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蜂花粉细菌分离及其致病菌耐药性研究

花匠小妙招
2024-11-19 08:34

1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,浙江杭州 310021

2.湖南科技学院化学与生物工程学院,湖南永州 425199

3.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100

通信作者:杨华(1972—),男,浙江绍兴人,副研究员,博士,主要从事畜产品质量安全研究工作,E-mail: yanghua@zaas.ac.cn。

作者简介:唐标(1987—),男,江苏徐州人,助理研究员,博士,主要从事畜产品质量安全与动物源细菌耐药性研究工作,E-mail: tb_411@163.com。

基金项目:

国家自然科学基金青年科学基金(31700007)

;

浙江省基础公益研究计划(2017C32021)

;

省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(2010DS700124-ZZ1703,ZZ1905)

蜂花粉是蜜蜂加工花蜜后加入自身腺上分泌物和唾液制成的团状物[1], 根据花粉的来源呈现不同的颜色, 其中以黄色居多。蜂花蜂是蜂群的主要蛋白质来源, 包含蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素、脂类, 酶、辅酶、激素、黄酮、多肽、微量元素等多种生物活性物质[2]。因多酚类和黄酮类物质广泛存在, 蜂花粉被认为是一种有效的抗氧化剂[3, 4, 5]。同时, 蜂花粉还具有抗动脉粥样硬化活性[6], 被消费者用作营养和保健品。

新鲜采集的蜂花粉含水量较高, 在晾晒、分装等粗放式加工过程中可能使蜂花粉产品受到微生物的二次污染, 从而对人体健康构成潜在风险[7]。一直以来, 关于蜂花粉中细菌污染的研究较少[8, 9]。一方面是因为蜂花粉具有一定的抗菌活性[10], 细菌含量少, 较难分离; 另一方面也是由于传统的细菌鉴定流程繁琐, 导致人们可能会忽视零星检出的可疑菌落。

本研究收集了浙江省主要蜂花粉产区的代表性蜂花粉样品, 对其进行了细菌分离, 随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行快速鉴定, 以反映产品中存在的细菌污染状况, 并首次对来源于蜂花粉中的克雷伯氏菌的药物敏感性进行检测分析, 相关结果可为评估蜂花粉产品的质量安全提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器:Bio-Rad Gel Doc凝胶成像系统, 伯乐生命医学产品(上海)有限公司; Eppendorf 5424R微量高速离心机, 艾本德中国有限公司; Nanodrop ONE核酸定量仪, 赛默飞世尔科技(中国)有限公司; SW-CJ-ICU超净工作台, 苏州安泰空气技术有限公司; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪, 德国布鲁克· 道尔顿公司。

试剂:LB培养基、EMB培养基、缓冲蛋白胨水(BPW), 购自北京陆桥技术股份有限公司; 质控菌株— — 大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC 25922系本实验室保藏; MALDI-TOF MS基质— — α -氰基-4羟基肉桂酸(HCCA), 购自Sigma公司; 2× Taq Master Mix、DNA marker(相对分子质量标记), 购自TaKaRa公司; 细菌基因组DNA提取试剂, 购自上海捷瑞生物工程有限公司; 96孔肉汤微量稀释法药敏板, 购自上海星佰生物技术有限公司。

1.2 样品采集与细菌分离

在浙江省龙游、长兴、兰溪、江山、武义等市县采集不同类型的蜂花粉样品107个, 详细信息参见本实验室先前的报道[7]。称取1 g蜂花粉样品在37 ℃通过BPW过夜预增菌, 然后同时在LB和EMB培养基上划线分离, 挑选疑似克隆后纯化3次, 使用20%甘油保藏到-80 ℃冰箱。将分离株划线于LB平板, 37 ℃培养12~24 h复苏, 挑单克隆用于后续研究。

1.3 MALDI-TOF-MS鉴定分析

将纯化单菌落均匀涂抹至MALDI靶板上的圆孔内, 加入1 μ L 70%的甲酸溶液裂解细胞, 自然晾干后加入1 μ L HCCA基质溶液覆盖, 自然干燥结晶。使用MALDI Biotyper RTC[11]软件进行样品指纹图谱的自动采集和分析。将采集的指纹图谱与数据库进行比对, 分值越高, 则鉴定准确的可信度越高:分值在2.3~3.0的, 表示鉴定到种水平, 且可信度高; 分值在2.0~2.2的, 表示鉴定到种水平; 分值在1.7~1.9的, 表示鉴定到属水平。

1.4 基因组DNA抽提与扩增

参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组总DNA, 通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ONE进行检测, 保存于-20 ℃冰箱备用。细菌的16S扩增子测序使用通用引物8F(5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3')和1492R(5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3')。

1.5 药物敏感性检测

采用肉汤微量稀释法测定抗菌药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC), 使用E.coli ATCC 25922作为质控菌株, 利用上海星佰生物技术有限公司的药敏检测板, 按照产品说明书进行试验。测定的抗菌药物包括氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、四环素、氯霉素、复方新诺明、头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素、亚胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺异噁唑、环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶-克拉维酸、多黏菌素E、多黏菌素B、米诺环素、阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、美罗培南、左氧氟沙星、多西环素、卡那霉素、链霉素、吉米沙星。所有MIC数据参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2015版M100-S25文件解释。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定

对107份蜂花粉进行细菌分离, 总计分离出38株菌株, 大部分蜂花粉样品通过预增菌后在EMB平板上培养24 h没有可见菌落。通过MALDI-TOF MS检测, 将分离出的菌群进一步鉴定到种水平。图1显示了3个代表性菌株— — 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)通过细菌质谱检测的结果, 其谱图具有明显的差异, 检测值也有较高的可信度。对于得分值较低的个别菌株进一步通过16S测序验证。如表1所示, 最终鉴定获得的细菌分属于10个属20个种, 包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、勒克氏菌属(Leclercia)、泛菌属(Pantoea)、肠球菌属(Enterococcus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus), 占比较高的为肠杆菌属和克雷伯氏菌属, 前者共有10株, 其中7株为阴沟肠杆菌; 后者共有7株, 其中4株为肺炎克雷伯菌。分离出的菌株中, 25株为革兰氏阴性菌, 全部属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae), 其中多数为条件致病菌; 13株为革兰氏阳性菌, 包括肠球菌科(Enterococcaceae)和芽孢杆菌科(Bacillaceae)。

表1 蜂花粉中分离的细菌统计

2.2 药物敏感性检测

克雷伯氏菌属为常见的致病菌, 尤以肺炎克雷伯菌为代表。对分离的克雷伯氏菌属菌株(分别编号为KP16、KP29-2、KP24、KP31、KO59、KO55、KV3-2)进行药物敏感性检测, 获得其对30种药物的MIC值(表2)。其中, 6株菌对氨苄西林具有耐药性, KO59对头孢唑林具有耐药性, KO55对头孢西丁具有耐药性。测试菌株对其他的药物均表现为敏感, 较来源于临床或者动物肠道的肺炎克雷伯菌耐药性水平较低[12]。

表2 供试克雷伯氏菌的MIC值

3 小结与讨论

本研究从107份蜂花粉中分离出38株细菌, 以肠杆菌科细菌为主, 分属于10个属, 其中7株属克雷伯氏菌属, 药敏检测发现其耐药水平较低, 仅个别菌株对头孢类抗生素耐药。总的来说, 蜂花粉具有一定的食品安全风险。

一直以来, 关于蜂花粉的细菌污染研究报道极少。蜂花粉不仅影响蜜蜂肠道微生物组成[13], 同时作为保健品关系食品安全。本研究对浙江省的蜂花粉进行了采样, 对可培养的细菌进行了分离鉴定, 获得了较多的致病性的肠杆菌科细菌, 对蜂花粉的细菌污染状况有了初步的认识, 并对其中分离到的克雷伯氏菌属菌株的耐药性进行了探究。

蜂花粉中的菌群较粪便、土壤、河流样品简单[14, 15], 但是其携带细菌的来源是多样的, 包括蜜蜂肠道、植物花粉、生长环境, 以及加工储运环节[16, 17, 18]。据报道, 高通量测序发现, 克雷伯氏菌属、泛菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属在蜜蜂肠道中较常见[19], 本研究同样分离到上述细菌, 但是蜂花粉中携带的细菌与蜜蜂肠道中上述细菌的因果关系仍不明了, 需要进一步研究。

蜂花粉类型较多, 属于小众农产品, 加工和储运以个体户为主, 所以细菌的污染状况具有一定的随机性。蜂花粉通过预增菌后, 细菌的分离率仍较低。本研究将MALDI-TOF-MS应用于蜂花粉这一农产品上, 通过对可培养的菌落进行鉴定, 较容易地鉴定出38株细菌。本研究第一次较系统地分离出蜂花粉产品中的细菌, 提高了对蜂花粉细菌或致病菌污染的认识, 但是对于全面研究蜂花粉的细菌污染状况仍有不足。随着细菌质谱的应用, 未来可以更方便地对更多的农产品进行细菌污染研究, 这对于提高农产品质量安全水平具有重要价值。

(责任编辑:高峻)

参考文献:

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