丝状真菌里氏木霉异源表达Insulin Glargine的初步研究

• 花匠小妙招
• 2024-11-20 12:19

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目录

摘要

英文摘要

符号说明

1．1胰岛素及其生产历史

1．1．1胰岛素简介

1．1．2胰岛素的生产历史

1．1．3胰岛素类似物

1．2胰岛素蛋白表达形式

1．2．1双链表达形式

1．2．2单链表达形式

1．3丝状真菌里氏木霉-良好的蛋白合成分泌底盘细胞

1．4本论文研究意义及主要内容

第二章里氏木霉分泌表达IG蛋白尝试

2．1材料与方法

2．1．1菌株和质粒

2．1．2PCR引物

2．1．3主要实验仪器和试剂

2．1．4主要培养基和培养条件

2．1．5分子生物学操作方法

2．1．6S1r、S1HCr基因表达盒密码子优化

2．1．7S1r、S1HCr基因表达盒构建

2．1．8里氏木霉的遗传转化

2．1．9转化子的筛选鉴定

2．1．10发酵液中IG蛋白测定

2．1．11 AKTA纯化

2．1．12生物信息学软件及分析

2．2．2S1r及S1HCr菌株构建

2．2．3IG蛋白基因的表达水平检测

2．2．5S1HCr菌株AKTA纯化分析

2．2．6S1r和S1HCr菌株UPR响应相关基因的转录分析

2．2．7S1r和S1HCr菌株ERAD途径相关基因的转录分析

2．2．8S1r和S1HCr菌株蛋白折叠监护相关基因的转录分析

2．3本章小结

第三章利用载体蛋白融合策略在里氏木霉中表达IG

3．1材料与方法

3．1．1菌株和质粒

3．1．2PCR引物

3．1．3主要实验仪器和试剂

3．1．4主要培养基和培养条件

3．1．5分子生物学操作方法

3．1．6各基因表达盒密码子优化

3．1．7S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r、SAC1r、SGC1r基因表达盒构建

3．1．8里氏木霉的遗传转化

3．1．9转化子的筛选鉴定

3．1．10发酵液中IG蛋白测定

3．2实验结果与分析

3．2．1S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r表达菌株构建

3．2．2S1CLr、S1C2r、S2C2r、S1C1r菌株中IG蛋白和载体蛋白基因转录水平检测

3．2．3S1CLr、S1C2r、S1C1r、S2C2r菌株的发酵液Tricine-SDS-PAGE分析及蛋白质谱分析

3．2．4S1CLr、S1C1r、S1C2r、S2C2r菌株蛋白分泌相关基因的转录分析

3．2．5S1C1r菌株1L发酵罐培养及质谱分析

3．2．6SAC1r、SGC1r表达菌株构建

3．2．7SAC1r、SGC1r菌株中IG蛋白和载体蛋白基因表达水平检测

3．2．8S1C1r、SAC1r、SGC1r菌株中发酵液Tricine-SDS-PAGE分析及蛋白质谱分析

3．2．9SGC1r和SAC1r菌株蛋白分泌相关基因的转录分析

3．3本章小结

第四章利用报告蛋白融合策略在里氏木霉中表达IG

4．1材料与方法

4．1．1所用菌株和质粒

4．1．2PCR引物

4．1．3主要实验仪器和试剂

4．1．6BgIr、E2Ir、E3Ir基因表达盒构建

4．1．7IBgr、IE2r、IE3r表达盒构建

4．1．8BgIr、IBgr、E2Ir、IE2r、E3Ir、IE3r六种载体分别转化里氏木霉

4．1．9转化子的筛选鉴定

4．1．10发酵液中IG蛋白测定

4．2实验结果与分析

4．2．1各菌株表达盒构建

4．2．2BgIr、IBgr菌株七叶苷葡萄糖筛选平板分析

4．2．3E2Ir、IE2r菌株CMC葡萄糖筛选平板及圈径比分析

4．2．4E3Ir、IE3r菌株CMC葡萄糖筛选平板及圈经比分析

4．2．5BgIr、IBgr、E2Ir、E3Ir及IE3r基因表达菌株PCR验证

4．2．6BgIr、IBgr菌株中黑曲霉bglA和IG蛋白基因的表达水平检测

4．2．8E3Ir、IE3r菌株中里氏木霉eg3和IG蛋白基因的表达水平检测

4．2．9IBgr、BgIr菌株发酵液SDS-PAGE分析

4．2．10部分E2Ir菌株发酵液SDS-PAGE分析

4．2．11E3Ir、IE3r菌株发酵液SDS-PAGE分析

4．2．12IBgr、BgIr菌株UPR及ERAD途径相关因子的表达水平检测

4．2．13E2Ir菌株UPR及ERAD途径相关因子的表达水平检测

4．2．14E3Ir菌株UPR响应相关因子的表达水平检测

4．2．15IE3r菌株UPR响应相关因子的表达水平检测

4．3本章小结

全文总结

参考文献

附录

致谢

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