除虫菊CDS
除虫菊CDS_CCI2基因的克隆、功能分析及遗传转化体系建立
植物萜类物质在呼吸作用、光合作用、生长与发育等生理生化过程起着重要的作用。菊科植物中存在大量的萜类物质，并具有重要的药用价值。各种萜类次生物质的合成在细胞内主要有两种经典的途径：甲羟戊酸（MVA）途径和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径。除虫菊酯，一种存在于除虫菊的天然萜类物质，具有高效的杀虫活性，由两种酸（菊酸和除虫菊酸）和三种酮醇（除虫菊酮醇、瓜叶菊醇和茉莉酮醇）经酯化作用形成结构六个不规则的单萜组分组成。除虫菊酯中的酸类物质是经MEP途径发生苯丙环反应生物合成，而酮醇是由起始物源于亚麻酸的羟脂（Oxylipin）途径合成。目前除了固醇和类胡萝卜素外，对不规则类异戊二烯生物合成的分子机制的研究很少。2001年首次在除虫菊中发现菊酰焦磷酸合成酶（CDS），Rivera等证实CDS催化两分子DMAPP聚合成菊酸是生物合成除虫菊酯反应的第一步，但对其调控除虫菊酯生物合成的分子机制尚不明确。因此，本研究从除虫菊花蕾中分离了除虫菊酯生物合成途径中的关键酶CDS_CCI2基因；通过亚细胞定位、时空表达模式、胁迫处理、转基因分析、VIGS技术等对CDS_CCI2基因功能进行了研究，初步建立了CDS_CCI2基因在除虫菊代谢中的调控模型；同时建立了除虫菊的高效遗传转化体系，为深入阐明除虫菊酯生物合成的分子机制奠定了重要的理论基础。主要研究结果如下：1、以除虫菊cDNA为模板，通过PCR技术克隆得到除虫菊CDS_CCI2基因并测序验证，该基因包含1,188bp的开放阅读框，编码395个氨基酸（GenBank登录号No.HQ235057）。系统进化树分析表明，该基因属于除虫菊CDS家族。2、构建CDS_CCI2基因与GFP报告基因相融合的瞬时表达载体，转化烟草细胞原生质体，在激光共聚焦显微镜下观察发现CDS_CCI2蛋白定位在质体中，从而参与除虫菊代谢调控过程。3、采用荧光定量PCR方法对CDS_CCI2基因的组织表达模式进行了分析。CDS_CCI2基因在除虫菊根、茎、叶、花蕾、花中均有表达，其中在花蕾表达最强。4、通过荧光定量PCR技术分析CDS_CCI2基因在不同的激素处理下表达特征，结果显示CDS_CCI2基因受到乙烯、茉莉酸甲酯（MeJA）以及脱落酸（ABA）正调控作用。5、通过对CDS_CCI2转基因番茄的鉴定分析，CDS_CCI2超表达植株呈现矮化、果实变小、无籽等表型，并且改变了其内源代谢产物的水平，推测其原因是CDS_CCI2竞争消耗了底物菊酰焦磷酸，从而减少了脱落酸和赤霉素的生物合成。6、通过VIGS技术在除虫菊中敲除CDS_CCI2基因的功能，结果表明CDS_CCI2基因沉默后，影响了叶绿素、类胡萝卜素以及除虫菊酯的生物合成。7、以除虫菊幼嫩子叶为材料，利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的叶盘法转化除虫菊，成功建立了除虫菊遗传转化体系。
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