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抗ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV的番茄植株及相应的抗性基因的制作方法

花匠小妙招
2024-11-10 13:55

本发明涉及番茄(solanum lycopersicum)(又称番茄(lycopersicumesculentum))植株对烟草花叶病毒属(tobamoviruses)、特别是对番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus)(tobrfv，先前缩写为tbrfv)、并且优选地也对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)(tmv)、番茄花叶病毒(tomato mosaic virus)(tomv)和/或番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus)(tommv)的抗性。更具体地，本发明涉及包含抗性基因的番茄植株和果实，该抗性基因可导致至少对tobrfv并且优选地对至少一种另外的烟草花叶病毒的抗性。根据本发明，赋予对这些烟草花叶病毒属的抗性的抗性基因是tm-2和tm-2-2基因等位基因的变体。抗性基因可以纯合地或杂合地存在于番茄植株的基因组中。本发明还涉及该抗性基因、其部分、编码的多肽和蛋白质以及这些序列和蛋白质用于获得抗性植株的用途。本发明还涉及此类植株的种子和后代、用于获得此类植株的繁殖材料以及这些植株的不同用途。

背景技术：

1、所有栽培的和商业形式的番茄都属于一个最常被称为番茄(lycopersiconesculentum miller)的物种。番茄属(lycopersicon)是极为庞大且种类繁多的茄科(solanaceae)中一个相对较小的属，茄科被认为由大约90个属组成，包括辣椒、烟草和茄子。番茄属(lycopersicon)分为两个亚属，普通番茄(esculentum)复合体，其包含那些可以容易地与商业番茄杂交的物种，以及秘鲁番茄(peruvianum)复合体，其包含那些很难进行杂交的物种。由于其作为农作物的价值，番茄(lycopersicon esculentum miller)已经在世界各地广泛传播。

2、番茄为其果实而种植，广泛用作鲜食或加工产品。作为一种农作物，番茄在环境条件允许生产经济上可行的产量的任何地方进行商业种植。大多数鲜食番茄都是在藤成熟且绿熟期的成熟度时手工采摘的。鲜食番茄全年供应。加工番茄大多是机械采收，并以多种形式使用，如番茄罐头、番茄汁、番茄沙司、番茄泥、番茄糊甚至番茄酱(catsup)。

3、番茄通常是一个简单的二倍体物种，具有十二对分化的染色体。然而，多倍体番茄也是本发明的一部分。栽培番茄是自花受精的，几乎完全自花授粉。番茄花是雌雄同体。商业栽培品种最初是开放授粉的。由于已在番茄中鉴定出杂交优势，杂交品种正在取代开放授粉品种，因为其产量更高且植株特征一致而在农民中越来越受欢迎。番茄因其传播范围广、价值高而得到集约化培育。这就解释了为什么现在有这么多种番茄可供选择。形状可能从小到大，有樱桃形、李子形、梨形、块状(blocky)、圆形、牛排形(beefsteak type)。

4、番茄可以根据植株成熟果实所需的时间分组进行收获，一般而言，栽培品种被认为是早熟、中熟或晚熟的。番茄也可以根据植株的生长习性进行分组；确定型、半确定型或不确定型。确定型植株往往先长出叶子，然后开花，如果授粉成功，这些花便会结成果实。植株上所有的果实往往在约同一时间成熟。不确定型番茄开始时长出一些叶子，然后在整个生长季节继续生长叶子和花。这些植株往往会在任何给定时间结出处于不同成熟阶段的番茄果实。半确定型番茄的表型介于确定型和不确定型之间，它们是典型的确定型品种，只是长得比确定型品种大。番茄育种的最新发展已经带来了更多样的果实颜色。除了标准的红熟色外，番茄还可以是乳白色、柠檬绿、粉红色、黄色、金色、橙色或紫色。

5、可以通过人工授粉生产杂交商业番茄种子。收获雄性亲本的花粉，并手动施加到雌性近交系的柱头表面。在人工授粉之前和之后，将花覆盖，这样昆虫就不会带来外来花粉，产生混合物或杂质。将花朵贴上标签，以识别将从中收获种子的授粉的果实。

6、多种病原体影响番茄植株的生产率，包括病毒、真菌、细菌、线虫和昆虫。番茄特别容易感染许多病毒，因此抗病毒性在农业上具有重要意义。

7、烟草花叶病毒(tobamoviruses)是最重要的植物病毒之一，对农业造成严重损害，尤其是对世界各地的蔬菜和观赏作物。烟草花叶病毒很容易通过机械方式传播，也很容易通过种子传播。烟草花叶病毒的一般特征是约300nm的杆状颗粒，其包裹编码四种蛋白质的单链阳性rna基因组。在番茄中，烟草花叶病毒(tmv)和番茄花叶病毒(tomv)受到全世界种植者的担忧，因为它们会例如通过不规则成熟(果实表面有淡黄色斑点，表面以下有褐色斑点)，严重损害作物生产。然而，多年来，植物育种家已经鉴定了几种基因，并且现在有了tmv和/或tomv抗性番茄品种。

8、另一种烟草花叶病毒，即番茄斑驳花叶病毒(tommv)，最近被描述感染全球数个国家的番茄植株，降低了番茄生产的年产量和质量。

9、烟草花叶病毒属于α类超群病毒。它们具有一个蛋白质棒，由外壳蛋白(cp)的拷贝组成，包裹着线性rna(+)基因组。植物细胞感染后，rna基因组脱壳并转录，产生rna依赖性rna聚合酶(rdrp)、运动蛋白(mp)和外壳蛋白(cp)。邻近细胞的感染以及病毒的长距离运输都依赖于运动蛋白(mp)。

10、对烟草花叶病毒等病原体的抗性需要抗性(r)基因的存在，其多肽产物r蛋白可识别烟草花叶病毒的产物，随后能够触发防御应答，通常是超敏反应。

11、在过去的几十年里，所有现代的不确定型番茄品种和许多确定型番茄品种确实含有tm-2基因，或者优选该基因的tm-22(又称为tm-2-2)等位基因，作为抗性基因。这些自秘鲁番茄(s.peruvianum)渗入的基因确实使其对2014年之前影响商业番茄的几乎所有已知的烟草花叶病毒种(tomv和tmv)具有免疫力。抗性基因tm-2-2似乎也主要赋予对tommv的抗性(nagai等人，2019年；sui等人，2017年)。

12、tm-2(seq id no:2)和tm-2-2(seq id no:3)抗性基因被认为是等位基因并且共享tomv的运动蛋白(mp)作为匹配的无毒(avr)蛋白。tm-2和tm-2-2蛋白(分别为seq id no:7和seq id no:8)具有核苷酸结合位点/富含亮氨酸重复序列的r蛋白(nbs-lrr蛋白，又称为nlr蛋白)的特征，并且与由从易感番茄(l.esculentum)品系分离的tm-2等位基因(seqid no:1)编码的多肽(seq id no:6)显著不同(lanfermeijer等人，2003年)。tm-2和tm-2-2介导的抗性需要这些nlr蛋白识别烟草花叶病毒运动蛋白(mp)(calder和palukaitis，1992年；meshi等人，1989年；weber和pfitzner，1998年；weber等人，1993年)。

13、tm2和tm-2基因产物之间的差异集中在富含亮氨酸重复序列(lrr)结构域，以及tm-2和tm-2-2基因之间的差异(lanfermeijer等人，2005年)。

14、2014-2015年期间，病毒的严重爆发影响了中东(例如约旦和以色列)的番茄产区。大多数受影响的番茄品种被认为是抗tmv和/或tomv的，但仍然受到严重影响，并表现出典型的tmv/tomv样症状：虽然叶面症状与tmv/tomv症状非常相似，但果实症状比此类病毒引起的常见症状更加频繁和严重，出现果实损伤和畸形。果实质量很差，相当滞销。salem等人，2015年对这种新型烟草花叶病毒种进行了测序，并提出将这种约旦病毒命名为：番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus)(先前称为tbrfv，现在称为tobrfv)。与其他烟草花叶病毒序列的比较表明，它确实是一种烟草花叶病毒，但不是tmv或tomv。对tmv和/或tomv的抗性并不赋予对这种新型病毒tobrfv的抗性；即包含tm-2或tm-2-2抗性基因的植株仍然易感tobrfv。

15、luria等人，2017年同时分离并测序了感染以色列番茄的以色列烟草花叶病毒的完整基因组，他们显示出以色列和约旦病毒之间具有非常高的序列同一性(超过99％的序列同一性)，并得出了番茄褐色皱纹果病毒的两个不同的分离株。

16、最近，该病毒在欧洲，特别是在西西里岛、德国、荷兰和法国以及墨西哥被发现，因此现在它被认为是对番茄作物的主要全球威胁。因此，鉴定针对这种新型烟草花叶病毒的抗性基因对于番茄育种家而言变得重要且紧迫。

17、最近在wo2018/219941中描述了对tobrfv表现出抗性的番茄植株的鉴定，以及导致对番茄褐色皱纹果病毒抗性的遗传定子(以下也称为qtl(数量性状基因座))的定位和鉴定。分别位于6号和9号染色体上的两个qtl，即qtl1和qtl2，当纯合地存在于番茄(s.lycopersicum)背景中时，可独立地或组合地赋予感染或可能感染tobrfv的番茄植株的果实改善的耐受性或抗性。第三个qtl，qtl3，位于11号染色体上，当纯合地存在时，可赋予感染或可能感染tobrfv的番茄植株的叶片改善的耐受性或抗性。

18、尽管这些qtl，无论是单独还是组合，均提供了对tobrfv的耐受性或抗性，但这种耐受性/抗性似乎是定量的和多基因的，植株并非没有病毒。此外，这些qtl被描述为当纯合地存在时提供抗性。由于9号染色体上的qtl2与tm-2-2基因存在于同一基因座，在通常“整体”传播而不重组的区域中，因此9号染色体上的这种qtl可能难以与商业可供植株所必需的tm-2-2基因结合。

19、wo2020/148021最近描述了8号染色体上的抗性基因，其赋予对tobrfv的抗性；该基因编码nbs-lrr蛋白(核苷酸结合位点/富含亮氨酸重复序列)。因此，该文件中公开的抗性基因与tm-2-2抗性基因结合，以同时提供对tobrfv、tmv和tomv的抗性。

20、由于烟草花叶病毒颗粒非常稳定且具有高度传染性，因此其预防通常非常困难。因此，对抗烟草花叶病毒感染最有效的方法之一是引入遗传抗性基因。因此，迫切需要同时鉴定针对数种烟草花叶病毒(包括这种新型烟草花叶病毒tobrfv)的改良抗性基因，否则将导致整个地区无法再生产番茄作物。

21、植物nlr蛋白已被广泛综述。(baggs等人，2017年；kapos等人，2019年)。nlr是在识别“效应蛋白”后触发植株抗性应答的蛋白质。nlr根据其n末端结构域被分为两个主要的亚类。两个主要的亚类是蛋白质cnl和tnl，它们的n末端分别含有卷曲螺旋(c)或toll/白细胞介素1受体(tir)结构域。除n末端结构域之外，nlr还具有核苷酸结合(nb)结构域和富含亮氨酸重复序列(lrr)结构域。每个常见结构域(nb、lrr、cc和tir)都被认为在激活nlr蛋白中发挥作用(wang等人，2020年)。特别是lrr结构域通常与效应蛋白识别相关。因此，lrr结构域中的等位基因多样性通常与效应蛋白结合的特异性相关，并且lrr结构域多样性似乎处于阳性选择下(mondragon-palomino等人，2002年)lrr结构域也可以作为自抑制结构域，防止自动激活和下游信号传导。nb结构域结合atp，可以在活性或非活性形式之间切换。cc和tir结构域通常被认为参与信号传导。也有报告称，在两种nlr蛋白之间转移部分lrr结构域可以赋予nlr蛋白新的特异性(slootweg等人，2017年)。

22、在nlr蛋白tm2/tm-2-2的情况下，已经证明lrr结构域中的单个氨基酸(aa)变化导致扩展该蛋白识别的烟草花叶病毒运动蛋白(mp)的多样性(kobayashi等人，2011年)。

23、本发明人出乎意料地发现，与现有技术的教导相反，对tmv、tomv和tobrfv的抗性可以由单一抗性基因编码的单一抗性蛋白赋予，而不需要不同抗性基因和蛋白的组合。

24、他们还发现，通过修饰赋予tmv和tomv抗性的nlr蛋白的识别结构域，即lrr结构域，即通过修饰tm-2-2蛋白的lrr结构域，能够得到这种赋予tobrfv抗性的蛋白质。

技术实现思路

1、本发明涉及一种变体lrr结构域，其源自tm-2-2蛋白的lrr结构域，使得包含所述突变体lrr结构域的nbs-lrr蛋白识别和/或结合几种不同烟草花叶病毒的运动蛋白，包括至少tobrfv，并且优选地还包括tmv、tomv和/或tommv，最优选tmv、tomv和tommv。

2、本发明还涉及包含这种突变体lrr结构域的多肽，以及编码所述结构域和多肽的核苷酸序列。

3、本发明还涉及一种抗性基因，其编码tm-2-2蛋白(seq id no:8)的突变体或等位基因变体，赋予番茄对几种烟草花叶病毒的抗性，包括至少对tobrfv的抗性。

4、新发现的抗性蛋白或lrr结构域赋予对tobrfv的抗性，优选地除了对tomv和tmv的抗性之外，这归功于tm-2-2蛋白的lrr结构域中在位置822、825或848处的至少一种取代，即天冬酰胺(n)822被半胱氨酸(c)、苯丙氨酸(f)、甲硫氨酸(m)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)取代，丝氨酸(s)825被组氨酸(h)、赖氨酸(k)或苏氨酸(t)取代，半胱氨酸(c)848被精氨酸(r)取代，或这些取代的组合。

5、额外的取代，优选位置655处的苯丙氨酸(f)被亮氨酸(l)取代，可以提高位置848、822和/或825处的取代、特别是位置848处的取代所赋予的抗性。

6、本发明还提供了植株、特别是对tobrfv表现出抗性的番茄(s.lycopersicum)植株，包括商业植株、品系和杂交种，以及生产或鉴定植株、特别是对tobrfv表现出抗性的番茄(s.lycopersicum)植株或种群(种质)的方法。本发明还公开了与新发现的抗性基因相关的分子遗传标记。还提供了通过此类分子标记的方法和用途获得的植株。

7、本发明还提供了几种方法，包括用于鉴定tobrfv抗性植株的方法、用于在受到包括tobrfv的不同烟草花叶病毒侵染的环境中提高番茄产量的方法、用于保护番茄田免受包括tobrfv的烟草花叶病毒侵染的方法以及用于鉴定、检测和/或选择赋予至少对tobrfv的抗性的tm-2-2或tm-2基因的突变体的方法。

8、定义：

9、术语“抗性”由isf(国际种子联合会(international seed federation))蔬菜和观赏作物科定义，用于描述植物对害虫或病原体的反应，以及蔬菜种子行业的非生物胁迫。具体地，抗性是指在类似的环境条件和害虫或病原体压力下，与易感植物品种相比，植物品种限制特定害虫或病原体的生长发育和/或其造成的损害的能力。抗性品种在害虫或病原体的沉重压力下可能会表现出一些疾病症状或损害。定义了两个水平的抗性：

10、高抗性：与易感植物相比，在正常害虫压力下高度限制特定害虫的生长和/或发育和/或其造成的损害的植物。然而，这些植物在沉重的害虫压力下可能会表现出一些症状或损害。

11、中等抗性：与高抗性植物相比，高度限制特定害虫的生长和/或发育和/或其造成的损害，但可能表现出更大范围的症状或损害的植物。当在类似的环境条件和/或害虫压力下生长时，中等抗性植物仍将表现出比易感植物更轻的症状或损害。

12、术语“耐受性”通常用于描述植物忍受非生物胁迫而不会对生长、外观和产量造成严重后果的能力。

13、然而，在文献和专利中，该术语也用于指示植物的表型，其中至少一些疾病症状在所述植物暴露于感染剂量的病毒时仍然不存在，由此，至少在一些培养条件下，可以确定存在系统或局部感染、病毒增殖、至少在所述植物的细胞中存在病毒基因组序列和/或其基因组整合。因此，耐受性植物对症状表现具有抵抗力，但对病毒的无症状携带者不具有抵抗力。有时，病毒序列可能存在于植物中，甚至在植物中增殖，而不引起疾病症状。应当理解，耐受性植物虽然受到病毒感染，但通常能够至少适度地限制病毒的生长和发展。因此，根据这一定义，耐受性植物最好以中等抗性植物为特征。

14、tobrfv感染的叶片上的症状通常包括花叶(mosaic)、小叶扭曲，在许多情况下还包括条斑状症状。tobrfv感染的果实上的症状通常包括典型的黄色病变(变色)和果实畸形。在许多情况下，果实上也有“巧克力斑点”。

15、易感性:植物无法限制特定害虫或病原体的生长发育；易感植物表现出与病毒感染相关的有害症状，即在tobrfv感染的情况下叶面损伤和果实损伤。

16、一种易感番茄褐色皱纹果病毒的番茄(s.lycopersicum)植株，例如是2015年salem等人出版物中提到的市售品种candela。

17、如本文所用，术语“后代(offspring)”或者“子代(progeny)”是指从一株或多株亲本植株或其后代的无性繁殖或有性繁殖中产生的作为子代的任何植株。例如，后代植株可以通过亲本植株的克隆或自交或者通过杂交两个亲本植株获得，并且包括自交以及f1或f2或更远的世代。f1是由亲本产生的第一代后代，亲本中的至少一个首次用作性状的供体，而第二代(f2)或后续世代(f3、f4等)的后代是由f1、f2等的自交产生的标本。因此，f1可能是(并且通常是)由两个真实遗传亲本之间的杂交产生的杂交种(真实遗传亲本是性状的纯合子)，而f2可能是(并且通常是)所述f1杂交种的自花授粉产生的后代。

18、如本文所用，术语“杂交(cross)”、“杂交(crossing)”、“异花授粉(crosspollination)”或“杂交育种(cross-breeding)”是指将一株植物上一朵花的花粉(人工或自然地)施加到另一株植物上一朵花的胚珠(柱头)上的过程。

19、如本文所用，术语“基因型”是指单个细胞、细胞培养物、组织、生物体(例如植物)或生物体群的基因构成。

20、如本文所用，术语“嫁接”是将接穗嫁接到砧木的操作。嫁接的主要动机是避免在没有遗传或化学方法进行疾病管理时受到土生害虫和病原体的损害。将易感接穗嫁接到抗性砧木上可以提供抗性栽培品种，而无需将抗性培育到栽培品种中。此外，嫁接可以增强对非生物胁迫的耐受性，提高产量并使水和养分得到更有效的利用。

21、如本文所用，术语“杂合子”是指至少在一个基因座上具有不同等位基因(特定基因、遗传定子或序列的形式)的二倍体或多倍体单个细胞或植株。

22、如本文所用，术语“杂合的”是指在特定基因座上存在不同的等位基因(给定基因、遗传定子或序列的形式)。

23、如本文所用，术语“纯合子”是指在所有同源染色体上的一个或多个基因座上具有相同等位基因的单个细胞或植株。

24、如本文所用，术语“纯合的”是指在同源染色体片段中的一个或多个基因座上存在相同的等位基因。

25、如本文所用，术语“杂交种”是指由一种或多种基因不同的亲本之间的杂交产生的任何单个细胞、组织或植株。

26、如本文所用，术语“基因座(locus)”(复数：“基因座(loci)”)是指任何已在遗传学上定义的位点，这可以是单个位置(核苷酸)或染色体区域。基因座可以是基因、遗传定子、基因的一部分或dna序列，并且可以被不同的序列占据。基因座也可以由一个snp(单核苷酸多态性)、几个snp或两个侧翼snp来定义。

27、如本文所用，术语“砧木(rootstock)”是指在嫁接过程中能够接收接穗的植株的下部。

28、如本文所用，术语“接穗”是指在嫁接过程中能够被嫁接到砧木上的植株的较高部分。

29、本发明涵盖不同倍性水平的植株，基本上是二倍体植株，但也涵盖三倍体植株、四倍体植株等。