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百合枯萎病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑菌物质研究

花匠小妙招
2024-11-09 11:27

摘要: 【目的】筛选对百合枯萎病具有抑菌活性的拮抗细菌，对其抑菌活性物质进行初步分离纯化分析。【方法】以强致病力的百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为靶菌，采用系列稀释法和平板对峙法初筛拮抗细菌，并通过产铁载体能力、水解酶活性、土壤定殖力等多种生防特性指标进行复筛，结合形态学特征、生理生化指标和16S rRNA基因序列比对鉴定其分类地位；利用百合尖孢镰刀菌作为靶菌进行活性追踪，结合酸沉淀、快速柱色谱、HPLC等分离纯化手段，对菌发酵液中的抑菌活性物质进行纯化分析。【结果】在64株百合根际细菌和386株海洋细菌中进行初筛，得到9株对百合镰刀菌具有较强拮抗活性的菌株，最后筛选了1株拮抗活性较强且产铁载体能力和水解酶活性、土壤定殖能力较高的菌株11B91，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其抑菌活性物质初步推测可能为Iturin和Fengycin脂肽类化合物。【结论】菌株11B91在百合枯萎病的生物防治中具有潜在的应用价值，证实海洋来源的微生物也具有防治陆地植物病原菌的潜力，为植物病害的防治拓宽了思路。

Isolation and identification of an antagonistic bacterium against Fusarium on lily and its antifungal substances

WU Zhi-Jiang1,2, LI Ye-Yan3, WANG Ya-Jun1, YANG Liu1,2, PAN Hua-Qi4, XIE Zhong-Kui1 , HU Jiang-Chun4

Abstract: [Objective] The purpose of this study was to isolate and characterize an antagonistic bacterium against Fusarium on lily and to separate and identify its antifungal compounds. [Methods] Serial dilution method and dual-culture inhibition on agar plate were adopted for screening bacteria antagonistic to Fusarium oxysporum. The bacterial antagonists were rescreened by measuring siderophores-producing potential, hydrolytic enzymes activity and soil colonization. The previously isolated bacterial strain was identified using morphological, physiological and biochemical analyses as well as 16S rRNA gene sequencing. Antifungal substances produced by the antagonists were isolated, purified and analyzed based on bioactivity-guided method together with acid precipitation, flash chromatography and HPLC. [Results] A total of 64 bacterial isolates were obtained from the rhizosphere of filed-grown lily and 386 bacterial isolates were from marine organisms and silt. In a dual-culture inhibition test, 9 isolates displayed the antagonistic activity towards Fusarium oxysporum. Strain 11B91 was obtained by rescreening and identified as Bacillus amyloliquefaciens. Antifungal substances produced by strain 11B91 were speculated to be lipopeptides iturin and fengycin. [Conclusion] Strain 11B91 deserved to be developed a kind of biocontrol agent. This is to certify that bacteria from ocean could have potential for the biological control of pathogens which reside in soil so as to broaden our horizon for the prevention and control of plant diseases.

Key words: Fusarium oxysporum Dual-culture inhibition Siderophores Soil colonization Lipopeptides

百合(Lilium)属多年生球根类花卉，尤其以东方百合“索邦” (Lilium orential ‘Sorbonne’)花大而艳丽，呈深粉色，作为鲜切花深受消费者喜爱。然而，镰刀菌引起的枯萎病严重影响了百合切花的质量和产量，制约了百合产业化的发展。该病原菌主要从百合基生根或鳞茎盘基部的伤口入侵，造成肉质根和基盘褐化腐烂，鳞片开始出现褐色凹陷病斑，后期鳞片散开而剥落[1]。地上植株明显矮化，叶片由上而下黄化后枯萎而死。由于长期使用化学农药带来的生态环境问题，利用微生物及其代谢产物为主的生物防治手段已成为世界范围内植物病害防治的发展方向[2]。生防菌的筛选是生物防治中极为重要的一步，也是生防能否成功的关键所在。目前，国内对百合致病菌的防治主要集中在化学药剂[3, 4]、诱抗剂[5, 6]以及抗病百合品种[7]的筛选上，生物防治研究较少，仅韩玲等[8]研究发现枯草芽孢杆菌对百合枯萎病有抑菌和防病作用，而关于百合根际微生物和海洋微生物拮抗百合镰刀菌的生物防治尚未见报道。

生防菌菌剂发挥作用的一个重要机理是生防菌能够产生抗病菌活性物质。对于活性物质的研究是开发新型农药的有效途径，也是阐明其作用机理的重要环节。目前，很多研究者致力于芽孢杆菌产生抗菌活性的机制研究，其目的是为芽孢杆菌最终作为植物病害控制因子及促生因子提供理论依据。芽孢杆菌可产生多种抗菌物质，然而芽孢杆菌作为活体微生物制剂对植物病原菌进行生物防治时，其抗菌作用主要源于其产生的脂肽类抗生素[9, 10, 11]，主要包括iturin、fengycin和surfactin三大类脂肽，它们在植物病害防治中各自发挥着不同的作用。Iturins和fengycins具有很强的抑真菌活性，并对植物病害菌的生长具有广谱抑制性。Surfactins单独并没有抑菌作用，但与iturin A在一起具有协同抑菌效应。这些脂肽类物质包括脂肪酸和肽环两部分结构，是由7个(surfactins和iturins)或10个(fengycins) α-氨基酸链接到一个独特的β-氨基(Iturins)或β-羟基(Surfactins，Fengycins)脂肪酸。这种脂肪酸链的长度不一，从C13到C16为surfactins，从C14到C17为iturins，从C14到C18为fengycins[9]。

本研究对源自百合根际土壤和海洋生物、深海淤泥中的菌株进行初步筛选，通过测定初筛菌株的产铁载体活性(定性和定量)、产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶等水解酶活性以及土壤定殖力等生防相关特性进行复筛，以期筛选出对百合镰刀菌拮抗活性强的生防菌株，并进一步研究其代谢产物的抑菌活性及其成分分析，为百合镰刀菌病害的生物防治应用以及开发利用海洋微生物资源提供理论依据。

1 材料与方法1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株：细菌分离自中国南海约2 400 m深海的海泥和大连浅海海洋生物；供试病原真菌分离自百合病株，包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄类镰刀菌(Fusarium solani)和三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)。所有病原菌均回接至健康百合根部进行致病性测定以确定其致病力。

1.1.2 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基[12]；佐贝尔(ZoBell) 2216E培养基[12]；PDA (potato dextrose agar)培养基[12]；酪蛋白培养基[13]；淀粉酶活性测定培养基[12]；羧甲基纤维素钠培养基[14]；CAS (铬天青)蓝色平板[15, 16]；MKB液体培养基[17]；发酵培养基[18]。

1.2 试验方法 1.2.1 百合根际细菌和海洋微生物的分离、纯化及保存：百合根际细菌来源于宁夏回族自治区隆德县大墁坡种植的东方百合(Lilium orential ‘Sorbonne’)根际土壤。获取根际土壤的方法如下：在百合植株发病严重的地块，选择健康植株将其挖出，用力抖落附着的土壤，最后以无菌刮刀刮下的土壤作为百合根际土。取1 g根际土加入到100 mL无菌水中(装有少量玻璃珠)，150 r/min振荡摇匀20−30 min，系列稀释到10−4、10−5后分别取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，待菌落长出后挑取不同菌落纯化培养，最后将纯化的根际细菌保存于斜面培养基。深海海泥中微生物的分离过程与百合根际细菌分离方法相同，浅海海洋生物中微生物的分离按照内生细菌分离方法[19]，最后均涂布于佐贝尔2216E培养基，待菌落长出后挑取不同菌落进行纯化培养、保存于斜面培养基。

1.2.2 拮抗细菌的筛选：以百合主要致病菌尖孢镰刀菌为靶菌，采用平板对峙法筛选拮抗菌株。具体步骤如下：将PDA平板上培养7 d的尖孢镰刀菌用无菌打孔器打取直径为6 mm的菌饼接种于新的PDA平板中央，在距离中心30 mm处用无菌牙签同时接种已在牛肉膏蛋白胨上培养2 d的根际细菌和海洋细菌，每个平板接种6株细菌，3−5 d后观察结果，对于有拮抗作用的细菌，用游标卡尺测量抑菌圈直径。将筛选出的拮抗细菌用相同的方法分别测定其对茄类镰刀菌和三线镰刀菌的抑菌活性。

1.2.3 产铁载体能力的定性和定量测定：采用点接种法，用灭菌的牙签将拮抗细菌接在改进的CAS蓝色平板上，每个平板6个点，一个菌3个重复，28℃培养48 h，然后用游标卡尺测量橙色晕圈及菌落直径，最后计算可溶性指数[20]，用于衡量菌株的产铁载体能力。可溶性指数=晕圈直径/菌落直径。

参考王平等[17]的方法，选择用于定性测定的CAS蓝色检测平板上产晕圈的菌株，用接种环取一环新鲜菌苔接种于MKB液体培养基，180 r/min、28℃摇床培养48 h后，培养液4 000 r/min离心 10 min，取上清液3 mL与3 mL CAS染液充分混匀，静置1 h后，用紫外分光光度计测定680 nm[15]的吸光度(As)，以双蒸水为对照调零。同样方法以未接种的MKB培养液与CAS检测液混匀测定吸光值作为参比值(Ar)。As与Ar的比值表示上清液中铁载体的相对含量。铁载体的浓度用铁载体活性单位(Siderophore unit，Su)[21]表示：Su=1−As/Ar。

1.2.4 蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性的测定：用灭菌牙签将在牛肉膏蛋白胨上活化的拮抗细菌分别接种在酪蛋白培养基、淀粉培养基和羧甲基纤维素钠平板上，每个平板4个点，一个菌3个重复，28℃培养72 h，分别往酪蛋白培养基、淀粉培养基和羧甲基纤维素钠培养基加入三氯乙酸、卢戈氏碘液和刚果红氯化钠溶液作为显色剂，观察菌落周围有无透明圈并用游标卡尺测量透明圈的直径，依次计算蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性。酶活性=透明圈直径/菌落直径。

1.2.5 土壤定殖力测定：于兰州坚家山百合种植农田，选取健康植株的根际土壤，取土方法同1.2.1。将拮抗细菌菌悬液以106−107 CFU/g接种于根际土，混合均匀后于25℃恒温培养箱中培养。分别于接种0、2、4、6、9、12、16、20、25、32、37、40 d后取土样，在无菌条件下，用无菌药匙于土样中心位置挖取0−5 cm表层土壤，取1 g土壤进行梯度稀释。应用平板稀释法将土样稀释后，涂布于已加入各菌株抗性抗生素的平板进行计数，最后计算平均每克根际土壤中的含菌量[22]，即定殖密度来表示菌株在百合根际土壤的定殖力。

1.2.6 形态学和生理生化指标：取新鲜的菌株在牛肉膏蛋白胨平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养48 h，观察单菌落的颜色、形状、光滑度。挑取培养24 h的幼龄菌落于无菌蒸馏水中制成显微涂片，进行革兰氏染色，以枯草芽孢菌标准菌株作为对照。在菌落培养28 h后每隔4 h取样一次，用结晶紫染色，在1 000×油镜(100倍目镜×10倍物镜)下观察菌体形态特征和产芽孢情况。

采用《常见细菌系统鉴定手册》[23]中的方法进行生理生化特性鉴定，主要指标包括对麦芽糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇等各种糖醇利用，水杨素、七叶苷等分解能力，耐盐性、苯丙氨酸脱氨酶、硝酸盐还原等。

1.2.7 分子生物学鉴定：细菌基因组DNA提取使用细菌DNA提取试剂盒(大连TaKaRa公司)，按照说明书进行。16S rRNA基因的PCR扩增引物采用通用引物27F/1495R (正向引物：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-ACGGCTACC TTGTTACGACT-3′)，以菌株总DNA为模板进行扩增。PCR反应采用50 μL体系：Taq buffer mix混合物25 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，10 mg/L DNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。扩增条件为：95℃5 min；95℃1 min，54℃40 s，72℃1 min，35个循环；72℃10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，所得序列在GenBank中进行序列同源性比对，利用MEGA 5.05采用Neighbor-Joining分析方法构建系统发育进化树。

1.2.8 拮抗菌发酵液的制备：将拮抗菌株11B91接种到种子培养基(同发酵培养基成分)中，置于HZQ-QX全温振荡器中28℃、180 r/min培养24 h，作为种子液。将种子液以5%接种量接种于发酵培养基中，然后置于振荡器中28℃、180 r/min培养48 h。

1.2.9 脂肽粗提物的制备：用2% NaOH溶液将拮抗菌株11B91发酵液的pH调至8.0 (让脂肽尽可能溶于发酵液中)，4 000 r/min常温下离心30 min；取上清液，用6 mol/L盐酸调节pH至2.0，于4℃静置过夜；次日上清液于4 000 r/min常温下离心 30 min，弃上清液，沉淀用pH 2.0的盐酸洗涤2次，用甲醇少量多次萃取(萃取3次以上)，萃取液在RE52-99旋转蒸发仪中30℃减压蒸干溶剂，得到脂肽粗提物。

1.2.10 脂肽粗提物的抑菌活性跟踪测定：采用滤纸片法测定拮抗菌脂肽粗提物的抑菌活性。将百合尖孢镰刀菌的菌块(直径约为8 mm)接种于PDA平板中央，28℃培养48 h。待菌落长至直径约2 cm大小时，在直径为6 mm的无菌滤纸片上加入待测脂肽粗提物(溶于甲醇中，浓度约为5 g/L) 20 μL，以等量纯甲醇作为对照。放置于距菌块中心2 cm处，平板置于28℃培养48 h，观察并记录抑菌情况。

1.2.11 活性脂肽的纯化及分析：参考Schelhaas 等[24]和Romero等[25]的方法，并结合前期研究基础采用快速硅胶柱色谱法对活性粗提取进行分段。首先使用500−600 g的硅胶制作硅胶柱，然后按照粗体物和硅胶质量比1:2混合拌样。依次用二氯甲烷:甲醇体积比100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、50:50、0:100各500 mL减压快速洗脱，收集各洗脱液于35℃减压旋蒸去除溶剂后称重。采用滤纸片法对各组分(浓度为1 g/L)进行抑菌活性跟踪，方法同1.2.10。采用分析型高效液相色谱检测活性较高的组分的化学组成。液相色谱条件：Acclaim 120 C18分析柱(4.6 mm×250 mm)，溶液浓度：1 g/L，进样量：20 μL，检测波长：220 nm，梯度洗脱：流动相A：甲醇，B：0.05% TFA水溶液，30 min内A由80%升至100%，流速：1 mL/min。

2 结果与分析2.1 拮抗细菌的分离与筛选

从百合根际土壤中分离纯化得到64株细菌，从海洋淤泥和生物中共分离出386株细菌。采用平板对峙法以尖孢镰刀菌为靶菌进行初筛，得到BHB20、11B65、11B91、11B574、11B593、11B618、11B650、11B664和11B669等9株拮抗细菌(图 1)。

图1　拮抗细菌对百合尖孢镰刀菌的拮抗作用 Fig.1　 Antifungal effects of antagonistic bacteria on Fusarium oxysporum

这些菌株对尖孢镰刀菌表现出不同程度的抑制活性，其中抑菌活性最强为11B91，抑菌圈直径达27.0 mm (表 1)，其次为11B593、11B574，但三者之间抑制圈直径大小并无显著差异。来源于根际土壤的唯一一株菌株BHB20的抑菌圈直径仅为15.0 mm (表 1)。

表1　不同拮抗细菌对致病菌的抑菌活性Table 1　 Antifungal effects of antagonistic bacteria on pathogens

菌株
Strains 来源
Microenvironment of strains 尖孢镰刀菌抑菌圈直径
Fusarium oxysporum diameter
of inhibition zone (mm) 抑菌强度
Intensity of antifungal activity 茄类镰刀菌
Fusarium solani 三线镰刀菌
Fusarium tricinctum BHB20 Rhizosphere soil 15.0 c ++ + 11B65 Marine organisms 20.0 b ++ + 11B91 Marine organisms 27.0 a ++ + 11B574 Marine silt 22.7 ab ++ + 11B593 Marine silt 26.7 a ++ + 11B618 Marine silt 11.0 c + + 11B650 Marine silt 10.7 c + + 11B664 Marine silt 14.7 c + + 11B669 Marine silt 14.0 c + +

注：++：抑菌明显；+：抑菌微弱. 同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，表中数据为3次重复的平均值，下同.
Note: ++: intensive antifungal activity; +: moderate antifungal activity. Different letters within a column indicate significant differences at the 0.05 level by the Duncan’s test; Data are the means of three replicates. The same as below.

除了对尖孢镰刀菌具有拮抗性，9株菌对百合致病菌茄类镰刀菌和三线镰刀菌均具有拮抗活性(表 1)。BHB20、11B65、11B91、11B574和11B593对茄类镰刀菌的抑菌活性均较强，而所有菌株对三线镰刀菌的抑菌活性均较弱。

2.2 拮抗细菌产铁载体能力

对9菌株进行铁载体定性分析与定量分析结果不尽相同(表 2)。定性分析试验中，经48 h培养，7株菌可在CAS蓝色平板上产铁载体，其中在菌株11B664菌落周围出现较大橙色晕圈，可溶性指数最大，达3.52，其次是11B91，但两者之间差异不显著(表 2)。而在定量分析试验中，11B91的Su值最大，即产铁载体能力最强，显著大于11B664。这进一步证实了定性分析虽然简便，但存在一定的局限性。菌株11B618和11B650均无晕圈产生，表明这两株细菌不产铁载体，与定量分析的结果一致(表 2)。根据Persmark等[21]对细菌产铁载体能力的划分，一般产铁载体能力较高的细菌其As/Ar低于0.5，因此菌株11B91和11B664是高产铁载体细菌。

表2　不同拮抗细菌产铁载体的能力Table 2　 Siderophore-producing activity of antagonistic bacteria

菌株
Strains 可溶性指数
Solubility indexes Su As/Ar 产铁载体能力等级
Siderophore activity level BHB20 2.50 b 0.40 c 0.60 a +++ 11B65 2.56 b 0.44 c 0.56 a +++ 11B91 3.33 a 0.69 a 0.31 c ++++ 11B574 2.50 b 0.39 c 0.61 a ++ 11B593 2.50 b 0.39 c 0.61 a ++ 11B618 - - - - 11B650 - - - - 11B664 3.52 a 0.58 b 0.42 b +++ 11B669 2.80 b 0.39 c 0.61 a ++

注：-：表示不产铁载体；Su：铁载体活性单位；As/Ar：上清液中铁载体的相对含量；+越多表示产铁载体能力越强.
Note: -: No siderophores; Su: Siderophore unit; As/Ar: Relative content of siderophores in the supernatant; More ‘+’ indicates higher siderophore activity.

2.3 拮抗细菌的水解酶活性

不同的拮抗细菌产生不同的水解酶，且水解酶的活性大小也存在显著差异。所有菌株中，仅BHB20、11B65、11B91、11B574和11B593等5株拮抗细菌可产生纤维素酶，且菌株的纤维素酶活性大小差异不显著。全部株菌均可产生蛋白酶，而BHB20、11B65、11B91、11B574和11B593菌株产蛋白酶活性明显高于其他菌株。除菌株BHB20外，其他8株菌均可产生淀粉酶，其中11B65、11B91、11B574、11B593和11B669产淀粉酶活性均显著高于其他菌株(表 3)。

表3　不同拮抗细菌的水解酶活性Table 3　 Hydrolase activity of antagonistic bacteria

菌株
Strains 纤维素酶活性
Cellulase activity 蛋白酶活性
Protease activity 淀粉酶活性
Amylase activity BHB20 2.46 a 4.63 a － 11B65 2.71 a 3.08 b 3.17 b 11B91 2.68 a 3.17 b 3.33 ab 11B574 2.29 a 5.02 a 4.14 a 11B593 2.67 a 4.68 a 3.36 ab 11B618 － 1.79 c 1.63 c 11B650 － 2.64 b 1.83 c 11B664 － 1.35 c 1.88 c 11B669 － 2.76 b 3.22 b

注：-：无酶活性.
Note: -: no hydrolase activity.

2.4 拮抗细菌在根际土壤的定殖力

综合考虑所有菌株的性能指标，选取抑菌活性较高，产铁载体能力较强和水解酶活性较高的菌株BHB20、11B65、11B91、11B574和11B593作为待选菌，进一步测定其在根际土壤中的定殖力。从总体来看，5株菌株在土壤中的菌群数量均随时间而减少(图 2)，其中11B65和11B593的数量的消长动态基本一致，均在土壤培养2 d内急速下降，之后又开始升高，第4天后随时间逐渐减少；11B574的数量在40 d内一直比其他菌株低，前期下降速度较快，后期较慢。与其他菌株相比，BHB20和11B91的土壤中的数量在前期较高，且随时间下降的也较慢，最后稳定在2.5×106 CFU/g左右，32 d后数量均高于其他菌株，且BHB20在25 d后菌群数量有上升的趋势(图 2)。总之，BHB20和11B91的菌群数量较为稳定，定殖效果较好。综合考虑各种指标，11B91菌株可作为潜在的生防菌株进行菌种鉴定。

图2　不同拮抗细菌在根际土壤的定殖力 Fig.2　 Colonization density of antagonistic bacteria in rhizosphere soil

2.5 11B91菌株的鉴定 2.5.1 菌落及菌体形态：菌株11B91在牛肉膏蛋白胨培养基上培养48 h后菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，表面平整且光滑(图 3)，培养7 d后菌落表面褶皱。1 000×油镜下观察到菌体均呈短杆状，中生芽孢(图 4)，培养36 h时已经有芽孢产生，培养48 h后，绝大部分(90%以上)菌体产生芽孢。

图3　菌株11B91菌落形态 Fig.3　 Colony of strain 11B91

图4　菌株11B91显微形态(1 000×) Fig.4　 Micromorphology of strain 11B91 (1 000×) 注：A：菌体；B：芽孢.
Note: A: Thalli; B: Spores.

2.5.2 生理生化特征：菌株11B91为革兰氏阳性，能利用麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露糖、七叶苷、柠檬酸盐、水杨苷等，能液化明胶，能还原硝酸盐，过氧化氢酶为阳性，V-P反应为阳性，不产硫化氢等；在含1%−7%氯化钠的培养基中均可正常生长(表 4)。

表4　菌株11B91生理生化特性Table 4　 Physiological and biochemical characteristics of 11B91

测定指标 Characteristics 11B91测定指标 Characteristics 11B91 Maltose + Melibiose + Arabinose + Rhamnose + Sorbitol + Phenylalanine − Mannose − Acetate − Inositol − Gelatin liquefaction + Esculoside + Nitrate reduction + β-Galactoside − V-P reaction + Hydrogen sulfide − Hippurate + Gluconate − Amylolysis + Citrate + Anaerobic growth − Arginine double hydrolysis − Colony color 乳白色 Catalase + Sodium chloride tolerance 7% Sucrose + Colony surface 光滑 Salicin +

注：+：阳性反应；−：阴性反应；%：菌株的最高耐盐浓度.
Note: +: Positive reaction; −: Negative reaction; %: The highest concentration of sodium chloride the strain could endure.

2.5.3 16S rRNA基因序列测定及分析：菌株11B91的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，登录号为KM873228，使用Blastn程序进行相似性比对分析，调取GenBank数据库中与之同源性较高的菌株16S rRNA基因序列，利用MEGA 5.05采用Neighbor-Joining分析方法构建系统发育进化树。来源于海洋生物的细菌11B91与Bacillus amyloliquefaciens一致性为100% (图 5)，生理生化指标也与之相符，所以将11B91鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

图5　拮抗细菌11B91 16S rRNA基因系统发育进化树 Fig.5　 Phylogenetic tree constructed from comparative analysis of 16S rRNA gene sequences

2.6 菌株11B91的脂肽粗提物的抑菌活性

经过酸沉淀、甲醇提取、旋转蒸发得到脂肽粗提物6.69 g，经活性跟踪测定结果表明，脂肽粗提物对百合尖孢镰刀菌有明显的抑菌活性(图 6)。

图6　 11B91脂肽粗提物(A)和不同组分(B)对百合尖孢镰刀菌的抑菌活性 Fig.6　 The antifungal activity of crude lipopeptides (A) produced by 11B91 and varied ractions (B) to Fusarium oxysporum

2.7 不同组分的抑菌活性及液相色谱分析

11B91脂肽粗提物经快速硅胶柱色谱得到8个组分(nf1−nf8)，经活性跟踪测定，其中组分nf5、nf6、nf7和nf8对百合尖孢镰刀菌具有明显抑菌活性(图 6)。为了检测这4个组分所含化合物类型，经HPLC检测得到液相色谱图如图 7所示。根据脂肽的特点及前期的相关研究[26, 27]，在反相高效液相色谱中，Iturin类脂肽会最先出峰(保留时间在 5−11 min左右)，接着是fengycin类脂肽(保留时间在13−20 min左右)，最后是surfactin类的脂肽(保留时间在30−35 min左右，图 7)。从保留时间来看，4个组分均主要是iturin和fengycin两类脂肽。

图7　 4个活性组分(nf5−nf8)的液相色谱图 Fig.7　 The chromatogram of antifungal fractions (nf5−nf8) in RP-HPLC system

3 结论与讨论

解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的重要菌种，越来越受到研究人员的关注，它在植物病害生防中发挥着重要作用。随着解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组测序[28]，关于解淀粉芽孢杆菌在生防中的分子机制也得到了广泛而深入的研究[29, 30, 31]，进一步阐明了其在生防中的作用机理，推动了其在生产实践中的应用。本文中的11B91是一株来源于海洋生物的解淀粉芽孢杆菌，该菌株对百合镰刀菌具有较强的拮抗作用，且能产生铁载体、蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，能够在土壤中较好地定殖，是一株极具生防潜力的海洋菌株。后续将对该菌株的发酵工艺、菌剂研制、生防机制等进行深入研究，并制成可湿性芽孢菌剂进行田间防效试验，以明确其田间生防效果及应用前景。

在生防菌的筛选过程中结合生防作用机制，能够增加菌株在田间生防中成功的几率。近年来，研究人员对微生物铁载体越来越关注，对原来的检测方法进行了改进，变得更加简便和准确。本研究采用改进的铁载体检测方法[15, 17]从定性、定量两方面研究了拮抗细菌的产铁载体特性。铁载体是拮抗菌产生的拮抗物质之一，与微生物的拮抗作用密切相关。已有大量研究[32, 33, 34, 35]发现，高产铁载体菌株产生的超强螯合能力的铁载体螯合了环境中痕量的铁，有效地与病原菌竞争铁离子从而抑制病原菌。本研究筛选的9株拮抗菌中有7株能产生铁载体，这也证实了前人研究的铁载体在微生物拮抗病原菌中具有重要作用。另外，水解酶作为菌株的生防机制之一，越来越多地被用作评估生防菌的生防潜能指标[36, 37, 38]。纤维素酶在生防菌竞争营养基质方面可作为筛选生防菌的首选参考指标[39, 40]，纤维素酶活力越高，生防潜能越大[41]。本研究筛选的拮抗细菌中有5株可产纤维素酶，这也与抑菌活性较高的菌株一致。

由于生防菌在田间会受到各种因素的影响，平板对峙法所筛选出的抑菌效果好的菌株不一定是最好的生防菌[42]。生防菌能否发挥其防治病害的功效首要条件就是其能否在根际有效定殖，生防菌在根际的定殖力决定其生防力[43]。本研究筛选得到的5株拮抗细菌在百合根际土壤中的定殖数量均随时间延长而减少，其中菌株11B65和11B593在土壤培养2 d内急速下降后又开始升高，第4天后随时间逐渐减少，这可能是菌株本身短时间内难以适应土壤而大量死亡，之后又有一定的繁殖，而这一时期可能是菌株逐渐适应土壤的阶段。定殖25 d后，仅BHB20和11B91基本趋于稳定，定殖效果较好，证实了BHB20与其他海洋菌株相比，定殖力更强。Kim等[44]也发现辣椒生防菌株KJ9C8在根际土壤的定殖数量前期逐渐下降，21 d后开始趋于稳定。而在定殖前期所有菌株的密度均有不同程度的降低，这可能与海洋细菌难以在短时间适应大田土壤环境有关，或与土壤中微生物种群复杂、微生物相互制约有关。对于菌株BHB20和11B91在根际土壤中的定殖及其定殖后的生防能力应需要进一步深入研究，结合盆栽和大田防效试验，明确其在田间的生防效果。

解淀粉芽孢杆菌可产生Iturin、Fengycin和Surfactin的脂肽类抗生素[45]，它们均具有抵抗植物病原真菌的能力，但抗菌效果较好的属于Iturin和Fengycin两类[46, 47]。牛力轩等[27]从海洋淤泥中首次筛选到产Bacillopeptin类脂肽抗生素的解淀粉芽孢杆菌，对于解淀粉芽孢杆菌脂肽类抗生素的种类又有了新的扩展。本研究中来源海洋的解淀粉芽孢杆菌11B91，其代谢物中的脂肽粗提物对百合尖孢镰刀菌有明显的抑菌活性。这表明11B91能够产生抑真菌物质，对病原菌有拮抗作用。11B91脂肽粗提物经过快速硅胶色谱柱分段后，对各组分进行抗真菌活性测试，4个活性组分经高效液相色谱检测，根据保留时间可初步确定活性物质为Iturins和Fengycins两类脂肽。为了进一步确定其化学结构，还需结合半制备反相高效液相色谱、高分辨质谱和核磁共振的手段对活性脂肽进行再纯化及结构鉴定。