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古巴兰花的快速繁殖方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-18 00:46

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1、(10)申请公布号 CN 103999771 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 103999771 A (21)申请号 201410215448.5 (22)申请日 2014.05.21 A01H 4/00(2006.01) A01G 1/00(2006.01) (71)申请人太原大学外语师范学院地址 030012 山西省太原市南内环街南二巷 68 号 (72)发明人方岩王培军夏罗宏薛斌 (74)专利代理机构太原晋科知识产权代理事务所 ( 特殊普通合伙 ) 14110 代理人郑晋周 (54) 发明名称古巴兰花的快速繁殖方法 (57) 摘要本发明公开了一种。

2、古巴兰花快速繁殖的方法，其步骤分为：制备无性繁殖叶片、诱导培养获得愈伤组织、增殖培养获得大量的愈伤组织、分化培养、生根培养、炼苗和试管苗移栽。本发明以试管苗的叶片作为外植体，通过叶片诱导快速繁殖形成愈伤组织，通过愈伤组织的增殖培养、分化培养和生根培养，最终获得古巴兰花小苗。该方法愈伤组织诱导率在 80% 以上，芽苗分化率在 60% 以上，生根率在 85% 以上，解决了古巴兰花无性繁殖现有技术愈伤组织诱导率极低，芽苗分化率低和生根率低的现实问题，对古巴兰花的规模化育苗有现实的意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 。

3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书3页 (10)申请公布号 CN 103999771 A CN 103999771 A 1/1 页 2 1. 一种古巴兰花的快速繁殖方法，其步骤为：制备无性繁殖叶片选取古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用自来水冲洗 30min 后，在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min，然后用 75% 酒精表面消毒 30s，最后用无菌水冲洗后，放在 MS+5.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤 +1.5mg/L 的 a- 萘乙酸+30g/L的蔗糖+7g/L的琼脂、 PH。

4、为5.8的培养基中培养诱导成苗，培养条件为： 17-23、光照强度 10001500Lux、光周期为 15h/d，待小苗长到 2-3 片叶、叶长 5-8cm 时，用剪刀将叶片剪为 0.8-1.2cm 长的叶片，备用：诱导培养获得愈伤组织以 MS 培养基为基本培养基，再添加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，简称 6-BA）、 0.3-0.5mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxy，简称2,4-D）、 30g/L蔗糖、 7g/L琼脂，制成PH为5。

5、.8的诱导培养基，将（1）准备的 0.8-1.2cm 长的叶片消毒后置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养条件为 17-23，暗光培养 60-65 天，直至获得愈伤组织；增殖培养获得大量的愈伤组织以MS培养基为基本培养基，添加0.5-1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、 0.2-0.4mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制成 PH 为 5.8 的增殖培养基，将（2）培养的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养，培养条件同（2），直至获得大量愈伤组织；分化培养以 MS 培养基为基。

6、本培养基，添加 8.0-10.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、和 0.1-0.3mg/L 的 a- 萘乙酸（a-naphthlcetic acid ，简称 NAA）、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制成 PH 为 5.8 的分化培养基，将（3）培养的愈伤组织置于分化培养基中培养，培养条件是： 17-23、光照强度为 10001500Lux、光周期为 15h/d，直至愈伤组织分化成叶长为 3-4cm 的芽苗；生根培养以 1/2MS 培养基为基本培养基，添加 0.8-1.0mg/L 的 a- 萘乙酸、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制备成。

7、PH 为 5.8 的生根培养基，将（4）培养的芽苗取单苗置于生根培养基中生根培养，培养条件同（5），直至芽苗生根获得古巴兰花生根苗；炼苗待（5）培养的小苗根长到 1-3cm 时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗 6-8 天；试管苗移栽试管苗移栽基质为泥炭或蛭石，基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒，取出（6）培养的小苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在 85%-95%、温度 20-25，移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常。

8、规管理。权利要求书 CN 103999771 A 2 1/3 页 3 古巴兰花的快速繁殖方法技术领域 0001 本发明涉及古巴兰花的组培快繁方法，特别涉及一种通过叶片诱导快速繁殖古巴兰花的方法。背景技术 0002 兰花，以其形态优美别致、花朵硕大、花色艳丽、色泽丰富、花期长，被称为花中之王。古巴兰花更是兰花之精品。古巴兰花为单轴茎附生花卉，植株极少萌发侧芽枝，常规的繁殖方法难以满足市场需求，而组织培养是快速繁殖古巴兰花的最有效途径。1960 年， Morel 提出了离体无性繁殖兰花的方法。随着兰花的推广，对兰花快繁体系的研究也逐渐深入。各种无性繁殖技。

9、术成为研究的热点。但是，由于生物的种间差异，广义上可适用于兰花无性繁殖的技术，具体到古巴兰花上并不一定可行。古巴兰花无性繁殖的方法是用根诱导形成愈伤组织，再经过分化和生根培养，这种方法的困难是用根诱导形成愈伤组织的难度大、成功率低。而通过叶片诱导快速繁殖古巴兰花的方法尚未见报道。发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种通过叶片诱导快速繁殖古巴兰花的方法，实现在短期内获得大量优质的试管苗，解决古巴兰花的规模化生产问题。 0004 本发明是通过下述方式实现的。 0005 一种古巴兰花的快速繁殖方法，其步骤为：（1）制备无性繁殖叶片选取古巴兰花植株的球茎上的芽。

10、作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用自来水冲洗 30min 后，在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min，然后用 75% 酒精表面消毒30s，最后用无菌水冲洗后，放在MS+5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.5mg/L的a-萘乙酸+30g/L的蔗糖+7g/L的琼脂、 PH为5.8的培养基中培养诱导成苗，培养条件为： 17-23、光照强度 10001500Lux、光周期为 15h/d，待小苗长到 2-3 片叶、叶长 5-8cm 时，用剪刀将叶片剪为 0.8-1.2cm 长的叶片，备用：（2）诱导培养获得愈伤组织以 MS 培养基为基本培养基，再添。

11、加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，简称 6-BA）、 0.3-0.5mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxy，简称2,4-D）、 30g/L蔗糖、 7g/L琼脂，制成PH为5.8的诱导培养基，将（1）准备的 0.8-1.2cm 长的叶片消毒后置于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养条件为 17-23，暗光培养 60-65 天，直至获得愈伤组织；（3）增殖培养获得大量的愈伤组织以 MS 培养基为基本培养基，添加 0.5-1.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤（6。

12、-BA）、 0.2-0.4mg/L 的 2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制成 PH 为 5.8 的增殖培养基，将（2）培养的愈伤组织置于增殖培养基中增殖培养，培养条件同（2），直至获得大量愈伤组织；（4）分化培养以 MS 培养基为基本培养基，添加 8.0-10.0mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、和 0.1-0.3mg/L 的 a- 萘乙酸（a-naphthlcetic acid ，简称 NAA）、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制说明书 CN 103999771 A 3 2/3 页 4 成 P。

13、H 为 5.8 的分化培养基，将（3）培养的愈伤组织置于分化培养基中培养，培养条件是： 17-23、光照强度为 10001500Lux、光周期为 15h/d，直至愈伤组织分化成叶长为 3-4cm 的芽苗；（5）生根培养以 1/2MS 培养基为基本培养基，添加 0.8-1.0mg/L 的 a- 萘乙酸、 30g/L 蔗糖和 7g/L 琼脂，制备成 PH 为 5.8 的生根培养基，将（4）培养的芽苗取单苗置于生根培养基中生根培养，培养条件同（5），直至芽苗生根获得古巴兰花生根苗；（6）炼苗待（5）培养的小苗根长到 1-3cm 时，将培养瓶的。

14、封口膜打开，炼苗 6-8 天；（7）试管苗移栽试管苗移栽基质为泥炭或蛭石，基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒，取出（6）培养的小苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在 85%-95%、温度 20-25，移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常规管理。 0006 本发明的有益效果是：以试管苗的叶片作为外植体，通过叶片诱导快速繁殖形成愈伤组织，通过愈伤组织的增殖培养、分化培养和生根培养，最终获得古巴兰花小苗。该方法愈伤组织诱导率在 8。

15、0% 以上，芽苗分化率在 60% 以上，生根率在 85% 以上，解决了古巴兰花无性繁殖现有技术愈伤组织诱导率极低，芽苗分化率低和生根率低的现实问题，对古巴兰花的规模化育苗有现实的意义。 0007 实施例 1 选取生长发育健康的古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用自来水冲洗 30min 后，在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min，然后用 75% 酒精表面消毒 30s，最后用无菌水冲洗后，置于在 MS+5.0mg/L 的 6-BA +1.5mg/L 的 NAA +30g/L 的蔗糖和 7g/L 的琼脂、 PH 为 5.8 的培养基中培养。

16、成苗，培养条件为： 17-20、光照强度 1300-1500Lux、光周期为 15h/d，待小苗长到 2-3 片叶，叶长 7-8cm 时，用剪刀将叶片剪为 0.8-1.0cm 长的叶片。然后将该叶片消毒后转入 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖， PH 为 5.8 的诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养温度 17-19，暗培养，培养 65 天时间愈伤组织诱导率为 80.7%。将诱导出的愈伤组织放在 MS+6-BA 0.5mg/ L+2,4-D 0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH 为。

17、5.8 的增殖培养基中增殖培养，培养条件 20-23，暗培养 50 天时愈伤组织的增殖倍数为 2.86。将增殖后的愈伤组织放在 MS+6-BA 10.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L、 PH5.8的分化培养基中分化培养，培养温度为 20-23，光照强度为 13001500Lux，光周期为 15h/d，芽苗分化率为 60.9%。待苗长涨至 3-4cm 长时，切取单苗放入 1/2MS+NAA 1.0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH 为 5.8 的生根培养基中培养至 35 天时生根率为 85.3%，平均根长 1.5cm 和平。

18、均根数为 2.1 条。待根长长到1-3cm时，将封口膜打开，炼苗6天，然后取出苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可进行试管苗移栽，试管苗移栽基质为泥炭，基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒。然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在 85%-95%、温度 20-25，移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常规管理。 0008 实施例 2 取古巴兰花植株的球茎上的芽作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用自来水冲洗 30min，在无菌条件下用 0.1%HgCl2表面消毒 3min，然后用 75% 酒精表面消毒 30s，。

19、最后用无菌水冲洗后，置于在 MS+5.0mg/L 的 6-BA +1.5mg/L 的 NAA +30g/L 的蔗糖和 7g/L 的琼脂、 PH 为 5.8 说明书 CN 103999771 A 4 3/3 页 5 的培养基中培养成苗，培养条件为： 20-23、光照强度 10001250Lux、光周期为 15h/d，待小苗长到 2-3 片叶，叶长 7-8cm 时，用剪刀将叶片剪为 1.1-1.2cm 长的叶片。然后将该叶片消毒后转入MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.3mg/L+7g/L琼脂+30g/L蔗糖， PH为5.8的诱导培养基中进行愈伤组织诱导培。

20、养，培养温度 20-23，暗培养，培养 60 天时间愈伤组织诱导率为 80.7%。将诱导出的愈伤组织放在 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.4mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/ L、 PH 为 5.8 的增殖培养基中增殖培养，培养条件 17-219，暗培养 55 天时愈伤组织的增殖倍数为 2.91。将增殖后的愈伤组织放在 MS+6-BA 8.0mg/L+NAA 0.3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7g/L、 PH5.8 的分化培养基中分化培养，培养温度为 17-19，光照强度为 10001280Lux，光周期为 15h/d，芽苗分化率为 64。

21、.2%。待苗长涨至 3-4cm 长时，切取单苗放入 1/2MS+NAA 0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L、 PH为5.8的生根培养基中培养至33天时生根率为87.1%，平均根长 1.6cm 和平均根数为 2.3 条。待根长长到 1-3cm 时，将封口膜打开，炼苗 8 天，然后取出苗用自来水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分即可进行试管苗移栽，试管苗移栽基质为蛭石，基质移栽前用 50% 多菌灵可湿性粉剂的 700-900 液进行消毒。然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在 85%-95%、温度 20-25，移栽 10 天后逐渐降低温度至 17-20， 40 天后进入常规管理。说明书 CN 103999771 A 5 。