中科院

花匠小妙招
2024-11-14 23:18

编译：微科盟李子苹果桃，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

根瘤菌和丛枝菌根真菌（AMF）是重要的共生微生物，对生长在金属污染土壤中的植物有利。然而，目前仍不清楚接种的微生物如何影响根际微生物群落，或者根际微生物群落的后续变化是否有助于提高金属胁迫下的植物抗性。本研究探讨了紫花苜蓿接种根瘤菌和AMF对抗镉（Cd）胁迫的影响。利用16S和ITS rRNA基因的高通量测序，进一步分析了根际微生物群落接种后的响应及其在提高紫花苜蓿抗性方面的作用。结果表明，根瘤菌或AMF单独接种显著提高了紫花苜蓿对Cd胁迫的抗性，而它们共同接种则带来了最大的总体改善。抗性的提高体现于共同接种后，抗氧化酶活性增加，显著缓解了Cd诱导的脂质过氧化和活性氧类(ROS)胁迫。此外，共同接种显著改变了根际微生物群落结构，降低了真菌群落多样性，增加了细菌群落多样性。偏最小二乘路径模型(PLS-PM)和变分分析(VPA)的结果表明，在共同接种处理下，根际细菌群落在抗Cd胁迫的改善方面优于真菌群落。这种改善具体表现为根瘤菌和AMF共同接种诱导后某些关键细菌类群（包括变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria）、酸杆菌（Acidobacteria）和绿弯菌（Chloroflexi））的富集，增强了紫花苜蓿吸收根际养分的能力，减少了其向土壤中释放光合作用产生的碳(C)。我们的研究结果表明，多种共生微生物的共同接种可帮助植物有效应对Cd胁迫，从而在微生物诱导的植物管理中更深入地了解根际细菌类群。

论文ID

原名：Improvement of alfalfa resistance against Cd stress through rhizobia and arbuscular mycorrhiza fungi co-inoculation in Cd-contaminated soil

译名：在镉污染的土壤中，通过根瘤菌和丛枝菌根真菌的共同接种，提高紫花苜蓿对镉胁迫的抗性

期刊：Environmental Pollution

IF：8.071

发表时间：2021.2

通讯作者：方临川

通讯作者单位：中国科学院水利部水土保持研究所；黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室

实验设计

结果

1 根际土壤理化性质根据双因素方差分析的结果，Cd、接种处理及其相互作用对NO3--N， NH4 +-N ,，SOC和AP含量有显著影响（P<0.05）。对于所有Cd处理，除土壤pH值外，SOC含量，SOC:TN和SOC:TP比值均高于对照。此外，共同接种显著增加了NH4+-N和AP含量。 2 植物的物理化学性质和植物组织对Cd的吸收情况添加Cd和接种根瘤菌以及AMF都显著影响紫花苜蓿生物量，包括芽和根(P＜0.01；表1)。此外，接种处理大大提高了紫花苜蓿的芽和根生物量，而添加Cd则显著降低了紫花苜蓿的芽和根生物量（P＜0.01）。例如，在添加Cd的根瘤菌和AMF共同接种的处理中，紫花苜蓿生物量最高（3.35±0.116 g /pot）。此外，紫花苜蓿芽和根中的Cd浓度显著受Cd添加、接种及其相互作用的影响。接种和Cd处理大大增加了紫花苜蓿芽和根的Cd吸收含量（表1）。与对照(未接种)相比，所有接种处理下根中的Cd含量均高于芽中的Cd含量(P <0.05)。此外，相对于对照而言，在添加Cd后，接种处理芽中的Cd浓度均高出1.2倍。在添加Cd的共同接种处理中，芽中Cd的总吸收量最高(30.6±1.81mg/pot)。与添加Cd的对照(未接种)相比，单独接种和共同接种处理的芽中，Cd的总吸收量显著更高（系数分别为1.4和1.6），（P <0.05）。在单独接种和未接种处理中，根瘤菌和AMF共同接种处理的总Cd吸收量最高。接种后，芽和根的抗氧化能力明显增强，其中AR、AM和ARM处理的SOD、CAT和POD活性均显著高于A处理（P＜0.05；表2）。与未接种和单独接种处理相比，根瘤菌和AMF共同接种处理中紫花苜蓿的SOD、CAT和POD活性最高。例如，在ARM处理中，芽的SOD活性比A处理大1.4倍。AR、AM和ARM处理中芽的MDA含量明显低于A处理(分别降低27.28%、21.81%和34.09%)(P＜0.05；表2)。此外，与对照未接种植物相比，共同接种处理中MDA、H2O2和O2-含量最低。表1 生物量、Cd含量和植物组织对Cd的吸收。注：A(紫花苜蓿)、AR(紫花苜蓿+S.meliloti)、AM(紫花苜蓿+G.mosseae)和ARM(紫花苜蓿+S.meliloti+G.mosseae)。CK和Cd分别代表对照土壤和添加Cd的土壤。值是三个重复的土壤核心的平均值（±标准误差）。不同的大写字母表示CK和Cd在不同接种量时一列内有显著差异（P＜0.05），不同的小写字母表示CK和Cd不同接种量之间一列内有显著差异（P＜0.05），用Tukey检验。***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05。表2 不同处理中植物芽的丙二醛(MDA)、活性氧(O2-，H2O2)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD))含量。注：A(紫花苜蓿)、AR(紫花苜蓿+S.meliloti)、AM(紫花苜蓿+G.mosseae)和ARM(紫花苜蓿+S.meliloti+G.mosseae)。CK和Cd分别代表对照土壤和添加Cd的土壤。FW，鲜重。值是三个重复的土壤芯的平均值（±标准误差）。不同的大写字母表示CK和Cd在不同接种量时一列内有显著差异（P＜0.05），不同的小写字母表示CK和Cd不同接种量之间一列内有显著差异（P＜0.05），用Tukey检验。***，P＜0.001；**，P＜0.01；*，P＜0.05。 3 根际微生物群落的α多样性所有土壤样品共鉴定出4847280条高质量的微生物序列，其中真菌序列2593280条，细菌序列2254000条，在97%的相似度截止水平下，可分别聚类为904和197个OTU。对于细菌群落来说，OTU、ACE、Chao1、Simpson和Shannon-Wiener指数均受到Cd添加、接种及其相互作用的显著影响(P＜0.05；图1)。特别是在接种处理下，Cd的添加大大降低了细菌Simpson多样性指数。在添加Cd的情况下，接种显著降低了细菌Simpson多样性指数，而在对照处理中则增加了细菌Simpson多样性指数。对于真菌群落来说，Cd的添加、接种以及它们之间的相互作用对Chao1和Simpson多样性指数都有明显的影响。特别是在所有接种处理下，Cd的添加都显著提高了真菌的Simpson多样性指数（P＜0.05；图1）。接种与添加Cd处理和对照处理都能显著提高真菌的Simpson多样性指数。添加Cd处理和对照处理，接种后均可显著提高真菌的Simpson多样性指数。图1 不同处理之间细菌（A，B），真菌（C，D）α多样性的差异。
4 根际微生物群落的结构我们的研究在所有不同的处理中检测到了10个细菌门类(相对丰度>1%)，即变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia） (图2A)。相对丰度<1%的其他种群被归为"Others"。在所有处理中，Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes是主要的细菌门。Cd添加、接种及其相互作用显著影响了Firmicutes、Bacteroidetes和Acidobacteria的相对丰度。特别是Cd的添加，明显降低了所有接种(AR、AM和ARM)处理中Actinobacteria的相对丰度，而增加了两个接种(AM和ARM)处理中Firmicutes的相对丰度。我们的研究在所有不同的处理中检测到了10个真菌门类(相对丰度>1%)，即子囊菌门（Ascomycota）、Unclassified、担子菌门（Basidiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、尾虫门（Cercozoa）、油壶菌门（Olpidiomycota）和罗兹菌门（Rozellomycota） (图2B)。在所有处理中，占主导地位的真菌门为Ascomycota（44.3-65.7%）和Unclassified（14.9-36.6%）。Cd的添加显著影响了Cercozoa和Rozellomycota的相对丰度，接种后极大地影响了Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota的相对丰度(P <0.05)。其他菌类在真菌群落组成中只占很小的一部分，如Basidiomycota和Glomeromycota。同时，对指示菌种的分析表明，从门到科水平的这些细菌类群(Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Firmicutes)和真菌类群(Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota)都是根瘤菌和AMF共同接种后根际微生物群落的主要指标(表3)。双因素方差分析表明，添加Cd、接种及其相互作用极显著地影响了细菌和真菌的群落结构(P＜0.001)。此外，NMDS和ANOSIM分析表明，真菌和细菌群落结构在Cd和接种处理中均有显著差异(P＜0.001；图3)。部分Mantel检验进一步证实，添加Cd和接种处理与真菌和细菌群落内的异质性都有很大的相关性。图2 不同处理中主要细菌（A）和真菌（B）类群的相对丰度。
表3 通过添加Cd处理后的指示性类群分析，在门类水平将分类群确定为根际潜在指标。注：数据根据相对丰度显示了最高指标，同时有70％的完美指示。A(紫花苜蓿)、AR(紫花苜蓿+S. meliloti)、AM(紫花苜蓿+G. mosseae)和ARM(紫花苜蓿+S. meliloti+G. mosseae)。图3 从Bray-Curtis距离矩阵得出的非度量多维标度（NMDS）排序图。 5 微生物群落与土壤特性的关系Pearson相关分析发现，Cd、OTU和细菌群落的α多样性指数(即Shannon、Simpson、Chao1和ACE)之间存在显著的相关性(P＜0.05)。除Shannon指数外，SOC、TN、SOC:TN和SOC:TP与OUT以及细菌群落中的这些α多样性指数之间存在显著的相关性。但是，除了真菌群落的OTU和Shannon与SOC和SOC:TN外，真菌群落的α多样性指数与这些土壤性质之间没有发现明显的相关性。VPA的结果表明，土壤性质和Cd含量一般能解释细菌群落的大部分变化（62.8%），而它们只能解释真菌群落12.9%的变化（图4A和B）。Mantel检验和相关分析表明，除TP和SOC:TP外，其他土壤变量均与细菌群落显著相关，而只有Olsen-P和pH值对真菌群落有显著影响（图4C）。此外，RDA还证实，与不同处理的真菌群落相比，土壤变量对不同处理的细菌群落有更明显的影响。根据相关性热图和RDA或CCA，细菌群落中的Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Acidobacteria和Chloroflexi与除TP外的其他土壤变量显著相关(P＜0.05；图4D)。然而，在真菌群落中，只有Chytridiomycota、Olpidiomycota和Rozellomycota与大多数土壤变量表现出明显的相关性(P <0.05；图4E)。图4 变异分区分析显示了细菌（A）和真菌（B）群落解释的土壤特性和土壤Cd的差异百分比。土壤变量与微生物群落结构之间的关系（C）。细菌类群（门水平，D）和真菌类群（门水平，E）与土壤特性的相关热图。
6 接种和添加Cd处理与微生物群落、土壤特性、植物生物量和Cd吸收的级联关系PLS-PM 表明，接种根瘤菌和共同直接影响真菌和细菌的多样性，间接影响抗氧化酶活性、脂质过氧化物和苜蓿生物量。接种对细菌多样性(OTU、ACE、Chao1、Simpson和Shannon指标)有积极影响，但对真菌多样性没有影响。接种对抗氧化酶活性和苜蓿生物量有正面影响，而对脂质过氧化物有负面影响（图5D）。此外，接种对抗氧化酶活性（0.60）和植物生物量（0.55）的总影响最大。此外，与真菌群落多样性相比，细菌群落多样性对抗氧化酶活性(0.45)和紫花苜蓿生物量(0.38)有显著的积极影响。图5 处理（接种和添加Cd）与微生物群落、土壤特性和植物抗性的级联关系。偏最小二乘路径模型(PLS-PM)剖析了处理、微生物群落和土壤特性对植物抗性的主要影响途径(A)(B)；以及每个变量对植物生物量、抗氧化酶和脂质过氧化物的总影响(C)(D)。

讨论

1 根瘤菌和AMF共同接种对植物抗Cd胁迫的意义本研究发现，紫花苜蓿经过4个月的生长后，生物量明显增加，且根瘤菌和AMF共同接种处理的生物量最高（表1）。与未接种处理相比，单独接种根瘤菌或AMF的处理导致生物量产量的增加和养分获取的改善。Gao等人的研究表明，AMF接种增加了豆科植物的结节数，这表明菌根形成提供了充足的磷（P）来支持结节和菌体的发育，以促进结节。在所有接种处理中，根瘤菌和AMF共同接种处理对缓解紫花苜蓿Cd胁迫的总体效果最大。补救策略的可行性在很大程度上取决于土壤中残留重金属的生物活性及其在植物中的利用率。根瘤菌和AMF共同接种处理中，紫花苜蓿芽和根的Cd吸收总量明显高于单独接种或未接种处理（表1）。苜蓿芽中的Cd浓度保持稳定，说明接种可防止Cd在植物组织中过量积累，同时可以促进植物生物量的增加（表1）。此外，Cd主要积累在根部，转移到芽上的Cd量极少，这阻碍了芽上出现的Cd诱导的中毒症状的发生，从而有利于植物稳定。接种可促进苜蓿的生长并提高其对Cd胁迫的抗性。接种后根部的Cd含量显著增加（P＜0.05；表1）。但根中Cd含量的增加并没有导致芽中含量的增加，也没有抑制紫花苜蓿的生长，这进一步说明接种可以提高紫花苜蓿对Cd胁迫的抗性。我们的结果表明，接种后，芽和根中的ROS积累明显减少（表2）。ROS的产生及随后的氧化应激导致MDA含量较高，说明多不饱和脂肪酸的过氧化作用导致膜损伤。这表明在所有接种处理中，H2O2和O2-的细胞调节特性减轻了苜蓿中Cd诱导的胁迫。接种后紫花苜蓿根和芽中的抗氧化酶活性(POD、CAT和SOD)均显著提高，进一步说明Cd胁迫有所缓解(表2)。SOD活性的升高可能是由于超氧化物自由基的增加，这是因为根瘤菌和AMF可以增强植物酶的合成。因此，植物中高抗氧化酶活性可以保护细胞免受Cd胁迫造成的过量ROS的损害。具体而言，与单一接种处理相比，共同接种处理使紫花苜蓿中ROS含量最高，但相应的MDA含量最低(表2)，这与共同接种处理中紫花苜蓿整体生物量最高是一致的。与其他微生物接种实验相比，根瘤菌和AMF分别作为细菌和真菌进行共同接种，可以有效结合并调动N和P，同时释放出激素以提高植物抗性。因此，根瘤菌和AMF共同接种可以通过促进植物的SOD、CAT和POD活性来协助植物缓解Cd胁迫，最终最大程度地消除ROS。多种共生微生物的共同接种可帮助植物有效应对环境胁迫。2 通过根瘤菌和AMF共同接种提高植物Cd抗性的调控机制根瘤菌和AMF共同接种协助提高植物抗性的方式是揭示接种促进生长机制的关键。Doak等人报告表明，物种多样性与稳定性呈正相关关系。在我们的研究中，Cd胁迫下，在苜蓿根际利用微生物共同接种后，显著增加了细菌的多样性，并降低了真菌的多样性。这表明，共同接种有利于细菌群落多样性的恢复，而Cd的添加不利于真菌群落多样性的恢复（图1）。群落多样性反映了群落稳定性和功能多样性，并最终可以影响生态系统中的过程速率和状态变量。因此，与真菌群落相比，细菌群落协助紫花苜蓿抵抗Cd胁迫的潜力更大。此外，PLS-PM还发现在Cd胁迫下，细菌多样性对抗氧化酶活性和紫花苜蓿生物量有显著的正向影响（图5）。共同接种对细菌和真菌群落结构均有显著影响(图2和图3)。鉴于在门类水平上的微生物集合体包含了这些具有相似功能、代谢和形态特征的微生物类群，我们的研究特别探讨了微生物类群内部的门类变化。细菌类群方面，共同接种后，Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi的相对丰度显著增加，而Bacteroidetes和Firmicute的相对丰度显著下降（图2A）。Proteobacteria相对丰度的增加可归因于根瘤菌的接种，采用了属于Proteobacteria的根瘤菌种(S. meliloti)。Bacteroidetes和Firmicutes是Cd污染下发现的关键类群，但它们不是根系接种处理后发现的关键类群(表3)。考虑到许多病原体来自于Bacteroidetes和Firmicutes，高丰度的Proteobacteria(如假单胞菌（Pseudomonas）)因此降低了病原体密度，同时也降低了疾病的发生率。这是由资源竞争加剧和病原体干扰两方面原因造成的。这支持了Proteobacteria的增加可以抑制Bacteroidetes和Firmicutes的类群繁殖能力的假设。Bacteroidetes和Firmicutes可以在潜在的恶劣条件下生存，如酸性环境、病虫害防治（即农药）措施和重金属污染，而这两个门类在健康（未污染）环境中似乎没有竞争力。这些结果意味着接种后改善了Cd胁迫下的根际微环境。此外，Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi相对丰度的增加，可能是由Bacteroidetes和Firmicutes相对丰度的减少所引起的。对于真菌类群，在AMF接种后，Glomeromycota的相对丰度显著增加（AMF属于Glomeromycota）（图2B）。另一方面，Mortierellomycota和 Rozellomycota相对丰度的下降可能是由于 Glomeromycota相对丰度的增加所致（图 S1B）。因此，在根瘤菌和AMF共同接种后，这些细菌类群（增加的类群包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi，减少的类群包括Bacteroidetes和Firmicutes）和真菌类群（增加的分类群包括Glomeromycota，减少的分类群包括Mortierellomycota和Rozellomycota）可能是提高紫花苜蓿对Cd抗性的关键根际微生物区系。与共生微生物接种后紫花苜蓿对 Cd胁迫抗性增加的相关机制可能是通过共生微生物的手段增强了整个根际环境。据此，本研究进一步探讨了微生物的关键类群与土壤性质在提高紫花苜蓿抗Cd能力方面的关系。共同接种后，可利用的根际土壤养分显著增加，可帮助植物获取养分，从而改善植物在Cd胁迫下的生长。然而，必须指出的是，关键细菌类群的增加对SOC和可用的土壤养分产生了负面影响，而关键细菌类群的减少对共同接种后的这些变量产生积极的影响（图4）。这表明，共同接种可降低苜蓿根际中的SOC和有效养分含量。有机分子的产生和分泌（如通过根系分泌有机酸）是植物应对胁迫的典型方式，随后可以反映出环境对植物的胁迫程度。根际中SOC的含量主要来源于植物根系渗出物的产生，这是因为本次短期对照盆栽实验中没有使用其他C源。因此，根层中SOC含量的减少可能表明紫花苜蓿对Cd胁迫的缓解。此外，由于根系对养分的吸收，导致紫花苜蓿生物量增加，根际中可用养分减少。以往的研究表明，许多微生物类群，即Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi(如Acidobacteria(GP1、GP3和GP6)、Rhizobiales、Burkholderiales、Pseudomonadales和Frankineae)可以帮助植物吸收养分，提高植物生产力。例如，S.meliloti可以诱导根瘤菌占据豆科植物的结节，以帮助养分吸收。有研究表明，根瘤菌也可能提供病害保护，在提供养分的根瘤菌占主导地位的根三叶植物的微生物组，被细菌属富集。一项研究表明，根瘤菌也可能提供疾病保护，在三叶草属的微生物组中，提供养分的根瘤菌占主导地位，这些微生物群由细菌属富集。此外，已知许多细菌可以缓解铁(Fe)、磷(P)、镁(Mg)和钙(Ca)的缺乏，从而防止它们因重金属竞争而转移到植物根部。这些过程还可以通过增加根际中微量元素的利用率来促进紫花苜蓿的生长。因此，提高紫花苜蓿对Cd胁迫抗性的关键细菌类群的主要过程可能是它们为紫花苜蓿提供了吸收根际营养物质并减少植物光合作用衍生的碳（C）释放到土壤中的辅助作用（图5）。与细菌群落相反，VPA显示真菌群落对土壤变量的影响较小(图4A和B)，这与我们的结果一致，即除Olsen-P和pH值外，真菌群落与根际中的SOC和养分没有很强的相关性(图4C)。我们的结果表明，真菌群落在提高紫花苜蓿抗Cd胁迫方面的相关效果低于细菌群落。这些结果也被发现的关键真菌类群和根际变量之间的微弱相关性所支持（图4E）。但是，由AMF接种引起的这些关键真菌类群的变化强烈影响了关键细菌类群，这表明这些关键真菌类群可能通过影响细菌群落的方式在Cd胁迫下辅助苜蓿生长中发挥间接作用。这些结果也阐明了根瘤菌和AMF共同接种与单独接种相比促进苜蓿抗性和生长的原因。通过PLS-PM分析（图5），关键的真菌类群对关键的细菌类群有直接影响，这对植物的抗性和生长有间接的有利影响。一般来说，在根瘤菌和AMF共同接种处理下，根瘤菌群落而非相应的真菌群落主要提高了紫花苜蓿对Cd胁迫的抗性。

结论

本研究为共生微生物如何影响根际微生物类群以帮助苜蓿抵抗Cd胁迫提供了新的见解，对此，根际中群落成员之间的相互作用或接种后群落组合的动态被确定为重要因素。与单独接种相比，根瘤菌和AMF共同接种对苜蓿抗Cd胁迫产生的总体效果最优。根瘤菌和AMF共同接种强烈影响了关键细菌类群(Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi)，主要是通过协助植物吸收根际的养分，减少植物光合衍生C在土壤中的分配，提高紫花苜蓿对Cd胁迫的抗性。这些发现对于进一步提高植物抗性，保证饲草和作物产量具有重要意义。

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