对环境无害的植物保护剂.pdf
本发明涉及组合物， 其用于治疗和预防植物中的疾病。 特别地， 本发明涉及使用包 含草本植物制剂的组合物治疗和预防植物疾病， 所述植物疾病是由土壤带有的害虫比如线 虫、 真菌和昆虫引起的。 所述组合物包含对环境有害影响最小的有效植物衍生抗线虫、 抗真 菌和抗昆虫试剂。
土壤带有的害虫可以引起相当可观的作物伤害和经济损失。 这在集约农业中特别 是真实的， 其中在集约农业中农作物每年被栽种在同一地方， 使得害虫种群在土壤中聚集。 土壤带有的害虫包括线虫、 真菌、 细菌、 病毒和昆虫。
植物寄生线虫是小蠕虫形状的无脊椎动物， 长度范围是 0.5-10 毫米。线虫 ( 来 源于希腊语单词线 (thread)) 是活跃的、 灵活的、 细长形的生物体， 其生存于潮湿的表面 上或者在液体环境中， 包括土壤中的水薄膜和其它生物体中的潮湿组织。虽然仅 20000 线 虫物种已经被鉴定， 但据估计实际存在 40000 到一千万个。有些线虫物种已经演变成十 分成功的植物和动物两者的寄生虫， 并且造成重要的农业和家畜经济损失， 以及造成人类 的罹病率和死亡率 (Whitehead， 1998)。他们影响全世界的农业用地并且是热带、 亚热带 和气候温和的农业的最有破坏性的害虫的一些。他们可以引起农作物严重的收得率损失 比如柠檬、 马铃薯、 香蕉、 水稻、 菠萝、 咖啡、 花生、 甘蔗和烟草。线虫通过直接固着内寄生 虫， 其包括根结线虫 ( 根结线虫属 (Meloidogyne) 和孢囊线虫 (Globodera 和异皮线虫属 (Heterodera))， 会诱导进食中心并在根内建立长期感染， 这常常对农作物是十分有破坏性 的 (Whitehead， 同前 )。传播病毒和促进细菌和真菌传染而损害庄稼。
植物的线虫寄生虫可以存在于植物的全部部分包括根、 发育中的花蕾、 叶和干。 植 物寄生虫是根据他们的食性被分类为若干大类 ： 迁移性外寄生物、 迁移性体内寄生虫和固 着内寄生虫。固着内寄生虫， 其包括根结线虫 ( 根结线虫属 (Meloidogyne) 和孢囊线虫 (Globodera 和异皮线虫属 (Heterodera))， 会诱导进食中心并在根内建立长期感染， 这常 常对农作物是十分有破坏性的 (Whitehead， 同前 )。
因为线虫常常没有提供明确的症状， 因此他们的经济效应趋向被培育者低估， 然 而估计世界农业的年损是 US $1000 亿 (Sasser 和 Freckman， 1987)。 这基于全部主要农作物 估计平均 12％的年损。 例如， 据估计线虫引起全世界每年的大豆损失为大约 $32 亿 (Barker 等人， 1994)。若干因素使得对安全和有效线虫控制成为急迫的。持续的人口增长、 饥荒和 环境退化已经增强了对农业可持续性的关心， 并且新的政府规章可能阻止或者严厉限制许 多可利用的农业驱肠虫药的使用。线虫是发展中以及发达国家农业中的重要的问题。
最有经济破坏性的植物寄生的线虫属属于垫刃目 (Tylenchida) 的 Heterderidae 科， 并且包括孢囊线虫 ( 异皮线虫属和 Globodera) 以及根节线虫 ( 根结线虫属 )。大豆异 皮线虫 (H.glycines) 以及马铃薯孢囊线虫 (G.pallida 以及 G.rostochiensis) 是重要的 实例。根节线虫感染数以千计不同的植物种包括蔬菜、 果实以及穷国的行栽作物。
有非常少的化学制品可以用来控制线虫 (Becker， 1999)。然而， 化学杀线虫药 的申请仍然是线虫控制的主要手段。一般， 化学杀线虫药是高毒性的化合物， 其已知会导 致相当可观的环境损害并且在其能被使用的数量和场所方面被越来越受到限制。例如，
土壤消毒剂溴甲烷， 其已经有效用于减少各种专业农作物中的线虫侵扰， 其是根据 the U.N.Montreal Protocol 管理的作为臭氧清除物质， 并且计划在 2005 年在美国被除去 (Carter 等人， 2005)。 预期草莓及其他商品作物工业被显著影响， 如果不发现溴甲烷的合适 替换物的话。类似的， 宽谱杀线虫药例如 (1， 2- 二氯丙烯的各种配方 ) 在它们的 应用方面由显著的限制， 由于毒性的考虑 (Carter 等人， 2005)。
为了杀死土壤中的线虫， 大多数杀线虫药在低水平是毒性的， 并且是可溶于水的， 以便移动到线虫所位于的位置。在过去 25 年间， 过去使用的许多有效的杀线虫药已经从市 场上撤出， 因为环境和健康的原因， 目前只保存了少量。在使用任何杀线虫药时， 产品标签 必须要牢固粘附， 以便使得人类和环境健康影响最小化， 并且避免不利因素。表 1 是一系列 标记用于高尔夫球场草地的杀线虫药 (Crow， 2005)， 并且描述了对于这些产品由于它们的 环境毒性而造成的使用限制。
表 1. 在弗罗里达用于高尔夫球场草地的杀线虫药 (Crow， 2005)。
表 1 中的数据不是产品标签的替代。当施加任何的杀虫剂时， 应当永远遵循产品 标签上的指导。
以上所述产品全部具有″危险″标签。这是工业例如高尔夫球场工业中所考虑
的， 在这些工业中具有高度的清晰度和牵扯人。
在更宽的农业设施中， 目前的线虫控制策略常常在虫害综合治理体系中结合轮 作、 杀线虫药施加和抗性品种的使用。然而， 这些常规方法变得越来越不能令人满意。轮 作对于控制宽寄主范围的线虫是价值有限的， 并且对于专业培育者而言是不切实际。现 代的集约农业方法强烈的依赖于化学控制的使用， 但是如上述这正造成焦虑， 因为杀线 虫药在所有作物保护试剂当中是最毒性和对环境有破坏性的。许多杀线虫药已经被撤 回 [ 例 如，参 见 the Montreal Agreement ： (United NationsEnvironment Programme， Ozone Secretariat， Montreal Protocol-Celebrating 20 years of progress in 2007 ： http://ozone.unep.org/)and theuse of methyl bromide(United Nations Environment Programme， OzoneSecretariat ： http://ozone.unep.org/teap/Reports/MBTOC/index. shtml)]， 并且许多国家已经计划减少剩余化学制品的使用。
由于化学控制试剂选择的减少， 在减少由于植物寄生的线虫类的作物损失的战斗 中， 抗性植物变得越来越重要。已经成功地通过传统植物育种方法开发了若干作物的抗性 栽培变种， 然而， 因种种原因该方法具有有限的价值 (Roberts， 1992)。 关于抗性特异性的主 要问题 ( 通常局限于特定的线虫物种或甚至种类 ) 通常会在试图将抗性性状转移给商品植 物品种时遇到。 由于这些限制， 研究人员正在寻求应用现代分子生物学技术来提供有效和持久的 线虫控制形式。 转基因线虫抗性和天然抗性基因的克隆已经被研究 (Jung and Wyss， 1999 ； Cai 等人， 1997 ； Milligan 等人， 1998)， 这可以允许它们引入到相关的物种和 / 或优良的商 业作物株中， 同时新型的、 改造的转基因植物防御的设计可以提供可替换的有效和持久线 虫控制的形式。
在寻求可替换的抗线虫剂时， 进一步的研究途径是植物的研究， 例如草药， 表现出 高水平线虫抗性的物种， 以开发植物来源的抗线虫药。这些中最多被记载的包括万寿菊 (Tagetes spp.)， 猪屎豆 (Crotalariaspectabilis)， 菊花 (Chrysanthemum spp.)， 蓖麻籽 (Ricinus communis)， 楝树 (Azardiracta indica)， 以及菊科的许多成员 (compositae 科 ) (Hackney&Dickerson， 1975)。在菊科的情况中， 光动力学化合物 α- 三联噻吩已经显示负 责根部的强纱线冲活性。蓖麻籽是作为绿肥在设置种子作物之前耕种的。然而， 蓖麻植物 的显著缺点是种子含有毒性化合物， 例如蓖麻毒素， 其能够杀死人类、 宠物和家畜， 并且也 是高度引起过敏症的。然而， 在许多情况中， 植物杀线虫活性的有效成分还未被发现， 并且 难以从这些抗性植物产生商业上成功的杀线虫产品。
美国专利申请 no.20040127362 公开了丁香和丁香油， 其包括在最低风险杀害虫 剂的美国环境保护局的列表中。该申请涉及杀线虫药， 其包含一种或者更多种油的含水制 剂中， 其结合惰性成分例如糖蜜和 / 或乳酪。
某些居住于土壤中的真菌， 例如镰刀霉、 轮枝孢属和 Phytphthora 的物种供给植 物根部或者茎干的底部， 造成植物中的疾病和减少谷物产量。真菌疾病仍然是提高食品农 业产量的主要限制因素。真菌物种例如镰刀霉、 丝核菌、 腐霉属、 疫霉属等继续在许多国家 抑制开发努力， 并且每年造成数十亿美元的损失。 因此， 保护作物植物免于真菌病原体仍然 是农业科学家的主要关心的问题。
例如， 全世界葫芦科植物被土壤传播的真菌物种所感染， 例如腐霉属， 丝核菌属，
镰刀霉属， 和疫霉属。 由于许多原因， 大部分这些真菌存留于土壤中， 然后， 当出现适当的条 件例如高温和湿度时， 真菌将发育并且感染植物。 在温室中， 这特别是个问题， 在温室中， 典 型地发生 28-35℃的温度以及 60-75％的湿度。造成高频率黄瓜秧苗脱水的主要真菌是腐 霉属， 较少水平是丝核菌属。 这两种真菌能够造成在大约 10-15％黄瓜作物中秧苗萎缩。 另 一种真菌， 镰刀霉感染中季植物， 造成在更多成熟植物中的萎缩。
通常， 控制真菌疾病的措施通常包括将杀真菌剂液靶向至土壤中的病原体， 以减 少起始接种量。可商购获得的杀害虫剂包括 ： Rhizolex50WP， Vongared， Tichigaren 30L， Tatto C SC， Terlai 67％ WP， Rridomil 5G， Fungarid， Rhizolex， Ridomil， Tachigareen。 化学杀真菌剂仍然是抵抗真菌害虫的首道防御， 尽管关于它们的使用和滥用有很严重的环 境问题。
关于广泛使用这些化学制剂对环境和人类健康的残余影响有越来越多的焦虑。 一些化学制剂已经被报道会在以低至 30mg/kg 的剂量给药时会造成实验动物的出生缺陷 (Bulletin of EnvironmentalContamination Toxicology， 54 ： 363-369， 1995 ； http:// www.chem-tox.com/pesticides/)。被给予杀真菌剂 maneb 的小鼠表现出明显的帕金森病 的征兆， 这是一种进行性的并且难以治愈的脑部疾病 (Parkinson′ s Disease Linked to Pesticide Combination ： http://www.chem-tox.com/pesticides/)。基于这个原因， 并且 因为安全和环境问题， 许多合成的农业制剂已经或者正被考虑从市场上清除。 因此， 正在放 弃使用杀害虫剂来控制疾病的选择， 这就造成了需要发现可以替换的方法来控制真菌病原 体。 控制真菌疾病的一种可以替换的方法是通过开发新型的作物品种， 其具有增强的 对真菌疾病的抵抗， 并且在该领域的努力也在继续， 都是通过传统的植物育种和遗传工程 技术。然而无论是天然的还是基因工程获得的抗性都不能提供完全的解决方案， 在开发具 有改善性质的新型抗真菌剂方面一直有持续的兴趣。
一种研究途径是筛选植物来源产物的抗真菌活性。Bowers andLocke(2000 and 2004) 研究了植物提取物对土壤中的尖孢镰刀菌和烟草疫霉的作用， 以及在控制温室中镰 刀霉枯萎和疫霉属枯萎病的作用。它们报道与未经处理的受侵袭的土壤相比较， 胡椒 / 芥 菜、 桂树和丁香油提取物减少病原体数目和抑制发病。丁香油也已经被提议用于管理香蕉 的收获后真菌病 (Ranasinghe 等人 2002)。
某些昆虫也是重要害虫。以作物为食的昆虫导致收率减少。已经被昆虫进食损害 的植物可能更易于传染 ； 昆虫也可以作为植物病原体的媒介物例如细菌和病毒。因此保护 作物不受昆虫害虫包括鳞翅目和鞘翅目的影响是重要的农业研究目标。
白蚁是一组社会昆虫通常的分类为属于 Isoptera 目。白蚁大多数以死的植物材 料为食例如树木、 落叶层， 估计 4,000 物种的大约 10％是经济重要的， 因为害虫可以导致严 峻的农作物损失或者种植园林木或者对建筑物造成严重的结构破坏 ( 例如 Yamano， 2000 和 Mulrooney 等人， 2007)。尽管传统上已经将化学制品用于白蚁控制， 但广泛使用化学制 剂能够造成环境危险， 并且存在产生对这些化学制剂抗性的风险 (Zoberi， 1995)。此外， 在 越来越多的国家中 ( 在八十年代后期和九十年代 )， 这些杀害虫剂已经被禁止， 或者从市场 上被撤回， 基于人类健康和环境原因。在最近数年中， 联合国环境规划署 (UNEP) 和粮农组 织 (FAO) 致力于消除全球生产和使用某些永久性有机污染物 ( 包括某些有机氯杀害虫剂 )
(UNEP/FAO/Global IPM Facility 2000)， 这进一步加速了抛弃有害的化学制剂控制白蚁。
作为这些进展的结果， 白蚁控制中的焦点已经逐渐改变为替代的方法用于解决白 蚁问题。Lenz(2005) 综述了白蚁生物控制的选择， 并且发现了优先的生物活性以可持续 的白蚁控制 (Sosa-Gomez 等人 1996 ； Castrillo 等人， 2005 ； Lenz 2005 ； Yanagawa et al 2008)。 已经提议使用微生物病原体作为某些白蚁问题的解决方案， 但可能有助于解决其他 白蚁， 因为可利用的病原体可能对于某些物种是有效的， 而对其他物种则不太能如此 (Lenz 2005)。
对于控制植物害虫和疾病 ( 如由植物寄生线虫、 真菌植物病原体和昆虫害虫造成 的疾病 ) 的新型有效目标特异性对环境无害的的安全组合物以及方法有急迫的需求。
本发明的发明人研究了一些草本植物 ( 即用于调味和 / 或草药的植物 ) 抵抗线 虫、 真菌和植物的昆虫害虫的活性。
本发明源于发明人发现了在针对线虫、 真菌和昆虫植物害虫进行测试时， 某些草 本植物的简单、 基础制剂表现出显著的杀害虫效果。
茴芹 (Pimpinella anisum) 果实 ( 大茴香 ) 用于为烤制食品增加香味， 例如糕 饼、 饼干和糖果， 还有黑面包。还可以以与茴香几乎相同的方式为鱼、 家禽肉、 汤和植物菜 肴增香。许多酒精饮料和补品可以用大茴香进行增香， 例如法国 pastis， 希腊 ouzo， 土耳 其 raki， 阿拉伯 arrak 等。大茴香很久以来就知道其具有驱风性能。在一部分欧洲、 中东 和印度， 饭后咀嚼它以辅助消化和令口气清新。一些用水摄取的种子被推荐用于打嗝。它 是一种温和的除痰剂， 常常用于混合物和锭剂中用于治疗干咳。 杀菌、 镇痉和安眠效果归于 草本植物 ： 它被用于减轻牙痛和作为失眠的治疗。茴芹种子的提取物被报道具有抗氧化剂 能力 (Ilhami 等人 2003)。它的精油被用于治疗虱子和疥癣并且与其它的成分混合抵抗昆 虫。它的经由用于治疗虱子和疥疮， 并与其他成分混合抵抗昆虫。该精油被报道具有抗真 菌 (Shukla and Tripathi 1987) 和抗病毒 (Shukla 等人 1989) 活性， 暗示其在治疗感冒和 流感中的用途。大茴香油的主要成分是茴香脑， 一种前体， 其能够最终产生 2， 5- 二甲氧基 苯甲醛， 用于秘密合成迷幻剂药物 (Waumans 等人 2004)。
骆驼蓬 (Peganum harmala L.)( 叙利亚芸香 ) 是野生的开花植物， 其属于蒺藜 科， 并且大量发现于中东和北非。从古代开始， 其就被宣称为重要的医疗植物。骆驼蓬的 棕色三角锥形种子已知具有体温过低和引起幻觉的性能 (Lamchouri 等人， 1999 ； Kuhn and Winston 2000)。 传统上， 其已经在中东和北非用作调经剂和堕胎剂 (Fleming)。 文献中有许 多报道表明骆驼蓬的多种药理活性 (Abdel-Fattah 等人， 1997)。 还已知其与 α2- 肾上腺素 能受体亚型相互作用 (Saleem 等人， 2001)， 并且具有幻觉能力和能有效治疗皮肤病 (Saad and Rifaie 1980)， 低温过低 (Abdel-Fattah 等人， 1995) 和癌症 (Adams 1983)， 并且具有 抗梦游活性 (Monsef 等人， 2004)。这些种子用于从身体除去湿气和热量， 作为纯化药物， 作 为壮阳药， 也被认为是调经剂， 利尿剂和催吐剂。种子和叶子的果汁也用于各种处方中， 包 括治疗精神错乱和癫痫， 秃头和痔疮 (Lebling 2002)。
肉豆蔻是常绿树的属， 是热带东南亚和大洋洲固有的。 它们对于来源于成果、 肉桂 和肉豆蔻的两种香料是重要的。肉桂是果实内部的种籽仁， 肉豆蔻是籽仁上周边的覆盖物 ( 夹膜 )。 在亚洲、 中东和欧洲烹饪中， 粉末或者磨碎的肉桂被频繁用于开口菜和甜点中。 精 油用作烘焙物品、 糖浆 ( 例如可口可乐 )、 饮料、 糖果等等中的天然食物调味品。 肉桂具有芳香、 兴奋的、 麻醉剂、 驱风剂、 收敛剂的、 壮阳剂、 降低血脂的、 抗血栓形成的、 抗血小板凝聚、 抗真菌、 抗痢药、 抗炎症性的活性 Nadkarni 1988)。它用作胃痛、 风湿病和怀孕期呕吐的治 疗剂 (Nadkarni 1988)， 并且是重要的天然抗氧化剂源 (Juki 等人 2006)。通过研磨肉桂的 蒸汽蒸馏获得的精油也用于化妆品和制药工业例如牙膏并且作为有些咳嗽糖浆的主要成 分。传统的医用肉桂和肉豆蔻油用于与神经紧张的和消化系统有关系的疾病。肉豆蔻醚和 榄香精被认为是担负肉豆蔻油敏锐的致幻觉性能的化学组分。油的其它已知化学成分是 α- 蒎烯、 桧萜、 γ- 萜品烯和黄樟素。
丁 香 ( 同 义 词 Eugenia aromaticum ，Eugenia caryophyllata ， Eugeniacaryophyllus 或者 Caryophyllus aromaticus) 是一种热带树木， 当干燥时， 它的 不成熟的、 未开口的花芽提供被称为丁香的香料。丁香是一种在北非和中东烹饪中流行的 香料， 其被完整的或者研磨后使用， 也用于欧洲菜肴， 都是开口的和甜味的。丁香含有 15 到％精油， 其大部分是丁子香酚， 主要的提供香味的挥发油， 其是十分强的杀菌剂。丁香油 是一种强的刺激剂和驱风剂并且被用于治疗恶心、 消化障碍和消化不良。它被用于治疗牙 痛。它已经被提出治疗风湿病、 关节炎和口疮以及作为驱蚊剂。丁香油是高度地刺激的， 除 非充分地烯释。
Rhazya stricta 是常青小灌木和传统的草药， 曾经考虑有效治疗性病。在管中抽 干燥叶片的烟， 有时与其它的叶片种类混合以治疗梅毒。现在， 草本植物仍有时被抽烟， 但 是作为风湿病的治疗。植物被认为是有些毒性并且被家畜避免， 尽管它不被认为是严重的 威胁。小量地使用草本植物以减轻肚子痛 (Lebling 2002)。Rhazya stricta 的根、 叶片和 枝传统上被用于牙病、 糖尿病、 便秘和肠道病 (Ahmad 等人 2006)。Rhazya stricta 富含被 认为具有抗癌性能的生物碱 (Gilani 等人 2006)。应该注意俗名 “harmal” 被用于 Rhazya stricta(Apocynaceae 科 ) 和骆驼蓬蒺藜科 )。
在这里公开的发明人的工作显示茴芹， 骆驼蓬， 肉豆蔻， 丁香和 R.stricta 的制剂 都独立地显示出有效的杀昆虫活性。此外， 发明人已经观察到两种或更多种草本植物组合 的协同作用。例如， 茴芹和肉豆蔻独立地有效抵抗线虫， 但但茴芹， 骆驼蓬和肉豆蔻的组合 在杀线虫活性中给出了协同增加， 提供了特别有效的杀线虫活性， 抵抗所有阶段的根结线 虫， 特别是卵团 ( 实施例 3)。
因此， 本发明提供了包含选自茴芹， 骆驼蓬， 肉豆蔻 (Myristicafragrans)， 丁香 (Syzygium aromaticum) 和 Rhazya stricta 的两种或更多种植物的组合物在治疗或预防植 物中疾病的用途。在本文中 “疾病” 包括由植物病原体例如线虫和真菌所引起的感染， 以及 由于诸如昆虫的害虫的感染所造成的影响。
根据本发明的草本植物制剂表现出 “杀线虫” 或 “抗线虫” 活性。这些术语在本文 中可以互换使用， 并且不仅包括实际杀死线虫， 还包括使其正常生长和发育停止或延迟， 以 便宿主植物更能够存活或者忍受线虫感染。
本发明的草本植物制剂还显示了抗真菌活性。术语 “杀真菌” 和
“抗真菌” 关于真菌和真菌感染具有等同的含义， 如同关于线虫的术语 “杀线虫” 和 “抗线虫” 。
本文所使用的术语 “杀害虫” 是指杀死植物害虫、 使植物害虫的生长停止或延迟的 性能， 包括但不限于造成疾病的病原体例如线虫和真菌和害虫例如昆虫， 他们会通过以植物为食而负面影响植物健康。
优选， 本发明的杀害虫组合物包括选自茴芹、 骆驼蓬、 肉豆蔻、 丁香和 Rhazya stricta 的三种或更多种植物的制剂或提取物， 更优选选自前述组的四种或更多种或所有 5 种植物。
优选的组合物包括茴芹或肉豆蔻的制剂或提取物， 因为这些草本植物的制剂已经 发现针对线虫特别有效。 更优选， 该组合物进一步包括各种茴芹， 骆驼蓬和肉豆蔻的制剂或 提取物， 因为该组合显示出协同作用， 提供了针对根结线虫包括卵团的所有阶段的有效杀 线虫活性。
已经发现包含各种茴芹， 骆驼蓬， 肉豆蔻， 和丁香的制剂或提取物的组合物具有宽 谱杀害虫活性， 包括针对土壤线虫和真菌以及针对昆虫的活性。
因为本发明的杀害虫制剂是植物来源的， 所述植物是已经被人们消费的草本植 物， 所以不会有使用所述制剂作为杀害虫剂对于人们或者环境的毒性风险 ( 植物保护剂 )。
便利地， 制剂是粉末状干燥的植物材料例如干种子或壳， 或者其果实或部分 ( 例 如假种皮 )， 或芽， 或花， 其已经被磨成粉末。适当的和容易利用的干草本植物材料包括 ： 茴 芹的种子 ( 大茴香 “种子” 或大茴香 )， 骆驼蓬的种子， 肉豆蔻 的种子 ( 肉豆蔻籽 ) 或假种 皮 ( 豆蔻香料 )， 丁香 ( 丁香 ) 的干花芽 ( 有时称为豆荚 )， 和 Rhazia stricta 的种子。前 述的物质是容易获得的， 因为它们在厨房中可以用作香料。将植物材料磨成粉末以更容易 分配制剂和促进杀线虫剂的扩散。 上述的植物部分已经由发明人鉴定作为具有深刻的杀虫效果， 然而其它的植物部 分可能用于本发明的植物保护组合物。所观察到的杀线虫、 杀真菌和杀虫效应是由各自的 植物制造的一种或更多种活化剂引起。除了上面具体描述的， 这些活化剂可能发现在其它 的植物部分中。 任何的含有活化剂的植物部分都是用于制备根据本发明的杀虫剂组合物的 候选材料。 含有活性剂的职务部分可以根据经验确定， 通过测定害虫杀死或抑制活性， 在诸 如本文所描述的测试中。 或者， 一旦活性剂已经被鉴定， 则活性分子在植物不同的组织或器 官中的浓度可以被直接测定。为了实施的目的， 优选的植物部分是以相对大量汇集活性成 分的那些部分。理想地， 所述植物部分相对容易收获和处理， 例如种子或果实。然而， 其他 部分例如叶、 根、 茎或花或其部分可以是合适的， 只要活性剂以充分的量存在获得期望的杀 线虫效果。
另外， 可以相信在这里描述的植物杀害虫性能可以被开发以保护作物免于疾病例 如线虫或者真菌感染或者昆虫侵扰， 通过将草本植物与作物共同培育作为生物虫害防治的 形式， 即在农作物附近或者之内种植草本植物以制止害虫。
本发明进一步提供了用于治疗或者预防织物中疾病的方法， 其包括为所述植物施 用组合物， 所述组合物包括选自茴芹、 骆驼蓬、 肉豆蔻、 丁香和 Rhazya stricta 的两种或者 更多种织物的制剂或提取物。
在如下所述线虫试验体系中， 干燥的草本植物 ( 花蕾、 种子， 果实等等 ) 被研磨或 者磨细至粉末， 将其与匀化的线虫感染根在水中的悬浮液混合。 因此， 抗线虫组合物被施加 至线虫感染组织作为水溶液 / 悬浮液 ( 溶液是对于水溶性草本植物制剂组分 ； 悬浮液是对 于不溶于水的组分 )。为了实际应用以在野外或者温室的农作物中治疗或者预防疾病 ( 例 如线虫或者真菌感染或者昆虫侵扰造成的 )， 制剂可以类似地被用于野外 ( 在播种或者栽
种之前 ) 或者农作物 ( 在播种或者栽种之后 ) 作为水溶液 / 悬浮液通过喷射或者用水。如 果制剂的悬浮颗粒引起喷射或者用水设备的堵塞， 则制剂可以在施加前被过滤， 尽管首先 对于试验必要的是除去不溶解部分不会破坏组合物的效力。可选地， 制剂可以被用于野外 或者农作物作为干燥粉末并且随后加水。粉末可以形成颗粒、 小球或者团块便于操作和施 加。对于盆培育植物， 干燥粉末可以与土壤、 堆肥或者其它的种植介质在使用前混合。在一 种水耕法体系中， 粉末可以与含水营养培养基混合。植物盆， 尤其是可降解的盆例如由泥 炭或者纤维制造的那些允许植物在外栽种而不会干扰根， 可以被浸渍杀虫害剂 ( 例如抗线 虫， 抗真菌或者杀昆虫剂 ) 组合物。种子可以被方便地处理， 例如粉末化或者喷射杀害虫剂 组合物， 在存储或者栽种前以预防感染萌芽种子。农作物甚至可以被保护免于在收获之后 感染， 通过使用浸渍杀害虫剂组合物的容器用于存储和转运。类似地， 蔬菜 ( 即植物 ) 粮食 可以被保护免于储藏 / 转运他们在容器或者包装材料中被破坏， 其中所述容器或者包装材 料被浸渍杀害虫剂组合物。
因此本发明进一步提供 ：
涂覆或者浸渍根据本发明组合物的种子 ；
植物生长培养基例如土壤、 泥炭或者水耕法营养液， 或者可降解的容器例如塞子 或者盆， 包含根据本发明的组合物 ； 容器或者包装材料例如箱、 纸板箱或者薄膜用于蔬菜粮食， 其被涂覆或者浸渍根 据本发明组合物。
本发明更进一步提供根据本发明的组合物 ( 即本文描述的组合物 )， 其被配制用 作杀害虫剂， 即农药制剂包含根据本发明的组合物和一种或更多种媒介物、 载体、 粘合剂或 者赋形剂。
杀害虫剂 ( 例如抗线虫、 抗真菌和杀虫剂 ) 组合物包含本文描述的研磨草本植物， 其容易制造， 因此相对便宜。而且， 发明人证明的抗线虫、 抗真菌和杀昆虫活性打开可能性 以保护农作物抵抗线虫和真菌感染和昆虫攻击， 通过施加单一组合物， 提供节约时间和成 本。 本发明的草本植物组合物具有抵抗不同组害虫的活性的事实也暗示它们可能具有一种 作用方式， 这对于其他类别的害虫例如细菌和病毒也是有活性的。
作为直接在杀害虫剂组合物中利用粉末草本植物的替换， 提取物， 例如利用醇、 水 或者有机溶剂或者粉末草本植物的煎煮可以被施行和所述处理的产品用在杀害虫剂组合 物中。
可能合乎需要的是或多或少地纯化草本植物制剂的杀害虫剂部分， 甚至是分离杀 害虫剂因子， 在使用杀害虫剂组合物前。
如同实例阐明的， 根据本发明的组合物有效治疗和 / 或预防植物疾病， 所述植物 疾病由各式各样植物病原生物 / 害虫包括线虫、 真菌和昆虫导致。
本发明的杀害虫剂组合物可以被用于任何的易受害虫感染的植物。 本发明在防护 作物 ( 感染害虫例如线虫、 真菌或者昆虫造成产量损失进而有显著经济损失 ) 中最有用。
在专业农作物市场中， 由于线虫感染导致的经济困难在高价值蔬菜和水果例如草 莓和香蕉中更高。在高面积农作物中， 线虫损害在大豆和棉花中最大。可以施加本发明抗 线虫组合物的农作物的非限定性实施例包括 ： 草莓、 香蕉、 大豆、 棉花、 马铃薯、 胡椒、 洋葱、 柠檬、 咖啡、 甘蔗、 温室观赏植物和装饰织物 ( 例如高尔夫球场 ) 草皮草。
关于真菌感染 / 疾病， 最大的利益是同样可能在防护农作物中获得， 其中真菌病 引起显著经济损失通过产量下降， 在高价值蔬菜和水果中， 以及在高面积农作物中， 例如上 列的那些以及黄瓜和茄子。 种植作物例如海枣、 油棕、 桃棕榈叶、 菠萝和甘蔗也易受真菌病， 以及树种例如枫和鹅掌楸。 本发明的杀真菌组合物也可以用来保护草坪草以及观赏植物例 如无花果、 Guzmania、 槟榔和 Howea， 免于真菌病原体。
发明人的发现暗示本文描述的组合物也可以用来保护易受昆虫害虫损害的农作 物例如白蚁。
本发明的杀害虫组合物该优点是组合物针对广谱害虫是有效的， 允许农作物被保 护抵抗多重的、 完全不同的害虫， 通过施加单一组合物， 提供减少的成本和减少的对环境的 影响。
本文呈递的抗白蚁结果表明根据本发明的杀害虫剂组合物可以进一步用来处理 建筑物中的白蚁侵扰， 或者预防通过白蚁导致的建筑物的结构破坏， 通过涂覆 ( 例如涂料 或者浸渍建筑材料例如树木、 水泥石膏岩等等这样的组合物。
许多白蚁物种的以树木为食的习性能够对无保护建筑物及其他木结构造成重大 损害。然而， 一旦白蚁进入建筑物， 则它们也损害其它的纤维素材料例如纸张、 布和地毯。 其它的软材料例如软塑料、 灰泥、 橡胶和密封剂例如硅橡胶和丙烯酸可能被白蚁损害， 其利 用用于建筑的这些材料的颗粒。根据本发明的杀害虫剂组合物可用于保护食品 ( 即纤维素 质 ) 和非食品建筑材料免于白蚁攻击， 或者处理现存的侵扰。 因此， 在进一步的实施方案中， 本发明提供一种方法用于治疗或者预防白蚁对建 筑物的危害， 包括为所述建筑物或者它的部分施加组合物， 该组合物包括选自茴芹、 骆驼 蓬、 肉豆蔻、 丁香和 Rhazya stricta 的两种或更多种植物的制剂或提取物。
还提供了一种构造建筑物的方法， 所述建筑物能抵抗白蚁造成的损害， 所述方法 包括下列步骤 ： i) 用组合物处理一种或者更多种建筑材料， 所述组合物包含两种或者更多 种选自茴芹、 骆驼蓬、 肉豆蔻、 丁香和 Rhazya stricta 的植物的制剂或者提取物 ； 和 ii) 将 所述经处理的建筑材料用于构建建筑物。
在下文实施例中在试验体系中证明了根据本发明制剂的抗线虫活性利用根节线 虫 ( 根结线虫属 )， 然而没有理由臆断抗线虫活性只限于这个线虫属。 本发明的抗线虫制剂 预期具有针对任何土壤线虫害虫的用途， 包括但不限于属于下列属的那些 ： Meloidogyne， Heterodera， Globodera， Ditylenchus， Aphelenchoides 和 Heliotylenchus 以及任何本文 所提到的其他那些。
类似的， 预期本文所描述的草本植物制剂的抗真菌活性将扩展到目前所测试的真 菌物种 ( 实施例 5 和 6) 之外， 包括例如镰刀霉， Verticillium， 丝核菌， 腐霉属和疫霉属的 致病物种， 以及其他本文所提到的物种。
发明人发现本发明的草本植物制剂能够以 1 ％ (w/v)( 即 10g/l) 或更低的浓度 有效抵抗害虫 ( 例如线虫、 真菌和昆虫 ) 优选， 本发明的草本植物制剂以 0.75 ％， 0.5 ％， 0.33 ％， 0.25 ％ (w/v) 或更低的浓度显示杀害虫活性。更优选， 所述制剂以低至 0.2 ％， 0.15％， 0.1％ (w/v) 或者甚至更低的浓度显示出杀害虫活性。
草本植物制剂的最终浓度可以独立地变化， 即在杀害虫组合物中可以以不同的浓 度存在不同的草本植物。
例如， 发明人发现相对于其他草本植物成分， 更高浓度的茴芹能获得良好的杀线 虫活性。有效的抗线虫组合物是通过混合 0.4％ (w/v) 茴芹和均为 0.2％的骆驼蓬， 肉豆蔻 和丁香获得的。类似的， 发现包含 0.3％茴芹和均为 0.1％的骆驼蓬， 肉豆蔻和丁香的制剂 能有效控制白蚁。
具有相对高浓度的丁香的组合物能够在野外测试中很好地抵抗真菌病原体， 例如 0.1％茴芹， 均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻， 以及 0.4％丁香。
有利的， 本发明的制剂能够有效抵抗线虫生命循环中的所有阶段， 例如卵团， 连续 的幼虫阶段和成虫。 特别重要的是， 这些制剂能够抵抗存在于土壤中的卵团， 和侵蚀宿主植 物根部的自由存活的第二阶段幼虫。
本发明不同实施方式的优选特征是在必要修改的基础上相互应用的。
通过下面的非限制性实施例参考下列附图描绘本发明 ：
图 1 是显示根据实施例 1 的丁香抗线虫剂的不同制剂的图。
图 2 显示在室温、 150℃和 200℃下色谱分析肉豆蔻 ( 肉豆蔻籽 ) 提取物 ( 从左到 右 )。
图 3 显示在室温、 150℃和 200℃下色谱分析丁香 ( 丁香 ) 提取物 ( 从左到右 )。
图 4 显示显微镜检验卵团和幼虫侵入根结线虫感染垂叶榕根 (a) 未用草本植物剂 处理 ( 对照 )(b) 用草本植物剂处理。
图 5 显示根节线虫感染垂叶榕的根系图片 ： (a) 对照 ； (b) 用草本植物剂处理后， 所述草本植物剂包括 0.3％茴芹和均为 0.1％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香 ； 和 (c) 用 Nemamort 剂化学处理后。
图 6 显示代表性的显微镜检验螺旋线虫属的卵团和幼虫感染观赏植物 Guzmani、 槟榔和 Howea 根 ： (a) 用草本植物剂处理之前 ( 对照 ) 和 (b) 用草本植物剂处理后。
图 7 和 8 显示由土壤真菌病原体在未经处理的草坪草中所引起病症。
图 9 和 10 显示用杀真菌剂的草本植物剂处理的草坪草中的健康生长和颜色。
图 11 显示土壤镰刀霉属和腐霉属在 PDA 上的培养， 所述 PDA 是从未处理草坪草分 离的。皮氏培养皿被孵育在 28℃ 7 天。
图 12 显示紫花苜蓿的绘图 (a) 处理之前， (b) 用草本植物剂处理后， 所述草本植 物剂按照溶液百分比含有 (w/v)0.2％茴芹和均为 0.15％的骆驼蓬和肉豆蔻， 以及 0.1％丁 香。处理采用 10gm/L 或 30gm/m2 作为灌药并在 30 天内重复两次。
图 13 显示 F1 杂种黄瓜 Miracle(Brusima) 在具有砂底座的塑料温室中生长的图 片： (a) 用草本植物混合物处理 - 植物看上去非常健康， 没有土壤真菌 ； (B) 用 NIPROTTM 处 理 - 在植物上显示出土壤真菌症状。
图 14 显示 F1 杂种黄瓜 Miracle(Brusima) 在具有砂底座的塑料温室中生长的图 片： (A) 如实施例 11 中所述的草本植物杀真菌混合物处理 - 植物看上去非常健康， 没有出 现土壤真菌症状并且与 (B) 和 (C) 对照植物相比产生高数量的果实。
图 15 显示 F1 杂种黄瓜 Miracle(Brusima) 在具有砂底座的塑料温室中生长的图 片： (A) 如实施例 11 中所述的草本植物杀真菌混合物处理 - 植物比 (B) 对照植物高。
图 16 显示 F1 杂种黄瓜 Miracle(Brusima) 在具有砂底座的塑料温室中生长的图 片： (A) 如实施例 11 中所述的草本植物杀真菌混合物处理 ； (B) 在 FYM 富集土壤中生长对照植物。在用草本植物混合物处理的植物中观察到较少的死亡植物。
图 17 显示 F1 杂种黄瓜 Miracle(Brusima) 在具有砂底座的塑料温室中生长的图 片： (A) 如实施例 11 中所述的草本植物杀真菌混合物处理 ； (B) 在 FYM 富集土壤中生长对照 植物。在用草本植物混合物处理的植物中观察到明显更大的产量。
图 18 显示感染 Thielaviopsis paradoxa 的海枣树的图片。(A) 被 1w/v％草本植 物杀真菌溶液处理的海枣树， 所述溶液是 0.1％茴芹和均为 0.5％的骆驼蓬和肉豆蔻， 以及 0.4％丁香的混合物， 其每 15 天使用一次， 持续 1 个月 ； (B) 对照海枣树， 其不接受处理， 并 且在中心和叶子明显显示出黑色枯萎和弯头疾病。
实施例 1
丁香制剂 ：
从 Dubai 当地草本植物市场购买干燥的丁香豆荚。通过在金属过滤器中空气干燥 15min 清洁丁香除去灰尘。在磨碎机中粉末化清洁的豆荚。将 1 公斤清洁的丁香豆荚粉末 置于塑料容器中， 并增添 450ml 自来水并且迅速地混合好直到形成浆糊。使丁香豆荚浆糊 通过切碎设备的 0.4cm 直径孔以形成颗粒。在不锈钢盘中收集颗粒， 并置于烘箱中在 45℃ 干燥 2 天， 持续 2 天每天旋转两次。如图所示， 制备不同的丁香制剂。
进行研究的农作物 ：
秋葵或者番茄
进行处理的样品 No. ：
1) 丁香 0gm/l( 对照 )
2) 丁香 5gm/l
3) 丁香 7.5gm/l
4) 丁香 10gm/l
5) 一种商业推荐的化学杀线虫药用作另一个
处理间隔 ：
每 2 个星期处理一次
重复的数量 ：
1. 对于盆栽试验是每一处理五盆， 每一盆五个植物。
2. 对于野外试验是每一处理 5 行， 每一行 50 个植物。
被用来研究的线虫 ：
根节线虫将用来人工传染。
盆栽实验 ：
用盆培育的植物施行的实验在植物研究中大概是最普通的。 完成对照实验的需要 常常代替对在他们的本地环境中培育的植物进行观测， 通过产生植物用于在可控实验室中 近景观测。 然后在人造环境中在不同的容器内培育植物， 草本植物抗线虫剂的浓度不同 (w/ v) 并且放置在温室中。为了避免机误方差， 将执行最佳的生长条件。
野外试验 ：
这个方法是在实验上在开放的野外中检查草本植物抗线虫剂的介入以及线虫的 生活力。野外试验将与盆栽试验组相比较。
两个野外实验将被如下进行 ：在 Ministry of Environment and Water in Al Himraniya， Agriculturestation， Ras-Al-khaima 的授权之下。
Al Dhaid 地区。
结果
结果证实丁香抗线虫剂是环境安全的， 靶特异性的产品用于在农业领域控制植物 寄生的线虫类。
实施例 2
材料和方法
制备根节线虫的匀化悬浮液
感染根节线虫的南瓜根被用 200ML 自来水压碎以制备根节线虫的匀化悬浮液。将 20 毫升匀化根节线虫悬浮液样品置于 50ML 玻璃烧杯中， 并显微镜下检查和记录根节线虫 的第二阶段幼虫及其他阶段。平均起来每 20ML 根节线虫的匀化悬浮液大约含有 50-60 个 第二阶段幼虫。
草本植物制剂
从 Dubai 当地草本植物市场购买干燥的丁香豆荚丁香、 骆驼蓬种子和肉豆蔻种 子。全部草本植物材料都在金属过滤器中通过空气干燥 15min 清洁除去灰尘， 并且分别在 磨碎机中粉末化。 抗线虫试验
在 20ml 根节线虫匀化悬浮液样品和 20 对照样品 ( 不添加草本植物材料 ) 中制备 不同浓度的 0.33％ (w/v) 和 0.5％ (w/v)( 表 2)。在室温下温育 24h 后， 用于每个样品显微 镜下检查和记录根节线虫卵团、 第二阶段幼虫及其他阶段的数目。
结果
表 2 中所列出的结果表明与未经处理的对照样品比较， 每个 0.3％的丁香豆荚丁 香、 骆驼蓬种子和肉豆蔻种子粉末的水溶液都单独具有有效的杀线虫活性。 均为 0.5％的骆 驼蓬和肉豆蔻或者均为 0.3％的丁香、 骆驼蓬和肉豆蔻的组合表现出显著的新型杀线虫的 协同作用， 其抵抗根节线虫的卵团及其他阶段尤其是第二阶段 ( 表 2)。
关于此事， 利用均为 0.5％的丁香和骆驼蓬观察到显著的协同作用， 其中卵团、 第 二阶段及其他阶段幼虫被消灭 ( 表 2)。然而， 丁香豆荚在骆驼蓬和肉豆蔻组合中的存在或 者缺少， 似乎没有显著效果， 其中卵团及其他阶段消失， 并且分别仅观察到 1.23％和 1.8％ 的第二阶段表 ( 表 2)。
0.33％的骆驼蓬种子水溶液似乎具有特异性抗卵团线虫活性， 其中在处理后它们 从样品中消失。 在骆驼蓬种子与丁香豆荚和肉豆蔻种子之一或两者的组合中再次观察到该 现象 ( 表 2)。 骆驼蓬种子在与丁香豆荚和肉豆蔻种子的相互作用中的作用需要进一步的调 查。
表 2. 在不同的草本植物组合物水溶液中， 根节线虫的、 第二阶段幼虫及其他阶段 的存活率。
* 透明意味着内部的幼虫仍然存活并且会孵化
** 黑色以为这被破坏并且不会孵化
*** 第三、 第四和成虫阶段幼虫通常不会移动
注意 ： 通过将感染根节线虫的南瓜的根装在 1000ml 玻璃烧杯中获得相似的结果， 所述玻璃烧杯含有 500ml 不同的浓度的草本植物水溶液 (0.33％和 0.5) 和 500ml 自来水对 照样品 )。全部样品都在 25 摄氏度下放置， 48 小时后， 如上所述， 对每个样品， 在显微镜下 检查和记录感染的南瓜根的根节线虫的卵团、 第二阶段幼虫及其他阶段的数量。
结论
虽 然 丁 香 油 早 先 已 经 被 建 议 用 于 杀 线 虫 药 和 杀 真 菌 剂 中 (US20040127362 ； Bowers 等， 同前， Ramasinghe 同前 )， 但先前没有报道研磨、 干燥丁香的简单制剂能有效用 于治疗或者预防植物疾病。或者肉豆蔻两者都没有先前在文献中被作为抗线虫剂研究。
似乎丁香、 骆驼蓬和肉豆蔻的每一个现在都显示能够成为抵抗植物寄生线虫的有 效防护剂。骆驼蓬和肉豆蔻的杀线虫活性进一步在野外被研究。
骆驼蓬和肉豆蔻植物的线虫毒性化合物将被研究。 我们假定这些化合物的作用模 式复杂， 则在线虫处理方面的许多机制还有待于彻底地探索。
实施例 3
材料和方法
制备根结线虫的匀化悬浮液
用 500ml 自来水压碎感染根结线虫南瓜的根以制备根结线虫的匀化悬浮液。将 100 毫升匀化根节线虫悬浮液样品置于 750ml 塑料烧杯中， 并显微镜下检查和记录根节线 虫的第二阶段幼虫及其他阶段的数量。平均地， 每 100ml 匀化根结线虫悬浮液含有大约 2500-3000 个第二阶段幼虫。
草本植物制剂
从 Dubai 当地草本植物市场购买干燥的丁香豆荚丁香、 茴芹种子、 骆驼蓬种子和 肉豆蔻种子。通过在金属过滤器中空气干燥 15min 清除全部草本植物材料的灰尘， 然后分 别在磨碎机中粉末化。
抗线虫试验
在 750ml 根结线虫匀化悬浮液样品中制备不同浓度的草本植物材料， 0.1 ％ (w/ v)、 0.2％ (w/v) 和 0.15％ (w/v)， 以及 100ml 对照样品 ( 不添加草本植物材料 )( 表 3)。在 室温下温育 12h 后， 使样品悬浮液通过 53μm 筛子， 用自来水洗涤保持在筛子上的材料， 并 再悬浮在 100ml 中， 然后对于每个样品在显微镜下检查和记录根结线虫的卵团、 第二阶段 幼虫及其他阶段的数量
结果
表 3 列出的结果表明与未经处理的对照样品相比， 0.1％丁香豆荚丁香、 0.2％茴 芹种子、 0.15％骆驼蓬种子和 0.15％肉豆蔻种子粉末水溶液的每个都单独具有有效的杀线 虫活性。0.15％骆驼蓬和肉豆蔻和 0.2％茴芹的组合显示出显著的和新型的杀线虫协同作 用抵抗根结线虫的卵团及其他阶段， 尤其是卵团。
然而， 0.1％丁香豆荚丁香在 0.15％骆驼蓬和肉豆蔻和 0.2％茴芹的组合物中的 存在会降低抵抗卵团的杀线虫协同作用超过 4.5 倍 ( 表 3)。尽管， 其已经显示与 0.2％茴 芹种子提取物联合能够有效抵抗卵团。 计划进一步研究探悉四种草本植物材料对卵团的作 用方式。
表 3. 在不同的草本植物组合物水溶液中， 根结线虫卵团、 第二阶段幼虫及其他阶 段的存活率。
结论
先前在文献中没有研究草药茴芹、 和肉豆蔻作为抗线虫剂。茴芹、 骆驼蓬和肉豆 蔻中间每一个都已经显示有效作为抵抗植物寄生线虫的防护剂。Use 0.2 ％茴芹和均为
0.15％的骆驼蓬和肉豆蔻联合得到抗线虫活性的协同的增加。 这些结果暗示茴芹作为针对 卵团的主要有效材料的使用和为这个主要材料增补骆驼蓬和肉豆蔻可以得到活性的有效 和协同增加。在农业领域目前正在执行大量的研究。
将研究茴芹、 骆驼蓬和肉豆蔻植物的线虫毒性化合物。我们假定这些化合物的作 用模式复杂， 则在线虫处理方面的许多机制还有待于彻底地探索。
实施例 4 ： 在不同加热等级下， 化学分析丁香 ( 丁香 )、 肉豆蔻 ( 肉豆蔻 )、 骆驼蓬 (Harmala) 和茴芹 ( 大茴香 )
材料和方法
从 当 地 Dubai 草 本 植 物 市 场 购 买 丁 香 ( 丁 香 )、 肉 豆 蔻 ( 肉 豆 蔻 )、 骆驼蓬 (Harmala) 和茴芹大茴香 ) 的干燥种子。通过在金属过滤器中空气干燥 15min 清除全部草 本植物材料的灰尘， 然后分别在磨碎机中粉末化。
用氯仿在索格利特提取器中对种子进行提取。 在压力下使提取物蒸发并且称量干 燥的残渣。从 100 种子中， 使用 5 克干燥的残渣。
借助于化学定性分析实行蔬菜材料大体化学成分的建立， 所述化学定性分析使用 利用溶剂的选择性提取和后续的分馏用于识别活性成分 (Ciulei， 1982)。
对萜类实行色谱分析， 使用 TLC G60 F254 作为固定相， 两种溶剂系统甲苯 - 乙酸乙 酯 (93 ∶ 7) 和乙酸乙酯 - 冰醋酸 - 甲醛 - 水 (100 ∶ 11 ∶ 11 ∶ 27)， 用在硫酸中的 5％香 草醛在 105℃下进行检测 (Wagner， 1984)。
结果和讨论
在下表 4 中给出了萜类的定性测量结果 ：
数据显示丁香比其它的富含挥发油和甾醇类， 但是肉豆蔻不包含甾醇。大茴香存 在十分轻微的涉及挥发油的阳性标记。Harmala 在两个试验中都显示阴性结果。在下表 5 中给出了色谱分析结果 ：
* 溶剂系统 ( 甲苯 - 乙酸乙酯 93 ∶ 7) ** 溶剂系统 ( 乙酸乙酯 - 冰醋酸 - 甲醛 - 水 100 ∶ 11 ∶ 11 ∶ 27) 观察结果 1. 从植物化学观点， 在不同的温度等级下， 从定性和定量角度， 化学成分没有显著差异。 2. 丁香和肉桂比大茴香存在显著量的活性成分。
3.Harmala 显示在萜类所用的特定溶剂系统中没有显著性。
建议进一步的调查 ： 用 150℃和 200℃处理丁香和肉豆蔻可能使得活性成分量有 差异， 如下 ：
肉豆蔻 ( 肉豆蔻 )
将用不同的温度等级从肉豆蔻获得的样品 ( 室温， 150℃和 200℃ )， 进行色谱分 析， 使用 TLC G60 F254 作为固定相和甲苯 - 乙酸乙酯 (93 ∶ 7) 作为溶剂系统。然后在硫酸 中在 105 摄氏度下通过 5％香草醛用 UV254 进行检测。结果示于图 2。观察到以下特征 ：
1. 在三个不同的热处理样品中， 注意到存在含有更多 “肉豆蔻醚” Rf ＝ 0.75 的主 要材料。
2. 注意到在三个样品中存在其他较少量水平趋同 Rf ＝ 0.59， 0.57 和 0.55， 因为 具有相同的颜色 UV， 相信由于受影响材料开始的差异是热量的。
不同实验的 Rf 数值的差异不是焦点， 因为我们不是在标准状态下工作， 但是肉豆 蔻醚总是第一个以最高 Rf 和最大量获得的化合物。
丁香 ( 丁香 )
将来自利用不同温度等级的丁香的样品 ( 室温， 150℃和 200℃ ) 进行色谱分析， 使 用 TLC G60 F254 作为固定相， 和甲苯 - 乙酸乙酯 (93 ∶ 7) 作为溶剂系统 . 然后在硫酸中在
105 摄氏度下通过 5％香草醛用 UV254 进行检测。结果示于图 3。观察到以下特征 ：
1. 注意到存在两个材料， 第一个在 Rf ＝ 0.96 和以相同大小位于三个位置。第二 个是丁子香酚和在 Rf ＝ 0.6 和它是在三个位置中最大的。
2. 在 UV 上的斑点和用试剂检测后的结果之间有完全的一致。
概要
丁香 ( 丁香 )， 肉豆蔻 (Nutmeg)， 骆驼蓬 (Harmala) 和茴芹 ( 大茴香 ) 的氯仿提取 物没有受不同的加热等级和 100℃的影响。 丁香和肉豆蔻比大茴香显著更富有活性成分， 但 是 harmala 提取无没有显示出显著性。因此， 可能更高温度的提取物处理对活性成分的存 在有影响。关于这一点， 据发现在 150℃ -200℃肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 中的主要材料含有 “肉豆 蔻醚” Rf ＝ 0.75， 而对于丁香 ( 丁香 ) 在相同的温度发现存在两个材料， 第一个是以相同的 大小在 Rf ＝ 0.96 并位于三个位置。第二个是丁子香酚并在 Rf ＝ 0.6 并且它是最大的。
肉豆蔻醚和丁子香酚的化学结构示于表 6 中。
实施例 5 ： 含水丁香 “丁香” 荚粉末对土壤真菌数目在葫芦科和茄子植物在温室和 开放野外的影响。
干磨丁香荚被测试体外抗真菌效果以及在温室和野外对土壤真菌的控制。
马铃薯右旋糖琼脂 (PDA) 补充以 0.5％和 1w/v％丁香荚粉末。在 28 摄氏度下孵 育 7 天后， 与对照处理 ( 没有丁香粉末 ) 相比， 在补充有 1％丁香粉末的 PDA 中 Fusarium oxysporum， Fusarium wilt， Phytophthora blight， 烟草疫霉和腐霉属的生长消失。
在含有之前被接种疫霉属和腐霉属的土壤的盆中， 从种子培育茄子 ( 品种 Black Beauty) 和黄瓜 ( 品种 Queen) 植物。
测量和未经处理的对照对比， 用 0.5％和 1％ w/v 丁香荚提取物对枯萎植物数量 的影响。用 0.5％丁香荚水提物物处理发现显著减少罹病度 ； 1％提取物具有甚至更大的影 响。
丁香荚水提取物 0.25％， 0.5％和 1％ w/v 也在温室和开放野外被测试抵抗茄子和 黄瓜土壤真菌病的效力。在播种日施加处理， 每隔一星期进一步施加两次。结果显示丁香
荚水提取物在 0.5％到 1w/v％范围内在温室和牧场在低于 7 天内能破坏黄瓜 ( 品种 Queen) 和茄子 ( 品种 BlackBeauty) 真菌感染 ( 枯萎、 颈干腐病 )， 并且原位比所测试的商品化学产 品 (Fungarid 0.1％， Rhizolex 0.15％， Ridomil plus 0.2％， Tachigareen 30％ 0.2％ ) 在控制真菌治病方面更有效。
根据实施例 1 制备的丁香荚颗粒被评价抵抗土壤真菌的效力。用 1％ w/v(10g/L) 丁香荚颗粒处理椰子土壤发现与未处理的椰子土壤相比显著减少土壤的疫霉属和腐霉属 和数目， 并且显著降低茄子品种 BlackBeauty 幼苗显示出幼苗枯萎症状的频率。
上述结果证明丁香荚粉末， 颗粒和水提取物是有效的抗真菌组合物， 而且是对环 境无害的， 对消费者安全的和对农民廉价的。
实施例 6 ： 茴芹 ( 大茴香 )， 、 骆驼蓬 (harmala)、 肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和丁香 ( 丁香 ) 针对选定的土壤真菌物种的抗真菌活性
材料和方法
接种体制备
用 于 目 前 研 究 的 真 菌 分 离 自 来 自 Northern Emirates(Al-Dhaid andRas-El Khaima， UAE) 的不同农场的腐烂秧苗和枯萎黄瓜品种 Queen 植物。收集的患病材料在流动 的自来水中被彻底清洗， 并且通过浸在 0.1％氯化汞溶液中 3 分钟和在无菌水中漂洗两次 对表面进行灭菌。这样的灭菌材料被切成为小块 ( 长度 0.5-1 厘米 )， 无菌滤纸之间干燥 然后栽种在马铃薯右旋糖琼脂培养基上 (PDA ； Difco)。平板在 28℃下被孵育 3-6 天， 每天 检查霉菌生长的发生。通过菌丝尖头或者单孢分离技术 (Hildebrand， 1938 ； Domsch 等人， 1980) 进行所得到霉菌生长的纯化， 并在 PDA 斜面上维持纯培养。 显微镜下检验和鉴定分离 的真菌 (Ellis， 1971)。 体外评价草本植物抗土壤真菌的效率
干燥茴芹 ( 大茴香 )、 骆驼蓬 (harmala)、 肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和丁香 ( 丁香 ) 荚被经 过空气干燥清洁除去灰尘。清洁的草本植物材料被在搅拌器其中分别粉末化。然后在 PDA 中分别补充或者混合补充 0.15％ w/v 骆驼蓬 (harmala) 或者肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 0.2％ w/ v 茴芹 ( 大茴香 ) 或者丁香丁香荚粉末并且在 121℃高压消毒 20min。草本植物混合物培养 基被冷却至大约 45℃， 混合好， 并且快速分配至 20ml 在无菌一次性陪氏培养皿中， 使得内 含物在室温下固化。
将来自在 PDA 上培养 7 天的 0.5X 0.5 平方厘米土壤真菌接种体放置在补充有草 本植物材料的 PDA 的中心。反转陪氏培养皿并且在 28℃孵育 5 天。另外， 没有草本植物粉 末的 PDA 平板被接种土壤真菌作为对照试验， 如上面描述的。在 PDA 上， 有和没有草本植物 粉末， 对于各真菌重复 5 次。
术语 “生长” 以特定含义在本文中使用， 即表明有生存力的真菌的存在和推测增 殖。继温育之后， 计算霉菌生长直径 (cm) 以及计算群体大小利用 Gorbushina(1997) 试验 数据， 部分表示于表 7 中。
结果
从真菌感染的黄瓜植物分离两个真菌物种， 鉴定为和腐霉属。
为研究选定的草本植物材料抑制其它的土壤传染病例如土壤真菌的性质， 施行一 系列实验评价添加在所使用的条件下， 在没有使用草本植物材料作为对照时暴露于 PDA 的
镰刀霉和腐霉属的平均真菌存活率被于添加不同浓度的 0.15％骆驼蓬 (harmala)、 0.15％ 肉豆蔻 ( 肉豆蔻 )、 0.2％丁香 ( 丁香 ) 和 0.2％茴芹 ( 大茴香 ) 的 PDA 进行比较 ( 表 7)。 针对镰刀霉和腐霉属生长存活率的动力学。
确定在 PDA 上菌落直径、 营养区域尺寸和草本植物材料的输入量， 以确定可以用 来抑制单个真菌菌落生长的草本植物材料。这个试验测量真菌抑制速度， 通过测定菌落直 径 (mm)， 该菌落在暴露于补充一定浓度草本植物材料的 PDA 后仍存活。 在所使用的条件下， 在没有使用草本植物材料作为对照时暴露于 PDA 的镰刀霉和腐霉属的平均真菌存活率被 于添加不同浓度的 0.15％骆驼蓬 (harmala)、 0.15％肉豆蔻 ( 肉豆蔻 )、 0.2％丁香 ( 丁香 ) 和 0.2％茴芹 ( 大茴香 ) 的 PDA 进行比较 ( 表 7)。
表 7. 在补充不同浓度粉末草本植物材料的 PDA 上 28 摄氏度下培养 5 天后两种真 菌物种的菌落直径 (mm)， 重复 5 次的平均
结果显示骆驼蓬具有显著的抗真菌活性抵抗土壤镰刀霉和腐霉属二者， 丁香也显 示相似的活性抵抗镰刀霉属。
用骆驼蓬和丁香处理的样品和用不含草本植物材料的对照处理的那些之间的抗 真菌活性的差异是显著的。
草药 Rhazya stricta 也被测试杀虫害活性， 其单独和联合丁香、 肉豆蔻和茴芹， 抵 抗线虫和真菌， 并且显示出与骆驼蓬观察到的那些相似的抗线虫和抗真菌活性。
实施例 7 ： 改变茴芹、 骆驼蓬、 和丁香在草本植物混合物中的相对量对控制观赏植 物中根节线虫的影响
通过分别量出不同量的干燥草本植物材料 ( 茴芹、 骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香 ) 在烧杯 中制备不同的草本植物混合物组。然后自来水被增加给各组组成草本植物溶液， 最终容积 为 100 毫升。然后对感染根节线虫 Meloidogyne incignita 的观赏植物垂叶榕， 测试各草 本植物溶液。
表 8， 不同草本植物混合物对感染根结线虫的 F.benjamina 的杀线虫活性
上述结果显示草本植物混合物组号 10 达到≥ 90％的线虫死亡率和为此它被选定 用于野外试验并且进一步如下以升为单位进行大比例的制备 ：
分别地称出 4Kg 茴芹的粉末草本植物， 和均为 2 公斤的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香， 然 后一起混合好。将 10gm 从粉末草本植物干混合物转移入塑料容器中， 添加 1 升自来水获得 最后浓度 (w/v％ )0.4％茴芹和均为 0.2％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香。
实施例 8 ： 杀线虫草本植物剂控制观赏植物中根节线虫的效力
这个研究被实施以确定杀线虫草本植物剂 ( 按照 w/v 由下列构成 ： 0.4％茴芹和均 为 0.2％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香 ) 的活性， 其在感染根节线虫亲缘根癌线虫的观赏植物垂 叶榕上实施。
方法
1- 处理感染根节线虫的垂叶榕
将 50 株种植在 40 厘米直径盆用土壤的盆中感染根节线虫的垂叶榕植物分成 3 组， 实施下列处理 ：
i. 用自来水处理 10 株植物， 并标记为对照。
ii. 用 no.10 杀线虫草本植物混合物处理 20 株植物 (10gm/L ： 0.4 ％茴芹和均为 0.2％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香 )。通过倒入 2 升溶液甚至超过土壤处理每个植物 / 盆。
iii. 用化学杀线虫剂 Nemamort(ml/L) 处理 20 株植物， 通过倒入 2 升溶液甚至超 过土壤来处理每个植物 / 盆。
在 30 天之内重复处理两次， 所有盆每周都接受 3 次自来水， 并使盆保持 30 天， 然 后显微镜下肉眼观察来自每个处理的根。
2. 根节线虫检查
用于显微镜下检查生命周期阶段的根节线虫是从 50 克感染的垂叶榕根制备的， 在流动的自来水中漂洗 2 分钟， 然后切成 20mm 片， 置于具有 250ml 自来水的搅拌器中。通 过 53 微米筛子收集 20ml 含有线虫的悬浮液， 然后使用复合显微镜在 40X 放大倍数观察。
结果和讨论
显微镜下观察根节线虫亲缘根癌线虫生命周期的全部阶段 ( 卵团、 第二、 第三、 第 四阶段幼虫和成虫 )。来自对照样品的结果清楚显示第二阶段幼虫是活的具有透明的卵团 ( 图 4)。
瘿和活的亲缘根癌线虫不成熟根节线虫被清楚地在对照垂叶榕的根系处， 所述对 照垂叶榕不用任何的杀线虫试剂处理 ( 图 5(a))。 在用化学杀线虫药 (Nemamort) 处理的垂 叶榕根系处观察到较少的瘿和活的不成熟的根节线虫 ( 图 5(c))。 相反， 在用杀线虫的草本 植物剂处理的垂叶榕根处没有肉眼观察到根节线虫瘿 ( 图 5(b))。 而且， 与未经处理的对照 植物相比， 大约 99.2％不成熟的被发现在用草本植物杀线虫剂处理的垂叶榕根中是死的。
而且， 如上相同的处理被延伸到在观赏植物 Guzmania、 槟榔和 Howea 上控制其它 寄生线虫 Ditylenchus 属， Appelenchoides 属和螺旋线虫属的根节线虫， 也获得了相同的 结果 ( 图 6)。
实施例 9 ： 通过草本植物剂控制草坪草土壤真菌
实施目前的实施例以确定草本植物混合物的杀真菌活性 ( 按照 w/v 含有 0.1％茴 芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香 )， 基于其移动通过土壤并且达到抵抗主 要根部真菌疾病的期望活性的能力。
介绍
土壤草坪草疾病影响全部暖季草并且致使主要的草皮质量损失。 他们是主要由真 菌导致并且有很少真实的在草坪草中抗病性的实例。 草坪草的丝核菌疾病起因于至少两个 土壤真菌 Rhizoctoniasolani 和 R.Cerealis。 真菌之一或者二者实际上存在于全世界的全 部土壤。两者真菌都由许多菌株或者物种组成， 其攻击各式各样的不同植物并且包括大多 数蔬菜、 花和农田作物。
感染丝核菌物种的草坪草症状变化非常大， 并且容易与由其它的病原体造成的疾 病症状混淆。他们随草坪草载培品种、 土壤和空气环境条件以及具体的丝核菌物种和菌株 ( 或者物种 ) 的具体组合而变化。 丝核菌的一种或更多种物种感染全部草坪草， 造成叶以及 幼苗枯萎病。
高度切割的草皮发现在家庭和工业草坪、 公园、 运动区域和高尔夫球球座和终点 间的地带， 患病的小块土地通常是大致环状的， 浅褐色， 压紧， 直径为最高达到 2 英尺。发生 和罹病度都受到植物健康、 地位因素诸如阴凉和有时直接受到草堆高度的影响。有时环境 因素诸如阴凉、 水浸或者热应力可以导致严重的草皮损伤和应力， 并且被错误地诊断为疾 病。
小块土地有时产生中心发绿和类似小块″蛙眼″和坏死的环状斑病。 然而患病的 几片草地看起来被沉没。在轻微感染褐色小块地中， 受影响的草皮通常会在 2 或者 3 星期内恢复。当攻击 严重时， 然而， 花冠、 根茎、 匍匐枝和根变褐色和枯萎常常大面积杀死。
对于这些疾病中大多数的耕作防除全部是围绕确保土壤湿气足够但是不高或者 过分。 在有些土壤中， 排水需要被改善， 而对于其他的， 好的排水是固有的， 需要采用好的灌 溉管理实践。
许多疾病也被高速率施加氮来促进， 常常因为氮促进快速生长率， 生产足量的年 轻、 容易感染的组织。这可以被在某种程度上减轻， 通过更频繁地用较少的肥料来增肥， 以 促进稳定的生长率。
注册了一系列化学制品用于控制草皮中的疾病， 有些是注册用于抵抗数个疾病。
方法
草本植物抗 - 真菌
分别地称量粉末草本植物 ： 1Kg 茴芹， 和均为 2.5Kg 的骆驼蓬和肉豆蔻， 和 4Kg 丁 香。全部 4 种草本植物被充分地混合在一起。然后， 将来自草本植物干燥混合物的 30gm 置 于塑料容器内， 添加 3 升自来水以获得下列最后浓度的草本植物抗真菌剂 (w/v) ： 0.1％茴 芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻， 以及 0.4％丁香。 土壤真菌鉴定
收集植物根附近的野外土壤， 所述植物根已知被强烈感染土壤真菌。将需氧平板 计数的标准操作程序与真菌培养基马铃薯右旋糖琼脂 (PDA) 一起使用。将平板在 28℃温 育， 并每天检验， 持续 7 天。选择纯的真菌培养， 并且在显微镜下和肉眼鉴定。
处理受感染地区
将 20mX20m 的区域分成 16 块， 每块 5mX5m， 使用下列两个处理 ：
i. 杀真菌草本植物剂 10gm/L 或者 30gm/ 平方米 ) 施加作为浸液并且在 30 天内重 复两次。
ii. 自来水作为对照。
所有小块都每周接受 3 次自来水。收集随机化样品并且记录结果。
结果和讨论
鉴定分离的真菌
对 PDA 培养物在显微镜下并且肉眼鉴定纯真菌培养。鉴定的主要的真菌如下 ：
Rhizoctonia solani， 该疾病通常被称为 “褐色斑点” 和 “大量斑点” 。几片草皮通 常变成浅绿色， 然后黄色， 之后退化为褐色褪色区域。
镰刀霉。它主要是并且常常特征在于橙色 / 褐色斑点和斑点轮廓线。
处理受传染地区
在生长季节期间， 未经处理的症状可能随时显露。草显得淡黄色 ( 萎黄病 ) 和大 规模地变薄， 不规则斑点直径为 1 英尺到超过 20 英尺。匍匐枝常常可以被容易地从土壤提 高因为根系弱。节点可能褪色。淡黄色叶子最终死亡， 和变褐色 ( 图 7 和 8)。
与未经处理的区域相比较， 用杀真菌草本植物剂处理的区块在 30 天内变成青草 颜色没有任何的斑点 ( 图 9 和 10)。
而且， 与从未经处理的对照草地获得的相比， 相比较在 PDA 的平板上从用草本植 物抗真菌剂处理的 16 块草地上载 28℃温育 7 天后没有发现真菌生长 ( 图 11)。
相同的实验延伸到控制紫花苜蓿中的土壤真菌也显示阳性的结果即控制土壤真 菌病原体获得更健康的植物 ( 图 12)。
实施例 10 ： 在黄瓜保护培养中生物控制土壤真菌
进行该研究确定草本植物材料混合物在温室中抵抗土壤真菌的杀真菌剂活性， 所 述草本植物材料混合物在溶液中按 (w/v) 百分比由下列构成 ： 0.1％茴芹和均为 0.25％的 骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香。结果已经与生物制剂处理真菌 Trichoderma harzianum 和 绿色木霉相比较。
方法
塑料温室
在 三 个 塑 料 温 室 8mx40m 中 制 备 3 个 砂 底 座 以 种 植 黄 瓜 杂 种 F1 种 子 Miracle(Brusima) 的农作物， 8 行， 每行 80 株植物持续 3 个月。在温室中安装处理后和高 抗拉线框架系统， 8 排保护线用于支撑黄瓜 7.5 英尺的高度。 这允许在温室中八行黄瓜具有 总共 640 株植物。温室被涂覆单层 6 密耳聚乙烯塑料并且具有现有的加热和冷却能力。
处理
1. 真 菌 木 霉 素 属 处 理 ： 混 合 150gm NIPROTtm( 绿 色 木 霉 或 者 Trichoderma harzianum 的每一种 ) 和 10kg 充分水分解的农家肥料 (FYM)， 并且在聚乙烯覆盖下荫凉中 保持 12 天。每隔 3 天翻转混合物一次， 在 12 天后， 将混合物按照 30g/ 平方米区域平均地 分配， 然后覆盖砂子， 两天后， 按照每行 40 株植物栽种黄瓜种子。
2. 杀真菌草本植物剂 ： 通过成下列量的粉末草本植物和充分地混合在一起来制 备草本植物杀真菌混合物 ： 1Kg 茴芹， 均为 2.5Kg 的骆驼蓬和肉豆蔻和 4Kg 丁香。在种植种 子之前 7 天 ( 种植前 )， 从粉末草本植物干燥混合物取 30gm， 并平均喷洒在 1 平方米的砂区 域， 并充分地混合， 深度 5 厘米， 然后灌溉 3 升自来水。每隔 3 个星期再次施加草本植物杀 真菌混合物 1 次持续 3 个月。FYM 不使用草本植物杀真菌混合物。
3. 对照 ： 仅仅 FYM 被加到土壤。
全部上述三个塑料温室中的植物都被从城市用水资源用水 pH 8.2， 并且观察植物 生长持续 3 个月。在指定时期期间， 观察植物的主要和次生根长度， 生物量， 绿色植物的密 度， 开花时间、 鲜重收率， 枯萎植物的数目， 肥料缺乏和植物根周围的 pH。
结果和讨论
农作物需用大约 3 个月完成生长周期， 其在草本植物杀真菌混合物的情况中， 质 量和大小和收率好的果实是明显的， 在给定收率和时间生产成熟农作物的情况下， 维持该 农作物的成本廉价。 根据我们的结果， 抗真菌草本植物配方是良好的候选用于温室生产， 这 是由于果实和健康植物的高产率 ( 图 13)， 并且显著地优于已知的杀真菌剂 ( 绿色木霉或者 Trichoderma harzianum)， 常规地在农业市场上被用用于土壤真菌的已知的杀真菌剂作为 生物学对照剂表 ( 表 8)， 然而， 腐霉属造成的根腐病和 Fusarium oxysporium 造成的枯萎被 草本植物杀真菌剂明显地从植物处理掉， 这是根据微生物学实验室在 PDA 琼脂平板培养试 验的结果。
表 8. 在塑料温室中黄瓜杂种 F1 种子 Miracle(Brusima) 的培养， 其中所述塑料 TM 温室被 NIPROT ( 绿色木霉或者 Trichoderma harzianum) 和草本植物制剂处理， 所述草本 植物制剂包括 ： (w/v)0.1％茴芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香控制土壤真菌。
在上面描述的方法中， 草本植物杀真菌混合物作为干燥粉末被施加到砂床， 混合 和加水。通过下列获得了相似的结果 ： 首先混合 30gm 草本植物杀真菌混合物 (1Kg 茴芹， 均 为 2.5Kg 的骆驼蓬和肉豆蔻， 和 4Kg 丁香 ) 与 3 升水以获得最终浓度 (w/v)0.1％茴芹， 均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香 ； 每 1 平方米区域灌溉 3 升草本植物混合物溶液 ； 充 分混合草本植物溶液与砂， 达到 5 厘米的深度。
实施例 11 ： 控制温室农作物的土壤疾病
方法
塑料温室
在三个塑料温室 8mx40m 中制备砂基以种植黄瓜杂种 F1 种子 Miracle(Brusima) 农作物， 8 行， 每行 80 株植物， 持续 3 个月的时间段。在温室中安装处理后和高抗拉线框架 系统， 8 排保护线用于支撑黄瓜 7.5 英尺的高度。 这允许在温室中八行黄瓜具有总共 640 株 植物。温室被涂覆单层 6 密耳聚乙烯塑料并且具有现有的加热和冷却能力。
处理
1. 混合 FYM， 按照 30g/ 平方米与砂混合， 两天后栽种黄瓜种子， 每行 80 株植物作 为对照。2. 杀真菌草本植物剂 ： 通过在种植种子之前 ( 种植前 )7 天， 按照 30gm/ 平方米与 砂混合， 施加作为粉末施加草本植物杀真菌混合物 (w/v)0.1％茴芹和均为 0.25％的骆驼 蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香， 然后每三个星期施加 1 次， 持续 3 个月， 不添加有机的和化学肥 料。
全部上述三个塑料温室中的植物都被从城市用水资源用水 pH 8.2， 并且观察植物 生长持续 3 个月。在指定时期期间， 观察植物的主要和次生根长度， 生物量， 绿色植物的密 度， 开花时间、 鲜重收率， 枯萎植物的数目， 肥料缺乏和植物根周围的 pH。
土壤真菌鉴定
收集植物根附近的野外土壤， 所述植物根已知被强烈感染土壤真菌。将需氧平板 计数的标准操作程序与真菌培养基马铃薯右旋糖琼脂 (PDA) 一起使用。将平板在 28℃温 育， 并每天检验， 持续 7 天。选择纯的真菌培养， 并且在显微镜下和肉眼鉴定。
结果和讨论
在 3 个 月 种 植 期 间， 观察到生长在温室草本植物处理的土壤中的杂种 F1Miracle(Brusima) 黄瓜植物非常地健康， 并且比未经处理的植物 ( 图 14(b)(c)) 产生更
高数目的果实 ( 图 14(a))， 从 PDA 获得的结果显示这是由于显著通过草本植物处理破坏真 菌腐霉属和 Fusariumoxysporium( 根腐病和枯萎的原因试剂 )。
也注意到在被草本植物处理的处理土壤上生长的黄瓜植物中开花时间比在相同 的条件下在通过 FYM 处理的土壤上生长的相同的植物早 7 天。而且， 他们也更早显示出充 足的发育中果实球 ( 图 14a)， 其中似乎缺乏草本植物配方的土壤已经引起延长的时间用于 开花和结果实。通常， 未经处理的草本植物制剂土壤显示较少的发育中的果实球。
35 天后， 在富含草本植物配方的温室土壤中植物长度更长平均 120 厘米， 然而， 在 FYM 富集土壤中， 植物长度平均为 95 厘米 ( 图 15A 和 B)。
在草本植物配方处理的土壤温室中， 观察到的死植物数量仅仅为 2( 图 16A)， 相比 在 FYM 富集土壤中死了 25 个植物 ( 图 16B)。
果实增产大约 37％ ( 鲜重 2.55 公斤 / 植物 )， 相比而言在 FYM 富集土壤中植物收 率生长为 1.85 公斤 / 植物 ( 图 17A 和 B)。
从上述实验， 似乎茴芹、 骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香的草本植物混合物除它的杀真菌和 杀线虫活性之外， 与 FYM 相比， 其已经介导很好地提高植物生长和产生可观量的果实。
另一方面用草本植物混合物处理的土壤 pH 值达到 5.9( 酸性土壤 )， 与 FYM pH 8.24( 碱性土壤 ) 相比水平降低了 2.34pH。为大家所熟知的是 pH 水平影响养料至植物有 效性可利用性和植物增长的类型。 有些植物爱好大量铁， 当土壤碱度增强时， 该微量元素变 成不太对植物有用。 这些植物倾向更酸性的土壤， 其中铁游离可利用的， 否则他们的叶子在 叶脉之间将变得黄色。
全部植物需要主要养料 ( 氮、 磷和钾 ) 以及次要或者微量养料例如镁、 铜、 铁、 锰和 许多其它微量元素的平衡。
根据在 Al Dhaid Research Center UAE 进行的化学分析， 显然草本植物混合物 包含全部主要和次要肥料， 其中有机覆盖物显著的百分数为 94.68％， 然而 FYM 为 50-55％ ( 表 9)。因此， 草本植物混合物是作为土壤调节剂以为植物补充重要的养料。除了草本植 物处理的土壤的 pH 水平大约为 5.9 外， 其可能完美地影响养料的可利用性并且为农作物增 值和减少肥料和杀虫剂的全部使用， 同时土壤变得更健康和均衡。
表 9. 草本植物混合物和农家肥料 (FYM) 的化学分析。
似乎在本发明中介绍的草本植物混合物， 除了它具有抗真菌和抗线虫活性外， 它 还具有完美的化学营养平衡以增强土壤肥沃用于有机培育者， 以在他们的农场用于代替化
学肥料， 并且它已经加快花生产 7 天， 并且果实收率增加超过 FYM37％， 因此这个现象可用 于促进良好的时间控制收获农作物和使他们长时间保持在市场上并且有较少的竞争， 这是 有前途的商业优点超过其它的化学肥料， 这些化学肥料会破坏土壤健康和营养平衡以及对 任何动物具有坏的健康影响。
实施例 12 通过杀真菌草本植物剂控制海枣黑色枯萎真菌
实施研究以确定草本植物材料混合物的杀真菌剂活性以控制影响海枣树的黑色 枯萎疾病， 所述草本植物材料混合物按照溶液百分数 (w/v) 由下列构成 ： 0.1％茴芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香。
黑色枯萎疾病症状
黑色枯萎也称为 Medjnoon 或者 Fool 疾病由 Ceratocystis paradoxa(Hohn) 所引 起， 其是 Thielaviopsis paradoxa 的完美形式。
Thielaviopsis paradoxa 是机会致病菌的二次病原物攻击受应力的树 ( 在严重 干旱、 热风和盐分条件下生长 )， 在海枣上产生的症状类似于果穗脱色病症以及引起顶芽枯 萎、 黑色枯萎和弯头疾病 (Karampour 和 Pejman2007)。
该疾病已经从许多经济重要的农作物生长区域被报道在严重条件下对海枣 树 (Phoenix dactylifera)、 油 棕 (Elaeis guineensis)、 桃 棕 (pejibaye， Bactris gasipaes)、 菠萝、 甘蔗 (Saccharumofficinarum L.) 造成严重损失， 以及发现在美国东部， 在枫树和鹅掌楸中造成疾病。 直到目前为止， 通常遵循设置用杀真菌剂处理用于它的处理。但是需要设计非化 学控制方法减少毒性的化学制品对环境特别是海枣树及其他重要的农作物生态系统的毒 性副作用。
在海枣树中， 症状通常表示为四种清楚的形式 ： 在全部年龄的棕上叶片上黑色枯 萎、 开花枯萎病， 核心或者树干枯萎和芽枯萎。感染的全部特征在于局部至完全组织坏死。 典型的损害是棕褐色至黑色、 深炭色和大量地使得叶柄、 果实线和果梗成为枯萎、 炭状的外 观。腐坏是最严重的， 因为它打击顶芽和核心导致棕死亡。
良好卫生设备是控制黑色枯萎的第一步。 受影响的叶子、 叶根和花序应该被修剪、 收集和立即灼烧。修剪切割和周围组织应该通过喷射波尔多液、 石灰 - 硫磺溶液、 硫酸铜石 灰混合物、 二氯萘醌、 秋兰姆或者任何的新式的基于铜的杀真菌剂保护。在严重攻击之下， 受影响的棕将被除去和烧掉。
材料和方法
接种体制备
在本发明中使用的真菌 Thielaviopsis paradoxa 是分离自超过 20 个受影响树的 无性繁殖和生殖组织， 所述树来自 Northern Emirates 的数个地区 (Al-Dhaid and Ras-El Khaima， UAE)。收集的患病材料在流动的自来水中被彻底清洗， 并且通过浸在 0.1％氯化汞 溶液中 3 分钟和在无菌水中漂洗两次对表面进行灭菌。这样的灭菌材料被切成为小块 ( 长 度 0.5-1 厘米 )， 无菌滤纸之间干燥然后栽种在马铃薯右旋糖琼脂培养基上 (PDA ； Difco)。 在 28 ℃孵育平板 3-7 天， 每天检验霉菌生长的发生。通过菌丝尖头或者单孢分离技术 (Hildebrand， 1938 ； Domsch 等人， 1980) 进行所得到霉菌生长的纯化， 并在 PDA 斜面上维持 纯培养。显微镜下检验和鉴定分离的真菌 (Ellis， 1971)。
体外评价草本植物抗黑色枯萎真菌效率
通过空气干燥清洁干燥茴芹 ( 大茴香 )、 骆驼蓬 (harmala)、 肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 丁香 ( 丁香 ) 荚除去灰尘。分别在搅拌器中粉末化清洁的草本植物材料。然后将按照 (w/ v) 的 0.1％茴芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香粉末混合添加到 PDA 中， 浓 度如下 ： 0.2、 0.5、 0.75、 1 和 2％， 在 121℃高压消毒 20min。将草本植物混合物培养基冷却 至大约 45℃， 充分混合， 并快速分配至 20ml， 在灭菌的一次性陪氏培养皿， 并允许内含物在 室温下固化。
将来自 PDA 上 7 天培养的黑色枯萎真菌接种体 0.5X 0.5 平方厘米放置在 PDA 中 心上， 所述 PDA 补充有草本植物。反转陪氏培养皿并在 28℃下孵育 7 天。另外， 如同上面描 述的， 为没有草本植物粉末的 PDA 平板接种黑色枯萎真菌作为对照试验。在 PDA 上， 有和没 有草本植物粉末， 对于各真菌重复 5 次。
术语 “生长” 以特定含义在本文中使用， 即表明有生存力的真菌的存在和推测增 殖。继温育之后， 计算霉菌生长直径 (cm) 以及计算群体大小利用 Gorbushina(1997) 试验 数据
野外试验 用草本植物混合物的水溶液处理四个感染 Thielaviopsis paradoxa 的海枣树所 述草本植物混合物水溶液是根据实施例 9 制备的， 即 1％ (w/v)(10gm/L) 的混合 0.1％茴芹 和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香， 通过在树的核心和受感染的部分进行倾倒 和湿润方法。 而且， 通过自来水处理两个感染 Thielaviopsis paradoxa 的海枣树作为对照。 在一个月内重复处理两次 ( 每 15 天一次 )， 对树进行观测， 并在 30 天后， 收集样品用于在 PDA 上真菌筛选。
结果
实验室试验
真菌 Thielaviopsis paradoxa 分离自真菌感染的海枣树组织比如仅仅花梗、 束和 肉茎， 并且根据形状和生长特征进行纯化和鉴定。
为了研究选定的草本植物材料抑制 Thielaviopsis paradoxa 真菌的性质， 进行一 系列实验评价动力学， 浓度为 0.1、 0.25、 0.5、 0.75 和 1％的混合物， 所述混合物包括在所使 用的条件下， 暴露于 PDA 而没有草本植物材料的 Thielaviopsis paradoxa 的平均真菌生存 率作为对照， 其被与添加不同浓度 0.2、 0.5、 0.75 和 1％的混合物的 PDA 进行比较， 所述混 合物包括 0.1％茴芹 ( 大茴香 ) 和均为 0.25％的骆驼蓬 (harmala) 和肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 0.4％丁香 ( 丁香 )。菌落直径， 营养区域的尺寸和草本植物材料在 PDA 上的进料量用于确 定可以用来抑制单个真菌菌落生长的草本植物材料。这个试验测量真菌抑制的速度， 通过 测定菌落直径 (mm)， 所述菌落在暴露于补充一定浓度草本植物材料的 PDA 后仍存活。在所 使用的条件下， 暴露于 PDA 而没有草本植物材料的 Thielaviopsis paradoxa 的平均真菌生 存率作为对照， 其被与添加不同浓度 0.2、 0.5、 0.75 和 1％的混合物的 PDA 进行比较， 所述混 合物包括 0.1％茴芹 ( 大茴香 ) 和均为 0.25％的骆驼蓬 (harmala) 和肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 0.4％丁香 ( 丁香 )( 表 10)。
表 10. 在补充有的不同百分浓度的粉末混合草本植物材料的 PDA 上在 28℃生长 7- 天后， Thielaviopsis paradoxa 的菌落直径 (mm)， 重复 5 次的平均值， 所述粉末混合草
本植物材料包括结果显示超过 0.25％浓度的混合草本植物材料 ( 由 0.1％茴芹 ( 大茴香 ) 和均为 0.25％的骆驼蓬 (harmala) 和肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 0.4％丁香 ( 丁香 ) 构成 ) 针对 黑色枯萎真菌 Thielaviopsis paradoxa 具有显著的抗真菌活性。
结果显示超过 0.25％浓度的混合草本植物材料 ( 由 0.1％茴芹 ( 大茴香 ) 和均为 0.25％的骆驼蓬 (harmala) 和肉豆蔻 ( 肉豆蔻 ) 和 0.4％丁香 ( 丁香 ) 构成 ) 针对黑色枯 萎真菌 Thielaviopsis paradoxa 具有显著的抗真菌活性。
用草本植物混合物 (0.1％茴芹， 均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4％丁香 ) 处 理的样品和用不包含草本植物材料处理的那些之间的抗真菌活性差异是显著的。
实验区域
从表 10 中所提供的结果看， 在试验区域， 浓度 1％的混合物水溶液 ( 包括 0.1％ 茴芹和均为 0.25 ％的骆驼蓬和肉豆蔻和 0.4 ％丁香 ) 发现非常有效抑制在海枣树上 Thielaviopsis paradoxa 的菌丝生长， 并且显著优于所有其他所评价的浓度。
通过 1％ w/v 草本植物杀真菌水溶液 (0.1％茴芹和均为 0.25％的骆驼蓬和肉豆 蔻和 0.4％丁香混合物 ) 每 15 天施加一次持续 1 个月处理海枣树， 结果与未经处理的树相 比是显著的 ( 对照 ； 图 18)。来自 PDA 的结果显示草本植物杀真菌剂水溶液在枣椰树的全 部部分杀死 Thielaviopsis paradoxa 的真菌菌丝生长， 如图 18 所述的。而且， 示于海枣树 核心的新生健康叶片与未经处理的树相比较， 黑色枯萎和弯头疾病在海枣树上的症状 ( 图 18) 损害海枣收率的数量和质量。
实施例 13 ： 草本植物制剂的抗白蚁活性
这个实施例阐明草本植物制剂作为白蚁防治试剂的用途。
材料
草本植物制剂
0.3％茴芹和均为 0.1％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香
通过两个方法评价草本植物控制白蚁的性能。
方法 1
将 15 平方米寄生土栖白蚁的苗圃土地 (800 白蚁 / 平方米 ) 等分成 3 等份。
第一个等份通过混合 1 公斤草本植物制剂粉末与 50 升盆土壤并分配在寄生的区 域进行处理。
第二等份通过商业的化学制品抗白蚁化合物 Dursban 40C 进行处理， 通过混合 1 升 Dursban 40C 与 50 升盆土壤并分配在寄生的区域来进行。
第三等份仅仅用 50 升盆土壤进行处理， 作为对照。
检查并记录每天死的白蚁数目持续 3 天。
结果
如表 11 所示， 结果表明包含 0.3％茴芹和均为 0.1％的骆驼蓬、 肉豆蔻和丁香的草 本植物制剂在 3 天后与通过 Dursban 40C 的化学处理具有相同的相同的控制白蚁效果。
表 11. 在通过草本植物制剂和化合物处理的区域与对照未经处理的区域相比死 白蚁的百分数
处理 对照， 未经处理的 草本植物制剂 Dursban 40C
8hrs 0.00 15％ 20％24hr 0.00 35％ 45％48hr 0.00 78％ 86％72hr 0.00 100％ 100％方法 2
实施这个实验以确定草本植物制剂针对湿木白蚁 Porotermesadamsoni 和干木白 蚁 Incisitermes minor 的效力， 所述白蚁在 Dubai 的局部区域影响房子的门和木头。这 些住宅被白蚁占据的情况从包括下述的症状是明显的 ： 洞、 浅棕色破裂和昆虫集群 (2500 个 )。另外， 注意到许许多多飞虫。
受传染地区的裂缝和洞被喷雾草本植物制剂的水溶液， 通过混合 1Kg 粉末草本植 物制剂与 50 升水。其它的洞和裂缝被喷雾抗白蚁化合物 Dursban 40C 的水溶液， 通过混合 1 升 Dursban 40C 与 50 升水。
检查并记录每天裂缝颜色和死的白蚁数目持续 3 天。
结果
根据裂缝的颜色和死的白蚁百分数， 结果表明化合物 Dursban 40C 和草本植物制 剂在白蚁症状方面具有相同的性能， 抵抗影响门和树木的湿木白蚁 Porotermes adamsoni 和干木白蚁 Incisitermes minor。 用化学试剂和草本植物制剂处理裂缝在 3 天后棕褐色变 为黑色， 与未经处理的裂缝相比较 3 天后， 估计 100％白蚁死亡。
结论
本发明的草本植物混合物进一步可以作为控制白蚁的有效制剂。 与化学处理匹配 的效率已经被证明能够抵抗多种白蚁包括地下白蚁、 湿木白蚁和干木白蚁。
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