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球孢白僵菌侵染昆虫和附着胞形成时期受BbMPK1 MAPK调控的下游基因分离

花匠小妙招
2024-11-10 21:24

【摘要】： 昆虫病原真菌是自然界控制害虫的重要因素之一,应用其控制农林及卫生害虫受到人们的广泛关注。然而,有关昆虫病原真菌的基础研究相对薄弱,尤其是对侵染致病的分子机理了解甚少,在一定程度上制约了应用真菌制剂控制害虫的潜力。因此,加强对昆虫病原真菌侵染致病的分子机理研究,对促进真菌杀虫剂的广泛利用,十分必要。MAPK是一类普遍存在于真核生物中相当保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,主要涉及细胞的信号传导。近年来发现MAPK信号途径与一些真菌的发育分化、侵染致病以及逆境适应性调节等密切相关,是人们认识真菌相关生物学过程发生机理的重要线索。课题组在前期研究中,从重要的昆虫病原真菌球孢白僵菌中分离了与酵母Fus3/Kss1同源的MAPK基因BbMPK1。破坏BbMPK1基因导致菌株侵染性完全丧失,不能形成附着胞。因此,该突变体为研究球孢白僵菌侵染昆虫和附着胞形成的分子机理提供了理想的研究材料。基于此,本论文以球孢白僵菌BbMPK1突变体为材料,利用SSH技术分别构建球孢白僵菌侵染时期和附着胞形成阶段受BbMPK1 MAPK调控的下游基因表达文库,筛选病原菌侵染及附着胞形成时期的差异表达基囚,为阐明BbMPK1 MAPK信号途径调节病原菌侵染致病的分子机理奠定基础。1.球孢白僵菌侵染时期受BbMPK1调控的下游基因分离以菜粉蝶3龄幼虫为试虫,接种野生菌株Bb0062至昆虫出现明显感染症状(36h,昆虫体壁明显黑化),剥取被真菌侵染的昆虫体壁提取RNA,合成cDNA后作为试验方(Tester),以接种BbMPK1突变体相同时期的昆虫体壁提取RNA后合成的cDNA为驱动方(Driver)进行减法杂交,构建差异表达基因文库,进行差异表达基因筛选和测序分析。利用PCR-Select Differential Screening试剂盒法筛选获得40个差异克隆,测序分析结果表明,40个克隆编码13个基因。经与NCBI站点上的非冗余蛋白库(non-redundant protein database,nr库)比对发现,13个差异基因编码蛋白均与真菌蛋白无关,而大部分与昆虫蛋白相关。其中4个克隆编码蛋白分别与昆虫免疫相关蛋白丝氨酸蛋白酶抑制剂1(serpin 1)、凝集素4(lectin4)、抗菌肽(lebocin 4)和化学感受蛋白(chemosensory protein CSP2)高度同源;5个克隆编码蛋白分别与不同的昆虫体壁蛋白包括2种家蚕体壁蛋白cuticle protein和cuticle protein 3和3种柑橘凤蝶体壁蛋白cuticular protein CPR67、cuticular protein CPR103和cuticular proteinCPFL4B同源;其它3个克隆编码蛋白分别与仙人掌蛾嗅觉蛋白(olfactory protein)、烟草细胞色素蛋白(cytochrome P450 like TBP)和豌豆衰老相关蛋白(senescence-associated protein)同源,还有1个克隆编码蛋白与昆虫一个未知功能蛋白同源。由此表明,用该方法筛选的差异表达基因可能与球孢白僵菌诱导昆虫产生免疫反应表达的相关基因。2.球孢白僵菌附着胞形成时期受BbMPK1调控的下游基因的筛选鉴于球孢白僵菌BbMPK1基因敲除突变体不能形成附着胞,本研究以蝉后翅为诱导物诱导球孢白僵菌野生型产生附着胞,提取RNA后合成的cDNA为试验方(Tester),以相同条件下培养提取的BbMPK1基因敲除突变体的RNA合成的cDNA为驱动方(Driver)进行减法杂交,构建表达差异文库,克隆到pGEM-T载体上,进行差异表达基因筛选和测序分析。利用PCR-Select Differential Screening试剂盒法从1047个克隆筛选得到195个表达差异明显的克隆进行测序分析。经与NCBI站点上的非冗余蛋白库(non-redundant protein database,nr库)比对分析发现195个克隆编码75个蛋白,其中13个克隆与真菌的疏水蛋白、疏水蛋白3前体、线粒体蛋白、翻译延伸因子、醛脱氢酶、铜-锌超氧化物歧化酶、外皮蛋白、非组蛋白染色体蛋白6、染色质装配因子、蔗糖转运子、ADP核糖基化因子、组蛋白3和RNA解旋酶具有较高相似性,其中疏水蛋白与已报道的稻瘟菌的一个毒力基因MPG1表达的蛋白同源;26个克隆与一些模式真菌如稻瘟菌、核盘菌、球毛壳菌、黑曲霉、粗糙链孢霉、小麦叶枯病菌、玉米赤霉、土曲霉、灰霉菌等的假定蛋白具有一定的相似性;22个克隆与一些细菌、原虫和动植物的已知蛋白和假定蛋白具有相似性;另外还有14个克隆在NCBI站点未发现同源序列。

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009

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