菊花ChCHI基因的克隆、表达分析及遗传转化
【摘要】： 菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科(Compositae)的多年生草本植物,种类繁多、形态多样,是中国十大名花之一,是世界四大切花之首[1],具有良好的观赏、食用和药用价值。近年来,分子生物技术在花卉育种方面迅速发展,植物抗性相关基因的及其功能的研究已经成为当今热点。本研究以菊花叶片为材料,根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI,并对其进行了生物信息学分析;通过qRT-PCR技术分析该基因在不同浓度SA处理下菊花叶片中ChCHI基因的表达量;构建了菊花基因的植物表达载体,并对菊花的遗传转化做了初步研究。1菊花ChCHI基因cDNA全长序列的克隆及序列分析以贡菊叶片提取的总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因。该几丁质酶基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸,命名为ChCHI(Gen Bank登录号为KX881373)。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 kD,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。并对该蛋白的三级结构进行了预测。2菊花ChCHI基因植物表达载体pCAMBIA1300-ChCHI的构建将克隆的ChCHI基因连接在pGEM-T Easy Vector上构建克隆载体pGEM-ChCHI并测序,测序结果正确后,用限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ将pGEM-ChCHI和pCAMBIA1300进行双酶切,再经过T4 DNA连接酶的连接后,构建成植物表达载体pCAMBIA1300-ChCHI。经过菌落筛选、PCR检测和双酶切验证,最终确定菊花ChCHI基因植物表达载体p CAMBIA1300-ChCHI构建成功,为后期的遗传转化等工作打下基础。3菊花ChCHI基因的表达分析采用qRT-PCR对从菊花不同浓度SA处理下ChCHI基因的表达量进行分析,用2~(-ΔΔCt)法来计算。结果表明,经过0.5 mmol·L~(-1)和0.1mmol·L~(-1)水杨酸诱导后,在一定时间内(8h)较低浓度的水杨酸处理(0.1mmol·L~(-1))能使菊花几丁质酶基因的表达量明显升高,总体趋势是在4 h时表达量有所下降,在8 h时几丁质酶基因的表达量最高,然后随着诱导时间的延长,其表达量逐渐下降,比诱导前的表达量低。4对菊花叶片进行了遗传转化以前人的试验结果为依据,探索了通过农杆菌介导法转化菊花所需要的条件,并最终确定了一个菊花的遗传转化体系。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
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