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一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法与流程

花匠小妙招
2024-11-11 08:47

1.本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法。

背景技术：

2.金花茶为山茶科(theaceae)山茶属(camellia)常绿灌木或小乔木，是中国特有的珍稀植物资源。金花茶是山茶花中唯一具有黄色花的类群，花瓣金黄、蜡质、肥厚，观赏价值极高。此外，金花茶的花朵富含茶多糖、茶多酚和类黄酮等，具有很好的保健作用。
3.植物多倍体具有形态巨大，代谢物含量高和抗逆性强等特点。多倍体选育被广泛应用于植物种质创新。其中，通过2n配子诱导和杂交获得三倍体综合了倍性效应与杂种优势，通过一次育种过程可实现多目标性状综合改良，是植物新种质创制的重要途径。目前，通过2n花粉诱导和杂交选育三倍体已在杨树、柑橘和柿等植物上获得成功。
4.2n花粉诱导主要采用化学方法(如秋水仙碱诱导)和物理方法(如异常温度诱导)。关于山茶花的2n花粉诱导，前人采用秋水仙碱对杜鹃红山茶花粉开展了诱导研究。王有兵等(王有兵，徐斌，张方秋，等.杜鹃红山茶2n花粉自然发生及其诱导初步研究[j].林业与环境科学，2011，27(6)：9-15)的观测表明杜鹃红山茶的2n花粉自然发生比例仅为0-1.81％，采用秋水仙素棉浸处理后2n花粉最高得率也仅为16.57％。贾文庆(贾文庆.山茶花生殖生物学及倍性育种基础研究[d].2015)采用秋水仙碱诱导杜鹃红山茶花芽，其大花粉诱导率虽然最高达到40.30％，但由于秋水仙碱的毒害作用大，花芽存活率仅为2.66％，且生长速度减慢，散粉时间推迟。
[0005]
高温作为一种行之有效的物理诱变途径，已成功应用于木本植物如杨树和杜仲等的花粉染色体加倍诱导，并获得了数以百计的多倍体新种质，是木本植物多倍体育种的重要手段。处理温度，有效处理时期以及持续处理时间是影响2n花粉得率的重要因素。在以往建立的高温诱导花粉染色体加倍的技术中，不同树种的花芽处理温度、有效处理时期和持续处理时间等关键技术环节不尽相同。
[0006]
目前，关于高温诱导山茶花花粉染色体的加倍尚未见报道。对于一个具体树种而言，选择适宜的处理温度、有效处理时期和持续处理时间至关重要，决定着高温诱导花粉染色体加倍的成败。与杨树和杜仲等的花不同，金花茶的花大，花瓣多且肥厚，呈蜡质。以现有技术中公开的温度和时间对金花茶花芽进行加温处理，当温度较低时2n花粉比率低，而当温度升高或处理时间延长时则花芽存活率低或花粉发育不良无法正常散粉，难以应用于金花茶三倍体育种实践。

技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种高花芽存活率和散粉量，以及高2n花粉比率和活力的诱导金花茶花粉染色体加倍的方法。
[0008]
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法，所述方法包括如下步骤：选择金花茶植株上的花芽，对花芽进行梯度加温处理，梯度加
温分为两阶段，第一阶段加温温度为36-40℃，第二阶段加温温度为41-45℃。
[0009]
本发明通过对金花茶花芽进行梯度加温处理，可以阻断幼龄花芽中花粉母细胞减数分裂过程中纺锤丝的形成和牵引，诱导花粉染色体加倍，从而获得高比率的2n花粉。
[0010]
在上述的一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法中，梯度加温分为两阶段，第一阶段加温温度为38℃，第二阶段加温温度为43℃。处理温度是影响2n花粉得率的重要因素，金花茶的花瓣多且肥厚，本发明第一阶段采用较低的温度38℃进行加温使整个花芽进入预热状态，第二阶段再采用较高的温度43℃处理诱导花粉染色体加倍。相较于采用恒温处理，梯度加温既能有效地诱导金花茶花粉染色体加倍，又能减轻高温对花芽的伤害，从而在获得高比率高活力2n花粉的同时保持高的花芽存活率和散粉量。
[0011]
在上述的一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法中，第一阶段加温时间为0.5-1.5h。
[0012]
作为优选，第一阶段加温时间为1h。
[0013]
在上述的一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法中，第二阶段加温时间为1-3h。
[0014]
作为优选，第二阶段加温时间为2h。
[0015]
本发明中持续处理时间也是影响2n花粉得率的重要因素，时间短诱导效果不明显，而时间过长则影响花芽的存活和花粉的正常发育。
[0016]
在上述的一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法中，花芽直径为0.4-1.0cm。
[0017]
优选为0.5-0.6cm。直径为0.5-0.6cm的花芽，其花粉母细胞减数分裂以终变期至中期ⅰ为多。由于花芽大小的个体差异，以及花粉母细胞发育的不同步性，因此本发明中花芽直径为0.4-1.0cm，优选为0.5-0.6cm。
[0018]
在上述的一种诱导金花茶花粉染色体加倍的方法中，花芽中花粉母细胞处于减数分裂终变期至中期ⅰ。高温诱导花粉染色体加倍的原理在于，花粉母细胞减数分裂期间，高温的直接作用会阻断纺锤丝的形成和牵引，使已复制的染色体不能走向两极，从而形成加倍核。花粉母细胞减数分裂进程与花芽形态特征有较强的相关性，可以通过观察花芽大小推定减数分裂进程。
[0019]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020]
1.本发明通过对花芽进行两阶段的梯度加热获得高比例且高活力的2n花粉，可直接用于授粉，从而提高三倍体杂交后代的出现几率。
[0021]
2.本发明通过控制加温处理的温度和时间，使得金花茶花芽经过诱导后2n花粉比率可达到65.1％，2n花粉萌发相对保持率可达到80.2％，花芽存活率可达到91.5％，单朵花散粉量可达到80.9mg。
[0022]
3.本发明方法相比于对山茶花花芽进行秋水仙碱诱导，该方法不仅安全便捷，毒害作用小，而且花芽存活率高，诱导效率高。
[0023]
4.本发明方法相比于对山茶花花芽进行恒温诱导，该方法不仅诱导效率高，而且花芽存活率高，散粉量大。
[0024]
5.本发明方法重复性好，操作简单，可高效实现金花茶花粉染色体加倍，为深入开展金花茶倍性育种奠定基础。
附图说明
[0025]
图1为实施例1中经过诱导获得的金花茶(c.nitidissima)花粉。
[0026]
图2为实施例2中经过诱导获得的中东金花茶(c.achrysantha)花粉。
[0027]
图3为对比例1中未经诱导的金花茶花粉。
[0028]
图4为对比例2中未经诱导的中东金花茶花粉。
[0029]
图5为对比例3经过诱导获得的金花茶花粉。
[0030]
图6为对比例7经过诱导获得的金花茶花粉。
具体实施方式
[0031]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0032]
实施例1：
[0033]
花芽的选择：以二倍体金花茶(c.nitidissima)为试材，于2020年1月选择健壮植株上直径为0.5cm的健康花芽；
[0034]
2n花粉的诱导：对花芽进行梯度加温处理，第一阶段处理温度为38℃，持续处理时间为1h，第二阶段处理温度为43℃，持续处理时间为2h。
[0035]
实施例2：
[0036]
花芽的选择：以二倍体中东金花茶(c.achrysantha)为试材，于2020年1月选择健壮植株上直径为0.5cm的健康花芽；
[0037]
2n花粉的诱导：对花芽进行梯度加温处理，第一阶段处理温度为38℃，持续处理时间为1h，第二阶段处理温度为43℃，持续处理时间为2h。
[0038]
实施例3：
[0039]
花芽的选择：以二倍体金花茶为试材，于2020年1月选择健壮植株上直径为0.5cm的健康花芽；
[0040]
2n花粉的诱导：对花芽进行梯度加温处理，第一阶段处理温度为36℃，持续处理时间为0.5h，第二阶段处理温度为41℃，持续处理时间为1h。
[0041]
实施例4：
[0042]
花芽的选择：以二倍体金花茶为试材，于2020年1月选择健壮植株上直径为0.5cm的健康花芽；
[0043]
2n花粉的诱导：对花芽进行梯度加温处理，第一阶段处理温度为40℃，持续处理时间为1.5h，第二阶段处理温度为45℃，持续处理时间为3h。
[0044]
实施例5：
[0045]
与实施例1的区别，仅在于，花芽第一阶段加热时间为2h。
[0046]
实施例6：
[0047]
与实施例1的区别，仅在于，花芽第二阶段加热时间为4h。
[0048]
对比例1：
[0049]
与实施例1的区别，仅在于，花芽未进行加热处理。
[0050]
对比例2：
[0051]
与实施例2的区别，仅在于，花芽未进行加热处理。
[0052]
对比例3：
[0053]
与实施例1的区别，仅在于，花芽未采用梯度加热，以恒温38℃，加热时间为3h。
[0054]
对比例4：
[0055]
与实施例1的区别，仅在于，花芽未采用梯度加热，以恒温43℃，加热时间为3h。
[0056]
对比例5：
[0057]
与实施例1的区别，仅在于，花芽未采用梯度加热，以恒温46℃，加热时间为2h。
[0058]
对比例6：
[0059]
与实施例1的区别，仅在于，花芽第一阶段加热温度为30℃。
[0060]
对比例7：
[0061]
与实施例1的区别，仅在于，花芽第二阶段加热温度为46℃。
[0062]
待实施例1-6和对比例1-7处理的花芽开放时，统计存活的花芽数，计算花芽存活率。花芽存活率(％)＝存活的花芽数/处理的花芽总数
×
100。收集并称量单朵花的散粉量(mg)。
[0063]
取花粉于光学显微镜下观察统计2n花粉比率。2n花粉比率(％)＝2n花粉数/花粉总数
×
100。同时，分别取诱导处理花芽上的花粉和未经处理花芽上的正常花粉，于添加10％蔗糖和0.01％硼酸的培养液中培养9h，用吸管吸取带花粉的培养液于载玻片上，于光学显微镜下观察统计花粉萌发情况。2n花粉萌发率(％)＝萌发的2n花粉数/2n花粉总数
×
100。2n花粉萌发相对保持率(％)＝2n花粉萌发率/未经处理花芽上正常花粉萌发率
×
100。
[0064]
表1：实施例1-6、对比例1-7的花芽存活率、单朵花散粉量、2n花粉比率、2n花粉萌发相对保持率统计结果
[0065]
[0066]
图1为实施例1中经过38℃，1h和43℃，2h梯度加温诱导获得的金花茶花粉；图2为实施例2中经过38℃，1h和43℃，2h梯度加温诱导获得的中东金花茶花粉；图3为对比例1中未经诱导的金花茶花粉；图4为对比例2中未经诱导的中东金花茶花粉；图5为对比例3中经过恒温38℃处理3h获得的金花茶花粉；图6为对比例4中经过恒温43℃处理3h获得的金花茶花粉。从图1-图6可以看出，经过38℃，1h和43℃，2h梯度加温诱导获得的花粉中2n花粉比率高，而未经诱导获得的花粉中未出现2n花粉；经过恒温38℃处理3h获得的花粉中2n花粉比率低，而经过恒温43℃处理3h获得的花粉中部分花粉发育不正常。
[0067]
从上述结果可知，本发明通过控制温度和时间，对花芽进行两阶段的梯度加温，获得高比例且高活力的2n花粉，2n花粉比率高达65.1％，萌发相对保持率可达到80.2％。同时，花芽存活率高(91.5％)，散粉量大(80.9mg/花)。
[0068]
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
[0069]
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0070]
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。