一种调控植物种子休眠时间的方法与流程

• 花匠小妙招
• 2024-11-20 07:13

本发明属于基因工程领域，涉及通过调节RIG1(ROS1-regulated Imprinted Gene 1)基因的表达从而调控种子休眠时间的方法及相关突变植株。

背景技术：

种子休眠是指有生命力的种子由于内在原因，在适宜的环境条件下仍不能萌发的现象。种子休眠是植物在长期系统发育进程中获得的一种适应环境变化的特性。这种特性能够确保物种在恶劣的环境中存活，减少同一物种中个体之间的竞争，以及防止种子在不适宜的季节萌发。种子休眠是一种非常复杂的现象，受许多基因调控，同时受到植物激素和环境因子的影响。

种子休眠与萌发是两个紧密关联的植物生理过程，对农作物生产至关重要。休眠在种子成熟过程中逐渐形成。后熟、低温和光照等因素往往可以打破休眠、促使种子萌发，使植物开始新的生命周期。种子的保藏是植物种质资源保存的重要手段，其对生物多样性的保护、对农业生产具有重要的意义。

为了能够更好的为农业生产提供更好的理论及应用基础，本领域技术人员致力于开发调控种子休眠时间的方法及相关突变植株。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种调控种子休眠时间的方法及相关突变植株。

为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种基因在调控植物种子休眠时间中的应用。

在本发明的一个实施方式中，上述基因为RIG1基因，该RIG1基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

3)编码与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列至少有50％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的另一方面提供了一种调控植物种子休眠时间的方法。

在一个实施方式中，该方法通过调节RIG1基因的表达延长或缩短种子休眠时间，RIG1基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

3)编码与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列至少有50％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步地，延长为使RIG1基因失活或缺失以延长种子休眠时间，缩短为使RIG1基因过表达以缩短种子休眠时间。

进一步地，RIG1基因失活或缺失为通过CRISPR/Cas9系统进行。

进一步地，上述植物为双子叶植物。

优选地，上述植物为拟南芥、亚麻荠、甘蓝、芜菁、山嵛菜、鹰嘴豆、大豆、中粒咖啡或芝麻。

本发明的再一方面提供了一种植物突变株系。

在一个实施方式中，给突变株系中RIG1基因的表达被调节，使得植物的种子休眠时间延长或缩短，RIG1基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

2)编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

3)编码与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列至少有50％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

进一步地，上述植物为拟南芥，突变株系在如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的的第1154个核苷酸之后具有一个1bp碱基的插入，突变株系的种子休眠时间延长。

或者，上述植物为拟南芥，突变株系的背景为rig1-1，整合有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

进一步地，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列前整合有UBQ10启动子。

本发明很好的揭示了RIG1基因在控制种子休眠方面的功能，并提供通过敲除RIG1表达从而实现延长种子休眠时间的方法及植株，以及过表达RIG1从而缩短种子休眠时间的方法及植株，为农业生产上的应用提供良好的基础。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。在本发明的构思上，本领域技术人员根据常规技术、逻辑推理分析等无需付出创造性劳动的修改和变化得到的技术方案，也在保护范围之内。

附图说明

图1是拟南芥rig1-1的突变位点示意图。

图2示出了拟南芥中RIG1在Col野生型的不同组织或器官中的表达分析结果。

图3示出了拟南芥rig1-1中RIG1表达检测结果。

图4是拟南芥Col野生型和rig1-1突变体的发芽率统计图。

图5示出了拟南芥Col、rig1-1、rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)中RIG1表达检测结果。

图6是拟南芥Col、rig1-1、rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)的发芽率统计图。

图7是拟南芥rig1-2的突变位点示意图。

图8是拟南芥C24和rig1-2的发芽率统计图。

图9是RIG1及其在甘蓝、芜菁、山嵛菜、亚麻芥、鹰嘴豆、大豆、中粒咖啡和芝麻中的同源蛋白的氨基酸序列比对结果。

图10是RIG1及其在甘蓝、芜菁、山嵛菜、亚麻芥、鹰嘴豆、大豆、中粒咖啡和芝麻中的同源蛋白进化树分析结果。

具体实施方式

本发明的实施例中使用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia-0(Col-0)和C24购自拟南芥属储存中心(Arabidopsis Stock Centre,http://www.arabidopsis.org)。

拟南芥rig1-1是RIG1基因的T-DNA突变体，其在内含子中具有一个T-DNA插入，不能产生基因的完整转录，图1为rig1-1的突变位点示意图。rig1-1购自拟南芥突变体库GABI-Kat，储存编号是GK-778D01。rig1-1是拟南芥的RIG1突变体。

实施例中过表达载体转入农杆菌以及农杆菌侵染植株的方法采用常规方式进行。

若无特殊说明，本发明的实施例中的植物在培养箱中以21-25℃，16h光照/8h黑暗的条件进行培养。

实施例1.拟南芥中RIG1基因在不同组织中的表达分析

拟南芥中的RIG1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

将Col野生型种子用8％次氯酸钠灭菌8min，之后用ddH2O洗5遍。将洗净的种子播在1/2MS(pH 5.7，蔗糖2％)培养基上，光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养10天后取部分整株小苗存于-80℃冰箱；将剩余的苗移栽到蛭石和营养土2:1混合的基质上，继续光照培养室(21-25℃，16h光照/8h黑暗)生长，于拟南芥开始开花结荚的时候，分别留取根、成熟叶、茎身叶、花和果荚存于-80℃冰箱，同时取授粉7-8天后的种子进行胚和胚乳的分离，分离的胚和胚乳立即存放于冻在液氮中的1.5ml离心管中，收集足够的胚和胚乳存于-80℃冰箱；果荚成熟后，收取种子，于30℃种子干燥箱中存放10天后取>100颗种子存样于-80℃冰箱。

将上述样品于液氮中磨碎，胚样本的RNA用RNeasy plant mini kit(Qiagen)提取，胚乳样本的RNA用PureLink RNA mini Kit加上RNA isolation aid(Ambion)提取，其余样本参照小量植物RNA提取试剂盒(BioTEKE)的说明书提取总RNA。

取1μg总RNA用1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)合成cDNA。

以上述cDNA为模板，实时RT-PCR使用Green Master Mix kit(Vazyme)，UBQ10基因为内参，仪器为CFX96Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)。用引物对RIG1-JC-F和RIG1-JC-R、UBQ10-JC-F和UBQ10-JC-R分别检测RIG1和UBQ10，上述引物的具体序列如下：

RIG1-JC-F(SEQ ID No.3)：5’-AGCGGTATCAGGTGGCTATG–3’；

RIG1-JC-R(SEQ ID No.4)：5’-TGCGGTGGAGTTAAAATGTCT–3’；

UBQ10-JC-F(SEQ ID No.5)：5’-CGTCTTCGTGGTGGTTTCTAA–3’；

UBQ10-JC-R(SEQ ID No.6)：5’-GGATTATACAAGGCCCCAAAA–3’。

结果如图2所示，RIG1基因在种子，尤其是干种子中的表达远远高于在其它组织中的表达。

实施例2.rig1-1突变体发芽率分析

1)rig1-1突变体中RIG1检测

Col和rig1-1的种子用8％次氯酸钠灭菌8min，ddH2O洗5遍，将洗净的种子播在1/2MS(pH 5.7蔗糖2％)培养基上，光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养10天后，取整株苗于液氮中磨碎，参照小量植物RNA提取试剂盒(BioTEKE)的说明书提取种子的总RNA。

取1μg总RNA用1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)合成cDNA。

取适量cDNA为模板，分别用引物RIG1-JC-F和RIG1-JC-R、UBQ10-JC-F和UBQ10-JC-R进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

PCR扩增在热循环仪(Bio-Rad)上进行，扩增条件为：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，28个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图3所示，rig1-1中未检测到RIG1基因的表达。

2)比较Col野生型和rig1-1突变体的种子的发芽率

将大约50颗新鲜收获的Col野生型和rig1-1突变体的种子用8％次氯酸钠灭菌8min，之后用ddH2O洗5遍。将洗净的种子播在1/2MS(pH 5.7，蔗糖2％)培养基上，光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养7天后将苗移栽到蛭石和营养土2:1混合的基质上，继续光照培养室(21-25℃，16h光照/8h黑暗)生长至果荚成熟。

取刚刚成熟的种子进行种子休眠实验：在培养皿底部放一张滤纸(光圈牌，定性滤纸)，喷上去离子水使滤纸刚刚好完全浸湿，将收取的种子均匀地点在滤纸上，把培养皿用不透气的胶带封实，置于光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养。根据3天后的胚根出现计算种子发芽率。

结果如图4所示，rig1-1突变体的发芽率低于野生型的发芽率。这初步表明RIG1基因负调控种子休眠。

实施例3.rig1-1:pUBQ10-RIG1过表达突变株发芽率分析

1)以rig1-1突变体为背景的过表达株系rig1-1:pUBQ10-RIG1的构建

A.拟南芥基因组DNA提取

使用包含2％CTAB、100mM Tris-HCl、20mM EDTA和1.4M NaCl的溶液来提取基因组DNA。

B.以步骤A获得的基因组DNA为模板，以引物UBQ10-F和UBQ10-R进行PCR扩增，获得UBQ10启动子的序列1.3kb(如SEQ ID No.16所示)。PCR反应体系如下：

PCR扩增在热循环仪(Bio-Rad)上进行，扩增条件为：98℃变性15秒，58℃退火10秒，68℃延伸90秒，30个循环；68℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认产物大小。

以实施例2中Col的cDNA为模板，用引物RIG1-F和RIG1-R进行PCR扩增获得RIG1的cDNA序列(如SEQ ID No.1所示)；PCR反应体系如下：

扩增条件为：95℃变性30秒，58℃退火10秒，72℃延伸90秒，30个循环；68℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认产物大小。

将上述两个PCR产物进行等比例混合，并稀释50倍，以此稀释产物为模板，以引物UBQ10-F和RIG1-R进行PCR扩增，获得pUBQ10-RIG1融合产物。反应体系同UBQ10启动子的扩增，扩增条件为：98℃变性15秒，58℃退火10秒，68℃延伸3分钟，30个循环；68℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认产物大小。

将上述融合产物克隆至载体pCAMBIA1300(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)中，获得pUBQ10-RIG1过表达载体，酶切位点分别为Hind III和BamHI。

上述引物的具体序列如下：

UBQ10-F：5’-CAGTGCCAAGCTTCGGGAATATCCATAACCCACC–3’(SEQ ID No.7)；

UBQ10-R：5’-tctcattttgctcatCTCTATCAATGGTGTTTCAAGATCA–3’(SEQ ID No.8)；

RIG1-F：5’-acaccattgatagagATGAGCAAAATGAGAAACCTAGTAG–3’(SEQ ID No.9)；

RIG1-R：5’-TACCCGGGGATCCTCAGGAGTGAGTGACATAATGTCTT–3’(SEQ ID No.10)。

C.将步骤B获得的过表达载体pUBQ10-RIG1转入农杆菌，进一步转入拟南芥rig1-1突变体中，经潮霉素筛选得到过表达突变株系rig1-1:pUBQ10-RIG1。

2)RIG1表达检测

Col、rig1-1、过表达突变株系rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)的干种子(干燥2个月)中RIG1基因的表达通过实时RT-PCR检测，具体操作步骤如下：

A.分别取200颗左右Col、rig1-1、过表达突变株系rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)的干种子(干燥2个月)于液氮中磨碎，参照小量植物RNA提取试剂盒(BioTEKE)的说明书提取种子的总RNA。

B.取1μg总RNA用1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)合成cDNA。

C.以上述cDNA为模板，实时RT-pcr使用Green Master Mix kit(Vazyme)，UBQ10基因为内参，仪器为CFX96Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)。用引物对RIG1-JC-F和RIG1-JC-R、UBQ10-JC-F和UBQ10-JC-R分别检测RIG1和UBQ10。

结果如图5所示，Col野生型、rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)过表达突变体均能表达RIG1，而rig1-1突变体基本不表达RIG1。

3)Col、rig1-1、rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)的发芽率分析

将大约50颗新鲜收获的Col、rig1-1、rig1-1:pUBQ10-RIG1(L5)和rig1-1:pUBQ10-RIG1(L11)的种子用8％次氯酸钠灭菌8min，ddH2O洗5遍，将洗净的种子播在1/2MS(pH 5.7蔗糖2％)培养基上，光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养7天后将苗移栽到蛭石和营养土2:1混合的基质上，光照培养室(21-25℃，16h光照/8h黑暗)生长至果荚成熟。

取刚刚成熟的种子进行种子休眠实验：在培养皿底部放一张滤纸(光圈牌，定性滤纸)，喷上去离子水使滤纸刚刚好完全浸湿，将收取的种子均匀地点在滤纸上，把培养皿用不透气的胶带封实，置于光照培养箱(21-25℃，16h光照/8h黑暗)培养。根据3天后的胚根出现计算种子发芽率。

结果如图6所示，2株过表达突变株的发芽率均高于野生型的发芽率。这进一步表明RIG1基因能负调控种子休眠，RIG1的过表达能缩短种子的休眠时间。

实施例4.C24背景的突变株系rig1-2的发芽率分析

1)C24背景的RIG1基因的CRISPR/Cas9突变株系rig1-2的构建

A.拟南芥C24野生型DNA的提取：

采用授粉后7-8天的C24野生型的种子进行胚芽和胚乳的解剖。解剖的胚乳和胚芽在室温下置于1.5ml管中，胚芽用0.3M山梨醇和5mM脂肪酸甲酯磺酸盐(Mes)pH 5.7进行洗涤，除去来自胚乳的杂质DNA。使用包含2％CTAB、100mM Tris-HCl、20mM EDTA和1.4M NaCl的溶液来提取基因组DNA。

B.CRISPR/Cas9载体的构建：

在金斯瑞生物科技有限公司合成两端携带EcoRI酶切位点的AtU6-26-sgRNA的DNA序列，如SEQ ID No.11所示。将该DNA片段插入pEASY-Blunt载体(全式金生物公司)，获得了pCAt06载体。具体操作根据pEASY-Blunt cloning kit说明书进行。通过测序确认载体的正确性。

以pCAt06载体DNA为模板，以引物RIG1-F2和RIG1-R2进行PCR扩增获得插入了CRISPR/Cas9靶点(如SEQ ID No.12所示)的pCAt06载体；PCR反应体系如下：

PCR扩增在热循环仪(Bio-Rad)上进行，扩增条件为：98℃变性15秒，58℃退火10秒，68℃延伸3分钟，30个循环；68℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳确认产物大小。

上述引物的具体序列如下：

RIG1-F2：5’–GCGAGGCTTGGATGTCACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC–3’(SEQ ID No.13)；

RIG1-R2：5’–ACGTGACATCCAAGCCTCGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTGTATATAAACTCA–3’(SEQ ID No.14)。

用EcoR I酶切上述载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收含有靶序列的片段。

在金斯瑞生物科技有限公司合成5’端携带XbaI，3’端携带KpnI酶切位点的2×35S-Cas9-Nost的DNA序列，如SEQ ID No.15所示。将该DNA片段插入pEASY-Blunt载体(全式金生物公司)，形成中间载体Z-Blunt。对Z-Blunt和目标载体pCAMBIA1300进行Xbal1和Kpn1(NEB)双酶切，反应体系如下：

37℃反应过夜。

酶切产物进行琼脂糖电泳，对2×35S-C as9-Nost及线性化pCAMBIA1300进行切胶回收，用T4酶将2×35S-C as9-Nost片段连接到pCAMBIA1300线性化载体，获得pCAT01表达载体。T4酶连体系如下：

T4酶连反应体系与4℃冰箱中反应过夜。

用EcoR I酶切CRISPR/Cas9载体pCAT01，获得线性化pCAT01载体；用T4酶将上述从pCAt06载体酶切获得的含有靶序列的片段连接到pCAT01载体，获得pCAT01-RIG1表达载体。T4酶连体系如下：

T4酶连反应体系与4℃冰箱中反应过夜。

C.CRISPR/Cas9突变株系rig1-2的获得：

将步骤B获得的表达载体pCAT01-RIG1转入农杆菌，进一步转入拟南芥C24，经PCR和测序验证得到突变株系rig1-2。该突变体在RIG1基因起始密码子ATG下游+1154位核苷酸后面插入了单碱基A，导致蛋白编码移框，改变蛋白的序列。图7是rig1-2的突变位点示意图。

2)C24和rig1-2的发芽率分析

采用与实施例2和实施例3中相同的方法检测C24和rig1-2的发芽率。如图8所示，rig1-2的发芽率明显低于C24野生型。由于rig1-2的RIG1的蛋白编码移框，因此，rig1-2不表达RIG1。上述情况表明RIG1的表达缺失会延长种子的休眠期。

实施例5.多种植物中RIG1序列及功能域、结构域分析

为了将在拟南芥中获得结果延伸到其它的植物中，利用Bioedict软件对拟南芥的RIG1(如SEQ ID No.2所示)及其在甘蓝、芜菁、山嵛菜、亚麻芥、鹰嘴豆、大豆、中粒咖啡和芝麻这些双子叶植物中的同源蛋白的氨基酸序列进行比对，结果如图9。利用MEGA7.0软件(http://www.megasoftware.net)的近邻结合法分析了拟南芥、亚麻荠、甘蓝、芜菁、山嵛菜和大豆等物种的RIG1同源基因的氨基酸序列，构建系统进化树(图10)，研究基因的进化关系以及潜在生物学功能。甘蓝(Brassica olerace a var.oleracea)XP_013624267.1、芜菁(Brassica rapa)XP_009132069.1、山嵛菜(Eutrema salsugineum)XP_006414073、亚麻芥(Camelina sativa)XP_010439827、鹰嘴豆(Cicer arietinum)XP_004486274.1、大豆(Glycine max)XP_003541699.1、大豆(Glycine max)XP 003547173.2、中粒咖啡(Coffea canephora)CDO96810.1和芝麻(Sesamum indicum)XP_011101398.1与拟南芥的RIG1蛋白的相似度分别为82％、82％、82％、88％、54％、53％、52％、54％和55％，其中，RIG1、亚麻芥XP_010439827、山嵛菜XP_006414073、大豆XP_003541699.1、鹰嘴豆XP_004486274.1、中粒咖啡CDO96810.1和芝麻XP_011101398.1均含有保守的卷曲双螺旋结构域。

对上述具有与拟南芥的RIG1至少有50％同源性的同源蛋白的植物进行了类似的序列突变以及发芽率分析，结果表明突变了这些植物中的RIG1同源蛋白使之丧失功能后，种子的休眠期变长了、发芽率降低了。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种调控植物种子休眠时间的方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 699

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

atgagcaaaa tgagaaacct agtagaagaa aagttcctag agttctatga gagttgggtt 60

attcaacttg agctatatct tcatcaactt ttaattgctc ataacaataa cactatgagt 120

gagaccgagc ttcgacattt gatctcgaag ctaactacac atcacaaagc ttattataca 180

gccaaatggg cagccataag agaagatgtc ttagcttttt tcggatcagt ttggttaaac 240

ccgttagaga atgcttgctc ttggttaacc ggatggaaac cgtcgatggt gtttcggatg 300

gttgataggc tgaggaagtc gagagtggtg cttgtggagg ctcaggtgaa gaaattggag 360

gagctgagag ttaagaccaa gttcgatgag caaaaaattg agagagagat ggagcggtat 420

caggtggcta tggctgatcg gaaaatggta gagctggcga ggcttggatg tcacgtcgga 480

ggagaatcgg tgatggtggt ggaggcagcg gtgagaggat tatcgatggg tcttgagaaa 540

atggtgaagg ctgcggattg tgtgcggctg aaaacgctta aaggtatatt agacatttta 600

actccaccgc aatgcgttga gtttttggca gcggcggcta cgtttcaggt tcagttacgt 660

cggtggggaa accgaagaca ttatgtcact cactcctga 699

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 2

Met Ser Lys Met Arg Asn Leu Val Glu Glu Lys Phe Leu Glu Phe Tyr

1 5 10 15

Glu Ser Trp Val Ile Gln Leu Glu Leu Tyr Leu His Gln Leu Leu Ile

20 25 30

Ala His Asn Asn Asn Thr Met Ser Glu Thr Glu Leu Arg His Leu Ile

35 40 45

Ser Lys Leu Thr Thr His His Lys Ala Tyr Tyr Thr Ala Lys Trp Ala

50 55 60

Ala Ile Arg Glu Asp Val Leu Ala Phe Phe Gly Ser Val Trp Leu Asn

65 70 75 80

Pro Leu Glu Asn Ala Cys Ser Trp Leu Thr Gly Trp Lys Pro Ser Met

85 90 95

Val Phe Arg Met Val Asp Arg Leu Arg Lys Ser Arg Val Val Leu Val

100 105 110

Glu Ala Gln Val Lys Lys Leu Glu Glu Leu Arg Val Lys Thr Lys Phe

115 120 125

Asp Glu Gln Lys Ile Glu Arg Glu Met Glu Arg Tyr Gln Val Ala Met

130 135 140

Ala Asp Arg Lys Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Gly Cys His Val Gly

145 150 155 160

Gly Glu Ser Val Met Val Val Glu Ala Ala Val Arg Gly Leu Ser Met

165 170 175

Gly Leu Glu Lys Met Val Lys Ala Ala Asp Cys Val Arg Leu Lys Thr

180 185 190

Leu Lys Gly Ile Leu Asp Ile Leu Thr Pro Pro Gln Cys Val Glu Phe

195 200 205

Leu Ala Ala Ala Ala Thr Phe Gln Val Gln Leu Arg Arg Trp Gly Asn

210 215 220

Arg Arg His Tyr Val Thr His Ser

225 230

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-JC-F

<400> 3

agcggtatca ggtggctatg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-JC-R

<400> 4

tgcggtggag ttaaaatgtc t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBQ10-JC-F

<400> 5

cgtcttcgtg gtggtttcta a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBQ10-JC-R

<400> 6

ggattataca aggccccaaa a 21

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBQ10-F

<400> 7

cagtgccaag cttcgggaat atccataacc cacc 34

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBQ10-R

<400> 8

tctcattttg ctcatctcta tcaatggtgt ttcaagatca 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-F

<400> 9

acaccattga tagagatgag caaaatgaga aacctagtag 40

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-R

<400> 10

tacccgggga tcctcaggag tgagtgacat aatgtctt 38

<210> 11

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AtU6-26-sgRNA

<400> 11

gaattcaagc ttcgttgaac aacggaaact cgacttgcct tccgcacaat acatcatttc 60

ttcttagctt tttttcttct tcttcgttca tacagttttt ttttgtttat cagcttacat 120

tttcttgaac cgtagctttc gttttcttct ttttaacttt ccattcggag tttttgtatc 180

ttgtttcata gtttgtccca ggattagaat gattaggcat cgaaccttca agaatttgat 240

tgaataaaac atcttcattc ttaagatatg aagataatct tcaaaaggcc cctgggaatc 300

tgaaagaaga gaagcaggcc catttatatg ggaaagaaca atagtatttc ttatataggc 360

ccatttaagt tgaaaacaat cttcaaaagt cccacatcgc ttagataaga aaacgaagct 420

gagtttatat acagctagag tcgaagtagt gattgggtct tcgagaagac ctgttttaga 480

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 540

gtcggtgctt ttttgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgtttt 600

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gccccgggga attc 644

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRISPR/Cas9靶点

<400> 12

gcgaggcttg gatgtcacgt 20

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-F2

<400> 13

gcgaggcttg gatgtcacgt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RIG1-R2

<400> 14

acgtgacatc caagcctcgc aatcactact tcgactctag ctgtatataa actca 55

<210> 15

<211> 5324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2×35S-Cas9-Nost

<400> 15

tctagaggtc aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac 60

agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct 120

cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg 180

tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc 240

cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 300

tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgataac atggtggagc acgacacact 360

tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt 420

tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 480

tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 540

aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 600

gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 660

tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc 720

ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacctcg actctagagg atcccatgga 780

ctataaggac cacgacggag actacaagga tcatgatatt gattacaaag acgatgacga 840

taagatggcc ccaaagaaga agcggaaggt cggtatccac ggagtcccag cagccgacaa 900

gaagtacagc atcggcctgg acatcggcac caactctgtg ggctgggccg tgatcaccga 960

cgagtacaag gtgcccagca agaaattcaa ggtgctgggc aacaccgacc ggcacagcat 1020

caagaagaac ctgatcggag ccctgctgtt cgacagcggc gaaacagccg aggccacccg 1080

gctgaagaga accgccagaa gaagatacac cagacggaag aaccggatct gctatctgca 1140

agagatcttc agcaacgaga tggccaaggt ggacgacagc ttcttccaca gactggaaga 1200

gtccttcctg gtggaagagg ataagaagca cgagcggcac cccatcttcg gcaacatcgt 1260

ggacgaggtg gcctaccacg agaagtaccc caccatctac cacctgagaa agaaactggt 1320

ggacagcacc gacaaggccg acctgcggct gatctatctg gccctggccc acatgatcaa 1380

gttccggggc cacttcctga tcgagggcga cctgaacccc gacaacagcg acgtggacaa 1440

gctgttcatc cagctggtgc agacctacaa ccagctgttc gaggaaaacc ccatcaacgc 1500

cagcggcgtg gacgccaagg ccatcctgtc tgccagactg agcaagagca gacggctgga 1560

aaatctgatc gcccagctgc ccggcgagaa gaagaatggc ctgttcggaa acctgattgc 1620

cctgagcctg ggcctgaccc ccaacttcaa gagcaacttc gacctggccg aggatgccaa 1680

actgcagctg agcaaggaca cctacgacga cgacctggac aacctgctgg cccagatcgg 1740

cgaccagtac gccgacctgt ttctggccgc caagaacctg tccgacgcca tcctgctgag 1800

cgacatcctg agagtgaaca ccgagatcac caaggccccc ctgagcgcct ctatgatcaa 1860

gagatacgac gagcaccacc aggacctgac cctgctgaaa gctctcgtgc ggcagcagct 1920

gcctgagaag tacaaagaga ttttcttcga ccagagcaag aacggctacg ccggctacat 1980

tgacggcgga gccagccagg aagagttcta caagttcatc aagcccatcc tggaaaagat 2040

ggacggcacc gaggaactgc tcgtgaagct gaacagagag gacctgctgc ggaagcagcg 2100

gaccttcgac aacggcagca tcccccacca gatccacctg ggagagctgc acgccattct 2160

gcggcggcag gaagattttt acccattcct gaaggacaac cgggaaaaga tcgagaagat 2220

cctgaccttc cgcatcccct actacgtggg ccctctggcc aggggaaaca gcagattcgc 2280

ctggatgacc agaaagagcg aggaaaccat caccccctgg aacttcgagg aagtggtgga 2340

caagggcgct tccgcccaga gcttcatcga gcggatgacc aacttcgata agaacctgcc 2400

caacgagaag gtgctgccca agcacagcct gctgtacgag tacttcaccg tgtataacga 2460

gctgaccaaa gtgaaatacg tgaccgaggg aatgagaaag cccgccttcc tgagcggcga 2520

gcagaaaaag gccatcgtgg acctgctgtt caagaccaac cggaaagtga ccgtgaagca 2580

gctgaaagag gactacttca agaaaatcga gtgcttcgac tccgtggaaa tctccggcgt 2640

ggaagatcgg ttcaacgcct ccctgggcac ataccacgat ctgctgaaaa ttatcaagga 2700

caaggacttc ctggacaatg aggaaaacga ggacattctg gaagatatcg tgctgaccct 2760

gacactgttt gaggacagag agatgatcga ggaacggctg aaaacctatg cccacctgtt 2820

cgacgacaaa gtgatgaagc agctgaagcg gcggagatac accggctggg gcaggctgag 2880

ccggaagctg atcaacggca tccgggacaa gcagtccggc aagacaatcc tggatttcct 2940

gaagtccgac ggcttcgcca acagaaactt catgcagctg atccacgacg acagcctgac 3000

ctttaaagag gacatccaga aagcccaggt gtccggccag ggcgatagcc tgcacgagca 3060

cattgccaat ctggccggca gccccgccat taagaagggc atcctgcaga cagtgaaggt 3120

ggtggacgag ctcgtgaaag tgatgggccg gcacaagccc gagaacatcg tgatcgaaat 3180

ggccagagag aaccagacca cccagaaggg acagaagaac agccgcgaga gaatgaagcg 3240

gatcgaagag ggcatcaaag agctgggcag ccagatcctg aaagaacacc ccgtggaaaa 3300

cacccagctg cagaacgaga agctgtacct gtactacctg cagaatgggc gggatatgta 3360

cgtggaccag gaactggaca tcaaccggct gtccgactac gatgtggacc atatcgtgcc 3420

tcagagcttt ctgaaggacg actccatcga caacaaggtg ctgaccagaa gcgacaagaa 3480

ccggggcaag agcgacaacg tgccctccga agaggtcgtg aagaagatga agaactactg 3540

gcggcagctg ctgaacgcca agctgattac ccagagaaag ttcgacaatc tgaccaaggc 3600

cgagagaggc ggcctgagcg aactggataa ggccggcttc atcaagagac agctggtgga 3660

aacccggcag atcacaaagc acgtggcaca gatcctggac tcccggatga acactaagta 3720

cgacgagaat gacaagctga tccgggaagt gaaagtgatc accctgaagt ccaagctggt 3780

gtccgatttc cggaaggatt tccagtttta caaagtgcgc gagatcaaca actaccacca 3840

cgcccacgac gcctacctga acgccgtcgt gggaaccgcc ctgatcaaaa agtaccctaa 3900

gctggaaagc gagttcgtgt acggcgacta caaggtgtac gacgtgcgga agatgatcgc 3960

caagagcgag caggaaatcg gcaaggctac cgccaagtac ttcttctaca gcaacatcat 4020

gaactttttc aagaccgaga ttaccctggc caacggcgag atccggaagc ggcctctgat 4080

cgagacaaac ggcgaaaccg gggagatcgt gtgggataag ggccgggatt ttgccaccgt 4140

gcggaaagtg ctgagcatgc cccaagtgaa tatcgtgaaa aagaccgagg tgcagacagg 4200

cggcttcagc aaagagtcta tcctgcccaa gaggaacagc gataagctga tcgccagaaa 4260

gaaggactgg gaccctaaga agtacggcgg cttcgacagc cccaccgtgg cctattctgt 4320

gctggtggtg gccaaagtgg aaaagggcaa gtccaagaaa ctgaagagtg tgaaagagct 4380

gctggggatc accatcatgg aaagaagcag cttcgagaag aatcccatcg actttctgga 4440

agccaagggc tacaaagaag tgaaaaagga cctgatcatc aagctgccta agtactccct 4500

gttcgagctg gaaaacggcc ggaagagaat gctggcctct gccggcgaac tgcagaaggg 4560

aaacgaactg gccctgccct ccaaatatgt gaacttcctg tacctggcca gccactatga 4620

gaagctgaag ggctcccccg aggataatga gcagaaacag ctgtttgtgg aacagcacaa 4680

gcactacctg gacgagatca tcgagcagat cagcgagttc tccaagagag tgatcctggc 4740

cgacgctaat ctggacaaag tgctgtccgc ctacaacaag caccgggata agcccatcag 4800

agagcaggcc gagaatatca tccacctgtt taccctgacc aatctgggag cccctgccgc 4860

cttcaagtac tttgacacca ccatcgaccg gaagaggtac accagcacca aagaggtgct 4920

ggacgccacc ctgatccacc agagcatcac cggcctgtac gagacacgga tcgacctgtc 4980

tcagctggga ggcgacaaaa ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa 5040

aaagtaagga tccaggcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 5100

tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 5160

taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 5220

atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 5280

cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attgccaagg tacc 5324

<210> 16

<211> 1320

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 16

cgggaatatc cataacccac ctgcatcata aattcaggag acacacatta aatgcaactg 60

aaaaatacta tacatataaa aaacaaatgg aatgtcgata ctacacattt ataaacctaa 120

ataccaatta tcatttgact attttaaaca aacaaatata gattttgcaa attttctgat 180

aaaaaaatgg agttaaaaca caatcaagat cctaatatga cataacaaaa aacttcttaa 240

aagaacttca ttacttacac gagcaatgct tgttttggct ccaaacttgg tacaaaaaca 300

agatcaacac ttcttcaaca gcaatgtacg ttcttaattt tttattaatt attatcaata 360

atttttttaa tattatttga tgtaatgatg attttgcatt aattgtgaca atagtcacat 420

ctaaactttt ttggggcatt aaatgttgat gtcacttcgg aataatgaaa ataatctcac 480

ttgtaacgga accgaatcgc gtcaacgtga aacaaaaaat cttcaactga atcggaacag 540

tgtacgtaac taaacctgct aaactaaacc gtacatttca acagttacta agagagaagc 600

gcaagggcag aaacgtcatt ttgcaggcga aaagacaaat ggtgaaaacc acatttgact 660

ttaacaatcc atggaaataa aacatggtca acgggtgtgg cctgcaattt acccttatat 720

aaacactaat atatatatct aggctagtac agtttttcct ctacgacatt tacaaatctt 780

tttttttctt tttcttaaaa ctctcattaa aaaaacaatg ataaatcaaa catgcttcgt 840

tccggcttaa ttactgctct tccccatctc aagcgcattc ccatactccc atcctctaca 900

aaccttgacc aataccagtg tgacctccac acttgaccca tctcctcaat cggaatacct 960

ttcgtctccg gcaagaatct ttaatgggtc ggatttgtag atttacggtt taatgggtcg 1020

gatctagata gttttaatca atctttttat aacattaccg ttggataata taagtaagaa 1080

tatactgtag catagatact gatgatttta tgtgaggctt tcattgactt aagagccacg 1140

taacccaata aaaatgggtc aagcccaaat gcggttcatt tgatatgtga atgaatgata 1200

ttaaaaccaa attctatcgt gaactatctt tacaaaacaa tcactttctc tctcgctctc 1260

tctgtttctt gactctcttc ttcattagtc tccattgatc ttgaaacacc attgatagag 1320

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