兰花转CiDREB1、PeDREB2、CyMV
【摘要】：兰科(Orchidaceae)是有花植物中最大的一个科,具极高的观赏价值。在全世界花卉业中,兰花具有重要的经济价值。兰花是整个兰科植物的总称,主要分布于热带、亚热带,性喜温暖潮湿,耐寒性、抗旱性能力较差。近年来兰花广泛受到建兰花叶病毒(Cymbidium Mosaic Virus ,CyMV)等病毒的侵染,导致观赏价值下降。目前国际上还未有防治植物病毒病的有效药剂,而随着世界上兰花贸易的不断扩大,兰花病毒病也开始在不同植株中蔓延,严重影响多种兰花的栽培和生产。因此,培育耐寒、抗旱、抗病毒的兰花新品种已成为兰花新品种培育的主要方向。本研究以8个种类具有重要价值的兰花(大花蕙兰、中国兰属附生种类等)为材料,应用农杆菌和基因枪两种转化方法进行了转基因研究,将美花兰抗寒基因CiDREB1和毛竹抗旱基因PeDREB2分别转化大花蕙兰、中国兰花等种类兰花;采用实时荧光定量PCR方法对转CyMV-CP基因兰花进行表达量的检测。本研究旨在利用基因工程手段进行兰花抗逆性品质改良,为最终培育耐寒、抗旱、抗病毒兰花新品种奠定理论和实践基础。1.研究确定了2类兰花的最佳抗生素筛选浓度。表达载体中有新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ)作为筛选标记基因,利用卡那霉素对转化体进行筛选。美花兰( Cymbidium insigne ) MH的卡那霉素最佳筛选浓度为50 mg/L ;树兰(Epidendrum)SL的卡那霉素最佳筛选浓度为15 mg/L。2.采用农杆菌侵染和基因枪介导的方法,以美花兰抗寒基因CiDREB1基因和毛竹抗旱基因PeDREB2基因为外源目的基因,对美花兰MH,大花蕙兰(Cymbidium)PB、PC,兰属(Cymbidium)兰花F5、F7、C2,树兰SL,卡特兰(Cattleya)K1 8种兰花进行遗传转化,初步得到了抗生素水平的阳性苗,并对转化率分别进行了统计。结果表明,农杆菌侵染法出苗率处于3.13-15.6%之间;基因枪介导的转化出苗率处于1.7-92.2%之间。3.基因克隆获得了兰花PB、PC肌动蛋白Actin基因部分序列,设计合成了适合于实时荧光定量PCR试验进行基因相对表达量分析的特异性引物(Actin-S/A, CyMV-S/A)。溶解曲线和标准曲线分析结果表明,Actin-S/A引物扩增Actin基因标准曲线相关系数为r2 = 0.994,线性方程为y =-3.271X+19.008,扩增效率E=102.2%;CyMV-S/A引物扩增CyMV-CP基因标准曲线相关系数为r2 = 0.997,线性方程为y =-3.731X+11.993,扩增效率E=85.4%。表明所设计的CyMV-CP基因引物能够用于目的基因相对表达量的检测。4.利用实时荧光定量PCR方法,以两个种类转CyMV-CP基因大花蕙兰PB、PC PCR检测阳性植株为材料,对CyMV-CP基因在转基因兰花植株体内的表达量进行分析。结果表明,外源基因CyMV-CP在转基因大花蕙兰PB、PC植株体内得到较高水平的表达,表达量明显高于未转基因兰花植株,相对表达量分别是对照植株的14.8倍、100倍。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
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