玫瑰杆菌科细菌Dinoroseobacter shibae DFL 12抑制溶藻弧菌Vibrio alginolyticus ATCC33787群体感应行为的研究
【摘要】： 藻际环境是海洋环境中重要的生境,浮游植物与藻际细菌在这一微生境中发生着紧密而复杂的相互作用关系。化学分子是藻际环境中交流的介质,藻际环境中的细菌如何利用信号素调节宿主和对其它细菌群落产生影响,进而获得自身生存的竞争优势是目前藻际环境研究中的一个热点方向。吲哚-3-乙酸和群感淬灭(quorum quenching,QQ)酶是两类能够影响异养细菌形成生物膜的物质,在细菌竞争生态位中起着重要的作用。本研究以藻际优势菌—玫瑰杆菌科细菌为研究对象,首先通过对实验室前期分离得到的藻际细菌进行了基因组的分析,探究玫瑰杆菌合成吲哚-3-乙酸的潜能和群感淬灭的潜能;进一步利用化学方法评估玫瑰杆菌合成吲哚-3-乙酸的能力,并通过生物学实验研究吲哚-3-乙酸对非藻际来源的海洋弧菌群体感应表型的影响;最后通过生物指示的方法和分子克隆实验探究玫瑰杆菌体内群感淬灭内酯酶的功能。获得的主要结果如下:1)通过蛋白质数据库对已有基因组的藻际来源玫瑰杆菌进行注释,发现Dinoroseobacter shibae DFL 12等藻际细菌的基因组中都含有部分甚至是完整的吲哚-3-乙酸色胺(TAM)合成路径中的基因,如编码L-芳香氨基酸脱羧酶,单胺氧化酶和乙醛脱氢酶的基因;通过下载Pfam中群感淬灭内酯酶的同源序列进行建模和比对分析,发现菌株D.shibae DFL 12及其同属的分离株Dinoroseobacter sp.PD6基因组中的蛋白质序列含有与金属-β-内酰胺酶蛋白超级家族中内酯酶Aii A高度保守的结构域“～HXHXDH～”。对数据库中已有的群感淬灭内酯酶序列进行挖掘,发现AHLs内酯酶序列存在于不同种属的玫瑰杆菌科细菌基因组中;2)将24株藻际来源的、不同属的玫瑰杆菌接种于2216E海水培养基中发酵三天后,以通过HPLC-MS检测发酵液中吲哚-3-乙酸的信号,结果发现其中12株玫瑰杆菌(包括D.shibae DFL 12在内)的发酵液能够在不添加额外的高浓度色氨酸情况下检测到吲哚-3-乙酸的信号。通过吲哚-3-乙酸对弧菌群体感应表型影响实验,发现在0-0.5 m M浓度范围内,吲哚-3-乙酸能够在不影响弧菌正常生长的情况下减缓弧菌的群体游动性和生物膜的形成。进一步通过RT-q PCR分析,发现吲哚-3-乙酸能够下调弧菌鞭毛合成基因的表达,上调控制弧菌生物膜形成的群感效应AI-2合成基因的表达。3)最后,利用生物指示菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)A136对D.shibae DFL 12的群感淬灭能力进行验证,发现D.shibae DFL12对10个碳链以下长度和含有氧代支链结构的AHLs没有水解能力,只能水解10个碳链及以上碳链长度的AHLs。随后通过异源表达的方式对D.shibae DFL 12体内预测的内酯酶(命名为Lac-DFL 12)的进一步的验证。有趣的是,我们发现含有重组质粒p GEX-6p-1-Lac DFL 12的E.coli rosetta-gami(DE3)对中长链(C4-C14)的AHLs分子都具备水解能力。综上,本论文基于生物信息学,分子生物学和化学检测的证据,初步证明了玫瑰杆菌D.shibae DFL 12的内酯酶具备群感淬灭的能力,且能合成小分子的群感淬灭物质;并通过大数据的分析发现内酯酶普遍存在于玫瑰杆菌科中。本论文能给藻际环境中的微生物互作提供一个新的切入点,并首次证实了藻际环境中的玫瑰杆菌科细菌具有感淬灭的能力。
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2022
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