首页 > 分享 > 有机和无机肥配比对黄褐土硝化和反硝化微生物丰度及功能的影响

有机和无机肥配比对黄褐土硝化和反硝化微生物丰度及功能的影响

花匠小妙招
2024-11-10 10:25

自上世纪50年代以来，无机肥料因其高效、增产效果显著、施用方便等特点快速成为我国农田的主导肥源[1]。无机肥施用量从1950年的0.6万吨增加到2015年的6022.6万吨，增加了近万倍，占当前总肥源的90%[2–3]。近年来无机肥料在方便高效和增产的同时，也造成了农田周围水体污染、土壤结构破坏和土壤酸化等一系列负面问题[4]。目前，在确保粮食产量的同时，土壤质量的可持续性逐渐成为人们关注的焦点。有机肥的施用已被多次证实可以显著改善土壤结构；同时它含有丰富的养分，有利于维持农业生态系统的物料平衡[5–6]。然而，有机肥矿化速度较慢，单施有机肥对作物的增产效果不显著[7]。因此有机和无机肥的合理配施，通常被认为是保障作物产量和改善土壤质量的有效途径。由于有机和无机肥配合施用会改变土壤的理化性状，并对微生物活性及丰度产生影响[8–9]，土壤养分循环也因此可能会受到深刻影响。

氮素循环是土壤养分循环中最重要的循环之一[10]，它与作物生产、环境污染密切相关。土壤中硝化和反硝化是氮素转化的主要过程[11]。硝化过程是指氨 (NH3) 在好氧微生物作用下氧化成NO2－，随后再氧化成NO3－的过程。其中从NH3氧化成NO2－是该过程的限速步骤，由氨氧化细菌 (AOB) 和氨氧化古菌 (AOA) 驱动[12–13]。不同无机和有机肥配比为AOA和AOB提供了不同的NH4+ 底物，因此可能会对它们的丰度和各自功能产生影响。此外，由于AOA和AOB对不同CO2浓度的响应存在差异[14]，有机和无机肥配比在改变土壤CO2排放量[15–16]的同时，也可能会对AOA和AOB生长和活性产生影响。当前的研究主要集中在单施无机肥或有机肥对氨氧化微生物丰度及功能的影响，而不同比例配施对其丰度和功能的影响未见报道。

反硝化过程是反硝化微生物将环境中的NO3– 经多种酶催化逐步还原为气态产物 (NO、N2O和N2) 的过程。其中由nirK和nirS基因编码的亚硝酸还原酶首次将土壤中可溶态氮转化成一般作物难以利用的气态氮素[17]，是土壤氮素损失的主要过程，也是当前研究的重点。此外，N2O还原酶与痕量气体N2O的排放密切相关，也受到广泛的关注[18]。有机肥直接为反硝化细菌提供碳源并促进其生长。同时，有机肥的施入也有利于其他微生物的生长，增加CO2排放量，加快氧气的消耗，这为反硝化作用提供良好的低氧微域环境[19]。反硝化微生物是异养微生物，有机物为它们提供电子还原氧化态的氮素，从而在厌氧条件下进行无氧呼吸，维持自身能源和生长需求[17]。不同有机肥和无机氮素配比，既提供了反硝化微生物的电子供体，又提供了电子受体，而不同供体和受体比例差异如何影响反硝化微生物丰度和功能，目前尚不清楚。

本研究依托江淮地区的3年定位试验，通过田间原位取样和室内培养，利用分子微生物学和生物化学等方法，重点研究有机和无机肥不同配比对该地区主要土壤 (黄褐土) 硝化和反硝化微生物丰度及其功能的影响，并探讨其变化的可能机理，以期为该地区制定合理的施肥制度、减少氮肥损失及提高氮素利用效率提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1 试验点概况

试验点位于安徽省合肥市安徽农业大学农翠园试验基地 (N 31°87′、E 117°25′)。该地区年平均温度为15.7℃，降雨量998 mm。土壤类型为黄褐土，试验开始前，0—20 cm土壤全氮1.8 g/kg、有机质21.0 g/kg、碳氮比6.8、碱解氮108.7 mg/kg、全磷0.4 g/kg、全钾21.2 g/kg、有效磷10.8 mg/kg、速效钾149.3 mg/kg、油菜籽饼肥pH为 4.9。

1.2 试验布置与样品采集

试验始于2014年6月初。采用随机区组设计，设置6种不同的施肥方式：CK (对照，不施氮肥)、T1 (单施无机肥)、T2 (无机肥∶有机肥 = 2∶1)、T3 (无机肥∶有机肥 = 1∶1)、T4 (无机肥∶有机肥 = 1∶2)、T5 (单施有机肥)。每个施肥处理总氮量一致，配施处理的比例是以氮计算，各小区磷钾肥的施用量相同。小区面积为14.4 m2，共3次重复。玉米季和小麦季的总施氮量为 240 kg/hm2，玉米基施P2O5 107.1 kg/hm2、K2O 112.5 kg/hm2；小麦基施P2O5 150 kg/hm2、K2O 120 kg/hm2。玉米氮肥分基肥、穗肥两次施用，比例为3∶7；小麦氮肥分基肥、拔节肥两次施用，比例为4∶1。无机氮肥采用尿素，有机肥采用油菜籽饼肥，有机肥和磷钾肥作基肥一次施入，施肥方式以及相关农艺管理措施每年保持一致。玉米和小麦分别于每年6月初和10月底播种。

试验取样在2017年3月7日，于小麦拔节期，在每个小区行间“S”形取0—20 cm的土样5～6钻，四分法取约1 kg装入封口袋内。带回室内过2 mm筛，分两部分储藏，一部分放在–20℃冰箱储藏，用于硝化和反硝化功能基因分子定量试验；另一部分放在4℃冰箱储藏，用于培养试验和土壤理化性状的测定。

1.3 硝化势 (NP) 和乙炔抑制后硝化势的恢复 (RNP)

硝化势和乙炔抑制后硝化势的恢复采用悬浮液法[20–21]测定。

硝化势的测定：各小区称取鲜土样5 g，分别加入50 mL提前配制的液体培养基 (1.5 mmol/L NH4+)，30℃恒温振荡48 h (180 r/min)。分别于第6、12、24、36、48 h取样，每次吸取4 mL悬浮液离心，将上清液用于NO3－-N、NO2–-N分析。NO3–-N、NO2–-N用连续流动分析仪测定 (德国，AA3全自动连续流动分析仪)。硝化势用单位时间内产生的NO3–-N和NO2–-N总量表示。

乙炔抑制后硝化势的恢复：各小区取两组5 g鲜土放入两组120 mL培养瓶中，加入50 mL的液体培养基 (1.5 mmol/L NH4+)，并用微型注射器添加体积比为0.025%的乙炔，30℃恒温振荡培养 6 h。6 h后，用抽真空器抽去乙炔。其中一组添加对细菌蛋白质合成具有专一性抑制作用即抑制氨氧化细菌 (AOB) 的抗生素类物质—卡那霉素 (Kanmycin，浓度为800 μg/mL)。每12 h测一次硝化势，测至第48 h。其中添加卡那霉素的培养瓶测的是氨氧化古菌的硝化势 (RNPAOA)，不添加卡那霉素的为AOA和AOB总的硝化势 (RNPtotal)，RNPAOB = RNPtotal–RNPAOA。

1.4 反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 产物比和土壤呼吸测定

反硝化能力的测定主要按照Šimek等[22–22]的标准方法。各小区取两份相当于10 g干土的鲜土放入两组120 mL培养瓶中，向瓶中加入5 mL浓度为42.9 mmol/L的KNO3溶液，随后密封，并用氦气反复冲洗4次。其中一组注入10 mL乙炔，另一组不注入。注乙炔的培养瓶，用装有少量水、没有活塞的注射器插入瓶塞用来平衡瓶内气压。在24 h和48 h后，两组都抽取5 mL气体上气相色谱测定N2O和CO2浓度 (美国Agilent，GC-7890A)。抽完气体后为防止气压变低，用相同体积的氦气进行补气平衡。根据24 h到48 h N2O和CO2浓度变化率计算反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 和土壤呼吸[22]。其中添加乙炔的培养瓶N2O气体变化率是反硝化能力，代表反硝化总量N2O+N2的产生率；不添加乙炔的培养瓶N2O气体变化量代表反硝化过程N2O排放率。

1.5 土壤微生物总DNA提取和功能基因荧光定量

取0.5 g土样，通过土壤DNA提取试剂盒 (Fast DNASPIN Kit for Soil，美国Q-BIO gene公司)，按试剂盒操作步骤，提取土壤微生物总DNA，总提取量为80 μL，洗脱液放入–20℃冰箱储藏。氨氧化细菌和氨氧化古菌功能基因amoA定量PCR采用Mx3000P实时荧光定量PCR系统 (Stratagene，USA)，选择amoA1F/amoA2R和Arch-amoAF/Arch-amoAR引物分别扩增氨氧化细菌和古菌。选用25 μL的PCR反应体系，包含：12.5 μL的2 × SG Green qPCR Mix，上下游引物各0.5 μL (10 μmol)，0.5 μL DNA模板，剩下的用双蒸水补齐至25 μL。氨氧化细菌反应程序为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸60 s，35个循环。氨氧化古菌PCR反应程序为：95℃预变性4 min；95℃变性45 s、53℃退火60 s、72℃延伸60 s，30个循环。分别选取nirScd3aF/nirSR3cd、nirK1F/nirK5R和nosZ1F/nosZ1R 3对引物扩增反硝化菌功能基因nirS、nirK和nosZ。50 μL反应体系包括25 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，日本)，引物各1 μL (10 μmol/L)，DNA模板1 μL，其余的用灭菌高纯水补齐。nirS扩增程序为：95℃ 2 min；95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环。nirK的PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环。nosZ的PCR反应程序为：95℃ 3 min；94℃ 20 s，59℃ 20 s，72℃ 30 s，35个循环。质粒和标准曲线的制备主要依照王晓辉[24]的方法。

1.6 土壤理化性状测定

土壤pH由土壤pH计测定，水土比为5∶1。有机质采用重铬酸钾容量法测定；全氮采用高锰酸钾还原，浓H2SO4消煮，凯氏定氮仪定氮；全磷全钾用氢氧化钠碱融；碱解氮用碱解扩散吸收法；有效磷使用碳酸氢钠—分光光度计法测定；速效钾采用醋酸铵—火焰光度计测定；土壤可溶性有机碳 (DOC) 用0.5 mol/L K2SO4浸提30 min，过滤后用可溶性有机碳分析仪 (Analytik Jena，Germany) 测定。

1.7 数据统计与分析

数据用SPSS19分析软件进行单因素方差和相关性分析。图中数据为处理平均值 ± 标准差。用Microsoft Excel 2007作图。

2. 结果与分析

2.1 不同有机和无机肥配比对土壤理化性状的影响

从表1可以看出，不同有机肥无机肥配比处理对土壤基础理化性状的影响不尽相同。三年的定位试验，处理间全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾含量的差异并不显著。但处理间的土壤pH已经产生了一定差异，与对照处理相比，其他施肥处理有下降的趋势；其中无机肥∶有机肥 = 2∶1的处理 (T2) 显著低于对照处理。全施有机肥处理的土壤有机质和可溶性有机碳含量显著高于对照，与其他不同比例配施处理差异不显著。此外，全施有机肥处理碱解氮含量最高，显著高于T2处理和对照处理，但与其他处理之间差异不显著。

2.2 不同有机和无机肥配比对硝化势和氨氧化细菌及古菌贡献率的影响

由图1可知，与对照不施氮相比，长期施氮会显著增加土壤的硝化势。单施无机肥处理硝化势最高，达到70.0 mg/(kg·d)，是对照不施氮的5.4倍，其次是单施有机肥处理。在所有施肥处理中，T3处理 (无机∶有机 = 1∶1) 的硝化势最低，并且显著低于T1处理。单施无机肥和有机肥处理之间没有显著差异。

图 1 不同有机和无机肥配比对土壤硝化势的影响

[注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 1. Nitrification potential under different ratios of organic and inorganic fertilizers

由图2可知，不同处理中，AOA的硝化潜势贡献率为36.6%～79.7%。可见硝化古菌在黄褐土氮素转化过程中占十分重要的地位。单施无机肥处理的AOA在硝化作用中占主导地位，AOA硝化贡献率高达79.7%。未施氮肥CK和单施有机肥T5处理中，AOB在土壤硝化作用中占优势地位，AOB的硝化贡献率分别为63.4%和59.9%。与单施有机肥相比，随着无机肥所占比例的增加，AOA的硝化相对贡献率有增加趋势。同样，增加有机肥比重会提高AOB的相对贡献率。

图 2 不同有机和无机肥配比对氨氧化细菌及古菌硝化贡献率的影响

[注(Note)：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 2. Relative contribution of AOA and AOB under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表 1 有机和无机肥配比对土壤理化性状的影响

Table 1. Effects of different ratios of organic and inorganic fertilizers on soil physical and chemical properties

处理
Treatment pH 有机质
Organic matter
(g/kg) 全氮
Total N
(g/kg) 全磷
Total P
(g/kg) 全钾
Total K
(g/kg) 碱解氮
Alkali-hydrolysis N
(mg/kg) 有效磷
Available P
(mg/kg) 速效钾
Available K
(mg/kg) 可溶性有机碳
Dissolved organic C
(mg/kg) CK 7.3 ± 0.4 a 21.3 ± 0.9 b 1.8 ± 0.1 a 0.7 ± 0.2 a 20.7 ± 3.6 a 66.9 ± 15.9 c 46.2 ± 8.4 a 328.3 ± 51.6 a 27.4 ± 1.6 b T1 6.9 ± 0.1 ab 24.4 ± 1.9 ab 2.1 ± 0.3 a 0.9 ± 0.1 a 24.2 ± 0.2 a 89.7 ± 11.0 abc 41.1 ± 8.2 a 319.8 ± 4.7 a 28.1 ± 2.4 b T2 6.6 ± 0.3 b 24.6 ± 3.5 ab 2.0 ± 0.4 a 0.9 ± 0.2 a 26.0 ± 2.9 a 85.8 ± 4.8 bc 51.8 ± 7.6 a 345.8 ± 19.9 a 29.3 ± 1.8 ab T3 6.7 ± 0.6 ab 25.8 ± 1.8 ab 2.0 ± 0.1 a 0.9 ± 0.1 a 24.2 ± 2.2 a 104.6 ± 7.4 ab 54.9 ± 5.7 a 342.5 ± 13.1 a 30.2 ± 2.4 ab T4 6.7 ± 0.8 ab 27.7 ± 3.8 a 2.0 ± 0.3 a 0.9 ± 0.1 a 23.8 ± 4.4 a 109.2 ± 16.6 ab 49.7 ± 4.4 a 343.3 ± 23.4 a 31.1 ± 1.7 ab T5 6.7 ± 0.5 ab 29.1 ± 2.4 a 2.2 ± 0.5 a 1.0 ± 0.2 a 26.6 ± 1.0 a 111.1 ± 2.8 a 51.8 ± 2.4 a 356.0 ± 18.9 a 33.1 ± 2.0 a 注（Note）：同列数据后不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values followed by different letters represent significant differences among treatments (P < 0.05). 2.3 不同有机和无机肥配比对氨氧化细菌和古菌丰度的影响

由图3看出，各处理的氨氧化细菌amoA基因拷贝数分别是氨氧化古菌的23.1～34.8倍，在丰度上，黄褐土中的氨氧化细菌占优势地位。和不施氮肥相比，有机和无机肥均会显著增加AOB-amoA基因拷贝数；但有机肥、无机肥以及不同配比间其丰度差异并不显著。与对照处理相比，单施无机肥会显著增加AOA-amoA的拷贝数。与单施有机肥处理相比，增加无机肥比重有增加AOA-amoA基因拷贝数的趋势。

图 3 不同有机和无机肥配比对氨氧化细菌和古菌丰度的影响

[注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 3. Abundances of AOB and AOA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.4 不同有机和无机肥配比对土壤反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 和土壤呼吸的影响

由图4可知，随着有机肥投入量的增加，土壤反硝化能力和土壤呼吸都呈增加趋势。其中单施有机肥处理的反硝化能力和土壤呼吸显著高于其他处理，3个配比处理和单施无机肥处理间差异不显著。

由图5可知，各处理N2O/(N2O+N2) 产物比排序依次为：T4 > CK > T1 > T3 > T2 > T5。其中无机∶有机 = 1∶2的T4处理最高，产物比达到77%。单施有机肥处理最低，显著低于对照不施氮肥处理和T4处理。

图 4 不同有机和无机肥配比对土壤反硝化能力和土壤呼吸的影响

[注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 4. Denitrification capacity and soil respiration under different ratios of organic and inorganic fertilizers

图 5 不同有机和无机肥配比对N2O/(N2O+N2) 产物比的影响

[注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 5. N2O/(N2O+N2) ratios under different ratios of organic and inorganic fertilizers

2.5 不同有机和无机肥配比对反硝化菌群丰度的影响

由图6可知，供试土壤nosZ基因拷贝数远高于nirK和nirS基因拷贝数，前者比后者高出1～2个数量级。施肥显著增加了nirS型反硝化菌丰度 (图6A)。nirK基因拷贝数随着有机肥投入量的增加有减少的趋势 (图6A)，而nirS和nosZ型基因拷贝数却有增加的趋势。与单施无机肥处理相比，有机肥与无机肥施用配比2∶1以上时，会显著增加nosZ拷贝数 (图6B)。

图 6 不同有机和无机肥配比对nirK、nirS和nosZ拷贝数的影响

[注（Note）：柱上不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Different letters above the bars represent significant differences among treatments (P < 0.05).]

Figure 6. Effects of different ratios of organic and inorganic fertilizers on nirK, nirS, and nosZ copies

2.6 不同有机和无机肥配比试验中测定变量之间的相关性分析

由表2可知，pH与AOB-amoA基因拷贝数和nirS基因拷贝数呈显著负相关 (r = –0.574和–0.481，P < 0.05)。氨氧化古菌对硝化势的相对贡献率 (RNPAOA/RNPtotal) 与氨氧化古菌丰度呈极显著正相关 (r = 0.748，P < 0.01)。反硝化能力与土壤呼吸呈极显著相关 (r = 0.677，P < 0.01)，同时两者也与nirS和nosZ型反硝化菌丰度呈极显著正相关 (r = 0.685、0.816、0.644和0.833，P < 0.01)，而与nirK型反硝化菌的相关性未达到显著水平。同时，反硝化能力与土壤有机质和可溶性有机碳含量呈极显著正相关 (r = 0.634和0.593，P < 0.01)，与碱解氮含量呈显著正相关 (r = 0.564，P < 0.05)。N2O/(N2O+N2) 产物比与各变量均无显著相关性。

表 2 不同有机和无机肥配比测定变量间相关性分析

Table 2. Correlation analysis among measured variables in treatments with different ratios of organic and inorganic fertilizers

项目
Item pH 有机质
OM 碱解氮
Alk-hydr. N DOC NP RNPAOA/
RNPtotal DC N2O/
(N2O+N2) 土壤呼吸
Soil respiration AOB-
amoA
copies AOA-
amoA
copies nirK
copies nirS
copies 有机质OM 0.065 碱解氮
Alk-hydr. N –0.487* 0.520* DOC 0.202 0.648** 0.603** NP 0.015 0.295 0.247 0.338 RNPAOA/RNPtotal –0.128 0.022 0.055 –0.187 0.271 DC –0.322 0.634** 0.564* 0.593** 0.281 –0.087 N2O/(N2O+N2) –0.019 –0.402 –0.075 –0.152 –0.270 –0.080 –0.185 土壤呼吸
Soil respiration –0.154 0.597** 0.459 0.496* 0.583* 0.022 0.677** –0.394 AOB-amoA copies –0.574* 0.122 0.345 0.022 0.234 0.476 0.218 –0.037 0.314 AOA-amoA copies 0.002 0.218 0.086 –0.004 0.353 0.748** –0.085 –0.249 0.079 0.38 nirK copies –0.388 –0.095 0.004 –0.336 0.574* 0.518* –0.058 –0.301 0.108 0.241 0.562* nirS copies –0.481* 0.652** 0.678** 0.385 0.440 0.214 0.685** –0.322 0.644** 0.532* 0.076 0.218 nosZ copies –0.230 0.611** 0.530* 0.592** 0.313 –0.099 0.816** –0.335 0.833** 0.305 –0.126 –0.146 0.727** 注（Note）：DOC—可溶性有机碳 Dissolved organic carbon; NP—硝化势 Nitrification potential; DC—反硝化能力 Denitrification capacity. *—P < 0.05; **— P < 0.01.

3. 讨论

3.1 不同有机和无机肥配比对氨氧化微生物、硝化贡献率及硝化潜势的影响

氨氧化细菌和氨氧化古菌驱动土壤硝化过程，在土壤生态系统氮循环中起到重要的作用[25]。本研究表明，与不施氮肥相比，无机肥和有机肥的投入均会增加AOA和AOB的种群丰度，这与其他报道一致[26–27]。但有机肥与无机肥对AOA和AOB的影响存在显著差别 (图3)。有机肥、无机肥和不同配比对AOB的丰度并没有显著的影响，但随着无机肥所占比例的增加，AOA的丰度有显著增加的趋势。对硝化潜势相对贡献率的测定 (图2) 也表明，单施无机肥处理的AOA硝化贡献率高达79.7%，显著高于单施有机肥处理和无机∶有机 = 1∶2的处理。相关分析也表明，RNPAOA/RNPtotal与AOA-amoA基因拷贝数呈极显著正相关 (表2)。由此说明增加无机肥投入比例有利于提高AOA的丰度和相应的硝化贡献率。这可能和氨氧化古菌具有脲酶基因，能够利用尿素生长，并在自然环境里通过尿素水解进行氨氧化作用有关[28]。同时，有研究表明[29–30]，AOA在低CO2浓度下具有更高效的固定途径，与有机肥处理相比，无机肥产生的CO2量相对较低，所以这也可能有利于AOA的生长。与不施氮肥对照处理相比，施肥显著提高土壤硝化势，这与前人研究结果一致[31–35]。单施无机肥和有机肥的硝化势高于其它三个配比处理，其中无机∶有机 = 1∶1处理的硝化潜势最低，与单施无机肥处理差异显著。硝化作用由AOA和AOB共同驱动，本试验中无机∶有机 = 1∶1处理的AOA、AOB丰度之和在所有施肥处理中是最低的，这可能是该处理硝化潜势最低的原因。与单施无机肥或有机肥处理相比，有机和无机肥适当配施可降低土壤硝化势。尽管施用有机肥或无机肥均能提高硝化势，但提高的机理存在差异。无机肥主要通过提高脲酶活性、促进尿素水解提高硝化势；而有机肥则是通过矿化作用产生氨而促进硝化作用[36–37]。综上所述，增加无机肥的比重有利于AOA丰度的提高并增大硝化相对贡献率，而增大有机肥比重则相应提高AOB的硝化相对贡献率。

3.2 不同有机和无机肥配比对反硝化能力、N2O/(N2O+N2) 产物比及反硝化菌的影响

有机肥添加为土壤提供了大量的碳源，为反硝化微生物提供了丰富的电子供体，因此施用有机肥可能会对反硝化过程产生一定影响。本研究发现单施有机肥处理的反硝化能力和土壤呼吸都显著高于单施无机肥处理，然而3个配比处理显著低于单施有机肥处理，说明有机和无机配施能够有效地减少土壤反硝化损失。研究表明，土壤中可利用的碳源是影响反硝化作用的主要原因[26, 32, 38]。本研究也发现反硝化能力和土壤可溶性有机碳存在极显著正相关关系 (表2)。施用有机肥为异养生长的反硝化菌提供了丰富的碳源[39]。同时，有机肥有利于提高土壤微生物活性，从而加快氧气的消耗，这为反硝化作用提供良好的低氧微域环境[19, 40]。本试验中单施有机肥处理的可溶性有机碳含量是最高的 (表1)，而配施则可以有效减少可溶性有机碳含量，从而降低土壤反硝化损失。

反硝化菌群直接参与反硝化过程，其丰度变化也可能对反硝化能力产生一定影响[41]。本研究发现，不同比例的有机和无机肥配施对nir基因产生不同的影响，无机肥能促进nirK型反硝化菌生长，有机肥能促进nirS和nosZ型反硝化菌生长。罗希茜等[42]也发现长期施用无机氮肥会使nirK基因的反硝化菌群落结构发生显著变化，而对nirS基因群落结构则无显著影响。相关分析 (表2) 表明，nirS型反硝化菌的丰度与反硝化能力、土壤呼吸、有机质、碱解氮含量呈极显著正相关。相对于nirK型菌，nirS型反硝化菌通常更喜欢有机碳和营养元素含量较高的环境[43]。有机肥的投入可以提高土壤中有机碳和速效氮的量[36]，因此有利于nirS型菌的生长。反硝化能力与nirS型和nosZ反硝化菌的丰度呈极显著正相关，而与nirK型反硝化菌没有相关性 (表2)，由此可见，nirS和nosZ型反硝化菌而非nirK型菌对反硝化能力起主要的驱动作用。

nosZ型菌参与反硝化末端N2O还原，与N2O/(N2O+N2) 产物比有关。反硝化作用不仅造成氮肥的损失，直接影响氮肥的有效利用，而且还会产生一部分痕量气体N2O，造成温室效应以及破坏臭氧层[44–45]。本研究发现nosZ型反硝化菌丰度与N2O/(N2O+N2) 产物比之间存在一定负相关关系 (表2)，可见提高nosZ型反硝化微生物丰度是降低土壤N2O/(N2O+N2) 产物比的有效途径。随着有机肥施用量的提高，nosZ型反硝化菌的丰度有显著增加的趋势，但N2O/(N2O+N2) 产物比却呈现出先下降后升高再下降的趋势 (图5，图6B)。由此可见，最终影响N2O/(N2O+N2) 产物比的不仅是nosZ型反硝化菌的丰度，也和其他因素有关，例如nosZ基因的表达量及N2O还原酶的活性。在未来的研究中，在RNA水平上nosZ的表达量和相关酶活性是研究的重点，应该得到进一步加强。

4. 结论

有机和无机肥配施对硝化和反硝化过程产生不同程度的影响。与单施有机肥或无机肥相比，有机和无机肥适当配施可降低土壤硝化势。无机肥会增加AOA的丰度和硝化贡献率，而有机肥则有利于AOB的硝化贡献率。有机和无机肥不同配比可以调控AOA和AOB在硝化过程中所起的作用。单施有机肥会增加反硝化损失，添加无机肥进行配比，会降低反硝化损失。无机肥能促进nirK型反硝化菌生长，有机肥能促进nirS和nosZ型反硝化菌生长。nirS和nosZ型反硝化菌而非nirK型菌对反硝化能力起主要的驱动作用。