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抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究.pdf文档全文免费阅读、在线看

花匠小妙招
2024-11-13 10:52

抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究

牌士学位沦文抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究末北农业大学摘要 f葡萄生产一直是我国农业生产的一个重要的组成部分。近年来我国的葡萄栽培面积迅速扩大，葡萄生产发展迅速但病虫害种类也随之增多，尤其是真菌病害发病十分严重植物基因工程近些年来发展迅速，利用基因工程技术培育抗病虫害作物新品种已成为f1 物育种的一个有效手段。葡萄遗传转化中已有许多可以利用的目的基因．但对葡萄进行遗传转化较困难，主要存在以下问题： 1．葡萄再生频率低是造成葡萄遗传转化困难的关键所在，器官发生易产生嵌台体．胚状体诱导不仅过程繁琐、漫长、诱导率低，而且受基因型的限制，仅少部分葡萄品种能产生体细胞胚。 2．对葡萄进行遗传转化较困难，迄今为止在葡萄中仅获得了较少的转基因植株．且导入的基因多为报告基因。 3．共培养及共培养后受体材料容易产生坏死，因此限制了农杆菌法转化的进行。 4．在筛选过程中，用卡那霉素对葡萄组织筛选选择效果不佳。本研究针对葡萄遗传转化中存在的上述问题进行研究，采用欧洲种葡萄Semillion 作为试材，建立其高效擅株再生体系，并采用农杆菌介导法及基因枪法进行抗真菌病基因的遗传转移，探讨影响基因转移效率的主要因子．优化遗传转化条件，得到PCR检测阳性植株，为从根本上解决真菌病害．得到葡萄抗真菌病的转基因植株奠定了坚实的基础n本研究主要内容如下： 7 i．建立了体细胞胚胎发生途径植株再生体系。f利用欧洲种葡萄Semillioa的胚性愈伤组织，诱导体细胞胚胎发生，综合考虑三方面因素———体细胞胚萌发率、萌发的幼苗中完整植株的比率及畸形苗比率，将Nitseh+BA0．2ⅫL+NAAo02。let确立为最适合体细胞胚萌发培养基。生根培养基确立为附加o．04mg／LNAA的Nitsch培养基。， 2．建立了悬浮培养体系√胚性细胞团悬浮培养最适培养基为ND培养基，在继代后4 天将细胞团经孔径Imm的钢质筛网多次过滤处理．可以使体细胞胚胎发生的整齐度大大增强。经过筛处理的细胞团．在Nitsch培养基中培养5周后子叶型胚的比率可咀高达 92．1％，而且再生苗的畸形苗的百分率下降至38．5％．{再生阶段最适培养基为附加l∥L 活性炭的Nitsch培养基．活性炭的添加对减少畸形苗的发生是有利的。 3．绘制了胚性悬浮培养细胞生长曲线，曲线呈S型．．悬浮培养细胞从第4天开始进入快速生长期．到第l0天左右生长逐渐减慢，进入停滞期．由此可以选择细胞生长最佳时期进行遗传转化．这将有助于转化率的提高N 4．确立了适合于葡萄转化体筛选的抗生素的种类及浓度。在卡鄢霉素、G418、新霉素三种氪基葡糖苷类抗生素中．新霉素筛选效果最佳．培养5周后的细胞团在80mg／L 的新霉紊的选择压力下增殖为0．在此基础上进一步确立最佳筛选方式：在转化后用含重童塑至塑!兰!!星 80mg／L新霉素的固体培养基筛选或在将新霉素浓度由30mg几一50mg几一80mg，L逐步提高的固体或液体培养基均可得到较好的筛选效果．{ 5．探讨了影响遗传转化效率主要因素。 f‘研究了不同菌株对转化的影响，通过调查抗性芽产生效率确立对葡萄材料侵染能力碗的菌株类型和对之敏感的受体材料类型。结果是EHAl05的侵染能力显著高于 LBA4404。胚性愈伤较胚性培养细胞更为敏感． b．通过对影响转化的几个主要因子的正交试验．井对正交试验结果进行分析，确定当试验组合为试验材料为大细胞团、菌液ODⅢ=0．6、共培养4天、共培养培养基pH5．2 时为最优试验组合．这正好和本试验中试验5的结果相吻合。通过极差分析，确立各因素的主次顺序为：共培养培养基pH值植物材料菌液浓度共培养时间。本试验中最主要的影响因素是共培养培养基pH值。 c．研究酚类化合物对转化的影响．共采用了5种酚类化合物．三种浓度(50mg，1、 100m鲫、】50mg月)处理葡萄胚性愈伤组织，以每50mg愈伤组织经GUS色后所产生的蓝点数作为遗传转化效率的指标，试验结果表明．乙酰丁香酮的效果远远好于其他处理，差异显著性达极显著水平． d．研究负压处理对转化的影响，研究发现，对于某一特定植物材料来讲，农杆菌侵染时采用不同的真空强度处理不同时间．对GUS瞬问表达率会产