利用宏基因组技术筛选鉴定酯酶及其酶学性质研究

• 花匠小妙招
• 2024-11-13 01:50

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第一章文献综述

1．1酯酶

1．1．1酯酶的来源及理化性质

1．1．2酯酶的分类

1．1．3酯酶的克隆表达

1．1．4动力学模拟研究酶催化过程

1．1．5酯酶的结构及催化机理

1．1．6酯酶的应用

1．2宏基因组技术

1．2．1宏基因组技术的产生和概述

1．2．2宏基因组文库的筛选方法

1．2．3宏基因组技术筛选酯酶的研究进展

1．3选题依据

第二章功能筛选土壤宏基因组中的酯酶基因

2．1实验材料

2．1．1菌株与载体

2．1．2培养基

2．1．3酶及生化试剂

2．1．4常用溶液的配制

2．1．5仪器设备

2．1．6其他实验耗材

2．2实验方法

2．2．1阿魏酸酯酶阳性克隆子筛选

2．2．2阳性克隆子亚克隆及亚克隆筛选

2．2．3测序与生物信息学分析

2．3结果与分析

2．3．1酯酶阳性克隆子平板初筛

2．3．2酯酶阳性克隆子HPLC复筛

2．3．3质粒酶切及转化

2．3．4生物信息学分析

2．4讨论

2．5本章小结

第三章酯酶的异源表达与纯化

3．1实验材料

3．1．1菌株与载体

3．1．2培养基

3．1．3酶及生化试剂

3．1．4重组蛋白亲和层析试剂配制

3．1．5聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂配制

3．1．6仪器设备

3．1．7其他耗材

3．2实验方法

3．2．1重组质粒构建

3．2．2重组质粒转化

3．2．3重组蛋白纯化及SDS-PAGE验证

3．2．4点突变实验验证催化三联体

3．2．5使用AKTA测定天然蛋白聚合度

3．3结果与分析

3．3．1重组质粒构建及转化

3．3．2重组蛋白诱导表达及纯化

3．3．3定点突变

3．3．4天然DLFae4聚合度分析

3．4讨论

3．5本章小结

第四章酯酶DLFae4的酶学性质表征

4．1实验材料

4．1．1化学试剂

4．1．2溶液配制

4．1．3仪器设备

4．2实验方法

4．2．1不同pH值对DLFae4活性和稳定性的影响

4．2．2不同温度对DLFae4活性和稳定性的影响

4．2．3不同金属离子对DLFae4活性的影响

4．2．4不同有机试剂对DLFae4活性的影响

4．2．5不同表面活性剂对DLFae4活性的影响

4．2．6DLFae4对不同链长对硝基苯酯底物的酶动力学

4．2．7DLFae4对不同羟基肉桂酸甲酯底物的酶动力学

4．2．8DLFae4对不同内酰胺底物的酶动力学

4．2．9DLFae4对邻苯二甲酸酯降解实验

4．3结果与分析

4．3．1 不同pH值对DLFae4活性的影响

4．3．2不同pH值对DLFae4稳定性的影响

4．3．3不同温度对DLFae4活性的影响

4．3．4不同温度对DLFae4稳定性的影响

4．3．5不同金属离子对DLFae4活性的影响

4．3．5不同有机试剂对DLFae4活性的影响

4．3．6不同表面活性剂对DLFae4活性的影响

4．3．7DLFae4对不同底物的酶动力学常数

4．3．8 DLFae4对邻苯二甲酸酯的降解

4．4讨论

4．5本章小结

第五章酯酶DLFae4分子动力学模拟

5．1操作系统与软件

5．1．1操作系统

5．1．2软件

5．2分子动力学模拟

5．2．1准备酶与底物分子PDB文件

5．2．2酶与底物分子柔性对接

5．2．3酶与底物相互作用分子动力学模拟

5．3结果与分析

5．3．1残基与配体相互作用示意图

5．3．2蛋白在水溶液体系中的示意图

5．3．2能量最小化和平衡过程示意图

5．3．3计算两原子距离

5．3．4主要参数的均方根偏差

5．3．5平均短程库仑势与兰纳-琼斯势

5．4讨论

5．5本章小结

全文结论

参考文献

附录

致谢

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