RNAi介导的高抗芜菁花叶病毒研究及全基因组测序分析和病毒检测
【摘要】： 芜菁花叶病毒(Turnip,mosaicvirus,TuMV)是危害十字花科作物最严重和分布最广泛的一种病毒。常规育种存在转育时间较长、某些抗性基因为隐性基因不易利用等特点。另外,TuMV容易产生变异。因此,寻找有效、稳定的抗病毒基因,一直是遗传育种学研究的重要目标。本研究根据GenBank上已发表的126条TuMV全基因组序列比对结果,挑选CI、VPg和HC-Pro基因十分保守的一小段核酸序列,而非整个基因,构建了 3个双链发卡结构RNAi载体。北京地区TuMV有C1～C5 5个株系,其中以强致病型C4为主。本项研究以北京地区TuMV的代表C4株系为抗病鉴定接种毒株,鉴定了 3个RNAi载体对TuMV-C4病毒株系的抗性。3个载体的转基因植株都比对照抗性提高约80%以上,达到高抗病毒效应。以上研究为转化对TuMV病毒敏感的大白菜品种,获得新种质打下了基础。截至2011年,在GeneBank上现已登记的TuMV全长核酸序列有126个,我国在核酸序列分子水平对TuMV的研究主要集中在病毒基因组的某个基因上,如CP、HC-Pro和NIa等,全基因组序列研究报道相对较少。全基因组序列的测定是研究TuMV进化、重组与传播的基础。本研究扩增了采自萝卜和甘蓝分离物的BJ-R01和BJ-B01、BJ-B02、BJ-B03毒株的全基因组序列,4个TuMV分离物均为9833个碱基,通过与GeneBank上的其它TuMV全长核酸序比较,分析其起源与进化。根据系统进化树分析,4个TuMV分离物均属于world-B组。经对宿主的致病性鉴定,4个TuMV分离物均为BR致病型。4个TuMV分离物对Brassica属植物均表现出强致病性,但对Raphanus属植物致病性显现出明显的差异。利用反转录酶M-MLV和普通Taq酶,使用一步法多重RT-PCR技术,建立了一种快速、简便、特异性强的检测TuMV的方法。该方法简便,不需先对总RNA提纯步骤,只需室温下在提取液中对病样叶片直接碾磨,用粗提液或浓缩后的DNA-RNA混合物为模板进行检测。两套针对TuMV的特异性引物确保了检测的准确性。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
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