条形码技术，以田间常见的蓟马种类线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I (mitochondrialcytochrome c oxidase subunit I gene, mtDNA COI)基因(约650bp)为靶标，研究该技术在蓟马分子鉴定识别中的应用，建立蓟马DNA条形码识别系统，并研究我国西花蓟马传播扩散趋势，研究结果对蓟马的快速准确识别，阻止其他蓟马种类的入侵以及西花蓟马进一步传播扩散，维护国家贸易信誉、保障农林业生产安全具有重要意义。具体研究结果如下：(1)蓟马类害虫的快速分子鉴定技术研究。利用DNA条形码通用型引物，以我国田间常见的27种蓟马为靶标，扩增其mtDNA COI基因，对COI基因序列进行测序及比对分析，以邻接法(NJ法)构建系统发育树，并以Kimura双参数模型计算种内、种间遗传距离。结果表明：聚类分析与形态学鉴定结果一致，表现为较长的种间分支和较短的种内分支，每个单系分支对应一个物种，同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。27种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027，种间平均遗传距离为0.2726，种间遗传距离为种内遗传距离的101.0倍；而且，种内、种间遗传距离没有重叠区域。说明，基于COI基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。(2)蓟马类昆虫DNA条形码识别系统的建立。该系统包括标本库、知识库和条形码序列库。标本库主要包括实物标本信息和DNA样本，实物标本信息包括实物标本编码、寄主、采集人、采集地点和该采集地的经纬度和海拔高度，DNA样本于-80oC保存。标本库中现已收录13属29常见蓟马种类的标本信息，DNA样本共3科13属23种360份。知识库主要包括物种中文名称、拉丁学名、国内外分布、形态特征、寄主植物、主要危害、生物学特性、防治措施等。知识库中现已录入13属29种蓟马种类的相关信息。条形码序列库共收录了133种蓟马共1671条COI序列，这些序列一方面来源于本实验室研究所获(3科13属29种387条序列)，另一方面来源于BOLD (3科22属80种541条)和NCBI (3科22属73种743条)中下载的公开序列。条形码识别系统具有COI条形码序列的识别、序列查询、序列提交和我的序列等功能。该系统可鉴定蓟马种类133种，其中7种为本数据库独享种类，对实现入侵害虫的远程识别及有效监控具有重要意义。(3)我国西花蓟马种群传播扩散趋势的研究。采用DNA条形码技术，对采自我国13个省市不同地理种群西花蓟马的175条COI基因序列进行遗传多样性和遗传分化程度分析，共定义了13个单倍型，进一步的分析结果显示，各地理种群西花蓟马的单倍型多样性较高(Hd=0.691)，而核苷酸多样性较低(π=0.00652)。整体的固定指数Fst为0.24359，基因流Nm为0.78，种群间的固定指数和基因流分析表明我国各地理种群间已出现了一定分化。种群间的AMOVA分析显示，我国西花蓟马的遗传变异主要来自于种群内部。通过国内外不同地理种群COI序列的单倍型聚类分析，表明我国西花蓟马已存在两个品系，即温室品系和羽扇豆品系，我国的羽扇豆品系主要来源于新西兰和荷兰，而广泛存在的温室品系则存在多个入侵来源。我国最早于2000年在云南昆明截获此虫，于2003年首次在北京的辣椒大棚中发生其危害，推测我国西花蓟马各地理种群的来源，一方面有可能是在国际贸易往来过程中，由国外传入我国，另一方面有可能是在我国国内的调运过程中，由北京、云南扩散到其它地区。研究结果对有效防止西花蓟马的进一步传播扩散，及其种群扩张趋势监测和机制探讨等均具有重要指导意义。本实验中，蓟马类害虫的分子鉴定识别技术的研究和蓟马DNA条形码识别系统的建立，为口岸以及蔬菜花卉及其种苗调运中蓟马类害虫的准确快速检疫检验提供了技术支持，为实现蓟马类害虫及其他入侵害虫的远程识别及监控提供了技术平台。通过我国西花蓟马不同地理种群传播扩散趋势的研究，明确了西花蓟马的入侵来源和扩散趋势，对有效防止西花蓟马的进一步传播扩散，及其种群扩张趋势监测和机制探讨等均具有重要指导意义。
全文目录
摘要 6-8
Abstract 8-13
第一章 绪论 13-25
1.1 蓟马概述 13-16
1.1.1 蓟马的危害 13
1.1.2 蓟马的综合防治 13-16
1.2 蓟马鉴定检测技术 16-19
1.2.1 蓟马的形态学鉴定及其局限性 16-17
1.2.2 蓟马的分子检测鉴定技术 17-19
1.3 DNA条形码概述 19-22
1.3.1 DNA条形码的产生和原理 19
1.3.2 DNA条形码基因的选择 19-20
1.3.3 DNA条形码的工作流程 20
1.3.4 DNA条形码技术在昆虫物种鉴定中的应用 20-21
1.3.5 DNA条形码技术在其他方面的应用 21-22
1.4 分子系统地理学研究内容和研究方法 22-23
1.4.1 分子系统地理学研究内容 22
1.4.2 分子系统地理学在昆虫系统进化中的应用 22-23
1.4.3 蓟马种群遗传结构的研究进展 23
1.5 研究内容及技术路线 23-25
1.5.1 研究内容 23-24
1.5.2 技术路线 24-25
第二章 DNA条形码技术在常见蓟马种类鉴定识别中的应用 25-39
2.1 材料与方法 25-31
2.1.1 实验材料 25-30
2.1.2 实验方法 30-31
2.2 结果分析 31-37
2.2.1 PCR扩增、序列测定及同源性分析 31
2.2.2 种内与种间遗传距离 31
2.2.3 系统发育树构建 31-37
2.3 小结与讨论 37-39
第三章 蓟马类昆虫DNA条形码识别系统的建立 39-55
3.1 材料与方法 39-46
3.1.1 实验材料 39-45
3.1.2 实验方法 45-46
3.2 结果与分析 46-54
3.2.1 蓟马DNA条形码识别系统的建立 46-47
3.2.2 蓟马条形码识别系统的功能 47-54
3.3 结论与讨论 54-55
第四章 基于线粒体COI基因的西花蓟马种群传播扩散趋势研究 55-77
4.1 材料与方法 56-57
4.1.1 实验材料 56-57
4.2 实验方法 57-59
4.2.1 总DNA提取 57
4.2.2 PCR扩增、电泳检测以及序列测定 57-58
4.2.3 序列分析 58-59
4.3 结果与分析 59-74
4.3.1 PCR扩增、序列测定及同源性分析 59-60
4.3.2 西花蓟马COI基因序列变异分析 60-61
4.3.3 单倍型分布及遗传多样性分析 61-63
4.3.4 遗传分化及基因流分析 63-66
4.3.5 AMOVA分子变异分析 66
4.3.6 各地理种群的系统进化分析 66-74
4.4 小结与讨论 74-77
第五章 结论与展望 77-79
5.1 结论 77
5.2 创新点 77-78
5.3 展望 78-79
参考文献 79-95
致谢 95-96
作者简历 96
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