花生纹枯病病原学及其致病机制研究
花生纹枯病病原学及其致病机制研究
【摘要】： 花生是我国重要的油料作物和经济作物,种植面积广,我国绝大部分省份都有分布。辽宁是我国花生主产区之一,随着农业种植产业结构调整,花生产业已经成为农民增收致富的重要途径。近年来由于大面积种植和集约化生产给花生病虫害的发生提供了有利条件,导致病虫危害呈上升趋势。花生纹枯病是近年来辽宁新发现的一种真菌叶部病害,造成花生整株枯死,给花生产业带来严重损失。该病害国内外尚无系统研究报道,本论文对花生纹枯病菌鉴定及其病原学进行了系统研究,明确了病原菌种类及其侵染过程,探讨了病菌的主要致病机制,获得了病菌PG基因cDNA全长序列,并进行了该基因的生物信息学分析,主要研究结果如下。1.首次系统研究了新病害花生纹枯病病原种类及其生物学。本实验室2013年7月首次在辽宁省辽阳市下王家镇发现花生新病害花生纹枯病。该病主要危害花生叶片,引致叶片腐烂甚至全株枯死,发病部位形成大量黑灰色菌核。田间调查发现,病害多发生在7月中旬至8月下旬,高温高湿有利于病害发生。该病害在辽宁和山东花生种植区均有发生,严重时病株率高达100%。通过病原菌分离纯化、形态学和分子生物学鉴定以及柯赫氏法则证病,明确了花生纹枯病病原菌为茄丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)。病原菌致病性测定表明,花生纹枯病菌、玉米纹枯病菌和水稻纹枯病菌分别对三种寄主具有交叉致病性,但致病力有差异。病原菌生长的最适温度25~30℃,最适pH范围7~8,最适培养基为查氏和燕麦培养基,最适碳源为淀粉,最适氮源为蛋白胨,光照有利于病原菌菌丝生长。菌核产生的最适温度25~30℃,最适pH7,最适培养基为玉米粉培养基和PDA,最适碳源为葡萄糖和淀粉,最适氮源为亚硝酸钠,光照对菌核的形成无显著影响。2.首次观察了花生纹枯病菌的侵染过程。通过显微观察、细胞化学染色以及超显微技术明确了花生纹枯病菌的侵染特点。研究发现,花生纹枯病菌侵染寄主叶片能够形成附着胞、侵染垫等侵染结构。病菌主要从侵染垫下方侵入,也可见菌丝从气孔侵入,侵染速度快,接种48 h即可见病斑。花生纹枯病菌侵染寄主叶片组织的主要过程包括:菌丝从接种体(菌饼)上长出伸向叶片表面(6 h);菌丝接触到叶片后,在叶片表面扩展蔓延,产生大量附着胞(12 h);Ⅲ.产生大量白色至浅黄褐色侵染垫(24 h),侵染垫下方出现浅黄色粘液物质,并且下部叶表面出现少量细胞膜系统损伤或死亡;侵染垫颜色加深变为浅褐色,下部菌丝出现融合、皱缩,且下方的叶片组织细胞大量死亡,菌丝侵入叶片内部,在细胞内和细胞间生长扩展,细胞开始发生变形,质壁分离,叶绿体解体,淀粉粒消失,脂肪滴增多,线粒体消失等一系列变化(36 h);侵染垫皱缩加重,颜色加深,下部的组织出现明显病斑,组织开始腐烂浸解,病斑部位细胞大量死亡(48 h);侵染垫颜色不断加深,并发生严重皱缩,侵染垫下病斑扩展合并,病斑扩大,病斑部位细胞大量死亡[60h或(和)60 h之后)]。3.首次探讨了花生纹枯病菌的致病机制。花生纹枯病菌在罹病组织和离体培养下均可产生一系列细胞壁降解酶。病原菌在白沙和四粒红的茎秆和叶片上均可产生PG、PMG、Cx和β-葡萄糖甘酶,其中果胶酶PG和PMG较Cx和β-葡萄糖甘酶活性较高。健康植株上未检测到或只检测到微量的酶活。离体培养条件下,在果胶和果胶+CMC为碳源的培养基中,检测到较高的PG、PMG活性。在CMC和果胶+CMC为底物的培养基中,Cx活性高。初步明确底物是诱导这三种酶的主导因素。β-葡萄糖甘酶在不同碳源的培养基上活性均很低,难以诱导。病原菌引起了寄主组织和培养基碱化,罹病的组织和培养基中pH均出现上升。三种培养基中菌丝的生长与pH显著正相关。PG,PMG和Cx在果胶+CMC为碳源的培养基中的活性分别与pH和菌丝生长呈极显著正相关。果胶培养基中的PG、PMG和β-葡萄糖甘酶活性,CMC培养基中的PG、PMG和Cx的活性分别与pH和菌丝生长呈正相关。初步明确除底物的诱导作用外,培养基中菌丝生长和(或)pH是这几种酶产生的重要的影响因子。花生纹枯病菌粗酶液能够引起寄主叶片病斑产生,明确了细胞壁降解酶是重要的致病因子。通过IEF发现,该病菌在与寄主互作和离体培养中均只产生同一种PG同工酶,等电点约为9.2。4.明确了花生纹枯病菌PG基因序列及在侵染中的转录表达水平。采用RACE技术获得了该病菌PG基因的cDNA全长序列和CDS序列,序列长度分别为1255 bp和1095bp,包含一个由364个氨基酸组成的开放阅读框。预测PG分子量37511.96,理论等电点8.93;正电荷残基数28,负电荷残基数18;分子式为C_(1634)H_(2590)N_(460)O_(530)S_(11),不稳定系数20.93,脂溶系数74.51,平均亲水系数-0.132。信号肽分析结果表明,PG具有一个信号肽位点,剪切位点位于第29-30氨基酸。亚细胞定位预测为胞外。糖基化位点预测结果表明O-端有1个糖基化位点,N-端无糖基化位点。磷酸化位点预测表明,Ser磷酸化位点25个,Thr磷酸化位点21个,Tyr磷酸化位点4个。花生纹枯病菌接种寄主叶片,PG基因在接种12 h出现表达量上调,60 h表达量最高,之后表达量降低。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
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