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海南五指山美花兰根部内生真菌多样性及其促生长作用研究

花匠小妙招
2024-11-12 17:13

兰科(Orchidaceae)植物是可与真菌形成典型共生关系的特殊类群,这种特有的共生关系对兰花在自然条件下的生存至关重要。内生真菌可促进种子萌发,为兰科植物提供所需的营养,促进兰科植物的生长发育。因此从内生真菌的角度来研究兰科植物十分必要。美花兰(Cymbidium insigne)为海南特有物种,是国产稀有大花兰种类,为大花蕙兰杂交育种的主要原生种之一,是不可多得的兰属杂交育种材料,具有极为重要的保护和开发利用价值。为进一步加强美花兰保育研究,本研究以海南五指山野生美花兰为材料,对野生美花兰根部的真菌进行分离,运用传统形态学分析对其进行鉴定；利用rDNAITS技术对所分离的菌株进行遗传多样性分析,并与形态观察结果结合分析,确定其基本分类地亿从不同C源、N源及温度试验的角度,了解所得菌株的部分生物学特性；与文心兰组培苗共生,筛选与美花兰有效共生并能明显促进其生物量增长的优良菌株。主要研究成果如下：1.确定了美花兰根部内生真菌分离的最适消毒方法。以海南省五指山野生美花兰(Cymbidium insigne)作为试验材料,对相似生境不同海拔(1659～1805米)的美花兰植株根部的内生真菌进行分离。75%酒精表面消毒30 s,0.1%升汞溶液消毒4 min、6 min、8min,无菌水冲洗4-5次。不同消毒方法共分离到21类132株内生真菌,表面消毒4 min分离的菌株种类和数量最多,为14属55株,表面消毒6 min分离的菌株为12属33株,表面消毒8 min分离的菌株为13属44株,其中以表面消毒4mmin分离的菌株种类和数量最多。2.利用r DNA ITS技术对所分离的菌株进行遗传多样性分析,将形态学鉴定结果与r DNA ITS序列分析结果相结合,确定菌株的分类地位。共分离到内生真菌132株,确定为14属,隶属于半知菌类的Pestalotiopsis 5株,Aspergillus 16株,Penicillium 27株,Trichoderma13株,Cylindrocarpon16株,Curvularia 4株,Nigrospora 3株；Nodulisporium 11株,子囊菌门的Chaetomium 1株,Pezicula 1株,Veonectria 6株,Cryptosporiopsis 6株；担子菌门的Tulasnella 9株；Ascomycete sp.9株。5株菌经诱导未见产孢,其ITS序列与GeneBank中的序列相似性较低,暂不能确定其分类地位,其中有些可能是新的属或种。3.菌株的生物学特性研究。在C源试验中,W3-2和W4-1在以淀粉为C源的培养基上不长。W2-1、W3-2及W4-1在以葡萄糖为C源时生长较快,W2-2、W5-1在以甘露醇为C源时生长较快,W2-3和W7-1在以蔗糖为C源时生长较快,W2-5在以果糖为C源时生长较快,W3-1在以淀粉为C源时生长较快,W2-4、W2-6、W3-3、W3-4、W4-2、W6-1、W7-3、W6-3、W6-4和W7-2在以为麦芽糖C源时生长较快,W6-5在以果糖为C源时生长较快,W6-6在以蔗糖和麦芽糖为C源时生长较快。N源试验中,W2-1以在大豆为N源时生长最快；W2-2、W2-3、W4-1及W7-2以玉米为主要N源；W2-5以在天冬酰胺为N源时生长较快；W2-4、W2-6、W4-2、W7-1、W6-1、W5-1和W3-3以蛋白胨为主要N源；W3-2、W6-5、W3-4、W7-3以在硫酸钱为N源时生长较快；W6-3、W6-6在以天冬酰胺为N源时生长较快,与其它培养基上的生长情况相差不大；W3-1、W6-4以牛肉浸膏为N源时生长较快。可见,所分离的内生真菌大部分以蛋白胨为主要N源,其次是天冬酰胺。在温度试验中,相同菌株在不同温度、不同菌株在相同温度下生长都存在较大差异。W2-2、W2-3、W2-6、W3-2、W3-3、W4-2及W6-5在26℃时生长最陕；W2-4、W2-5在26℃-28℃时生长最快；W3-1、W3-4及W6-6在20～26℃都可获得最快生长率；W4-1、W4-2、W5-1、W6-1、W6-3、W6-4、W7-3最适生长温度为20℃；W7-2的最适生长温度为26～30℃。除W7-2菌株外,其余菌株在35℃时均不生长。4、内生真菌与文心兰组培苗的共生培养中,植株生长状况较差。在重分离试验中,重分离到W6-4菌株。