CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法与流程
本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种crispr/cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。
背景技术：
crispr（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）是生物进化历程中病毒和细菌之间进行斗争而产生的免疫武器，简而言之就是病毒能够把自身的基因整合进入细菌体内，利用细菌为自己的基因进行复制，而细菌为了清除外来入侵的病毒基因，进化出细菌特有的免疫系统——crispr系统，细菌可以利用该系统把病毒基因从自身的染色体上切除。基于此原理，目前科学家们开发了一种针对cas9蛋白操作的技术，可以对多种靶细胞的dna进行切除，该技术被称之为crispr/cas9基因编辑系统，已成为生命科学领域最热门的技术之一。
现有crispr/cas9基因编辑系统在动植物中的研究应用已经非常成熟，利用该技术能够在全基因组水平进行基因编辑和功能筛选。而基因编辑完成后即需基因编辑后突变体进行筛选鉴定。现有筛选鉴定crispr/cas9基因编辑突变体的常规流程是：①提取基因编辑组织基因组dna；②以基因组dna为模板，使用靶点引物进行pcr扩增；③胶回收pcr产物，连接t载体，转化感受态细胞；④随机挑取多个单克隆进行菌落pcr验证，对阳性克隆进行一代测序（sanger测序），并对测序结果进行比对分析。可以看出，该鉴定流程不仅费时费力，而且成本高。
针对现有筛选鉴定的缺陷，现有技术也有一定改进。例如中国专利（申请号201711351623.3）公开的一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其涉及的检测方法是针对突变位点设计特异性引物，通过msbsppcr（mutationsitesbasedspecificprimerspcr）来筛选鉴定crispr/cas9基因编辑纯合突变体。尽管该方法在时间和成本上相比于常规的鉴定方法有一定的优势，然而尚存在一些局限和不足：①该方法依赖于特异的引物和特异的条件，对于一个新的位点，可能需要花时间和精力摸索比较合适的引物和pcr的条件；②该方法中的两对特异性引物需要严格地设计在grna的识别位点处，容易出现引物扩增不特异的情况，所以该方法不太适合于规模化的应用；③该方法原理上是基于在特定位点发生突变，从而与引物不能完全匹配，如果编辑事件发生在pam序列的下游的情况，就可能检测不到；④对于该方法能不能应用到突变体库的检测，要看具体的情况，如果突变位点已知而且该位点在全基因组范围内比较特异的话，是可以用于突变体的辅助筛选纯合体，但是如果突变体大部分突变位点还是未知的话，这个方法可能暂时还用不上。
综上，针对crispr/cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法仍有必要进行进一步探索，从而为相关实验研究奠定良好技术基础。
技术实现要素：
本申请目的在于提供一种准确筛选鉴定crispr/cas9基因编辑突变体的方法，可为在不同物种中筛选鉴定crispr/cas9基因编辑突变体提供一定技术支撑，从而便于相关基因编辑技术的推广和应用。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种crispr/cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，具体包括如下步骤：
（一）获得crispr/cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组dna
以烟草rax23、myc2b基因编辑突变体为例，具体crispr/cas9基因编辑突变体获得过程为：
首先构建目标基因的crispr/cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘（0.5~1cm2），通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为crispr/cas9基因编辑突变体；最后采集适量crispr/cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组dna备用，以便进一步检测、筛选或应用；
针对目的基因的具体crispr/cas9载体构建时，首先根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置（protospacer-adjacentmotif，pam），并针对此靶点进行引物设计，然后参考现有常规操作构建crispr/cas9载体；
就目标基因rax23、myc2b而言，具体靶点序列及所设计引物序列如下：
。
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的crispr/cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计pcr引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游大约200bp位置设计特异性检测引物，引物设计时，参考如下：
正向检测引物5’端增加正向前序列p1：5’-gtgcagtgtcgagattgc-3’，形成“p1+正向检测引物”；
反向检测引物5’端需要增加反向前序列p2：5’-gattcagatgagttgatc-3’，形成“p2+反向检测引物”；
当然，不同目的基因靶位点的特异性检测引物各不相同，需要根据目的基因进行分别设计；
（2）对目的片段进行首轮pcr扩增
以提取的烟草基因组dna为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的pcr引物进行扩增；pcr过程中，20μl反应体系参考设计如下：
基因组dna（100ng/μl），1.0μl；
p1+正向检测引物（10μmol/l），1.0μl；
p2+反向检测引物（10μmol/l），1.0μl；
2×pcrsupermix，10μl；
ddh2o补至20μl；
pcr反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
对pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，以避免或减少第二轮pcr的非特异性扩增；
（3）第二轮pcr
高通量测序是多样本平行混合测序，为了能够区分不同的样本，需要给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的barcode序列标签，若某个样本序列中不含barcode序列标签，就无法追溯该样本来源，进而在后续的生物信息学分析过程中会产生意义不明或错误的信息。因此，需要在上游引物的5’端加入测序接头和barcode标签序列，形成融合引物“5’-测序接头+barcode标签+上游引物-3’”作为测序端，下游引物则可保持不变；
而为便于批量检测样本，第二轮pcr反应可在96孔板中进行，其中有一孔为control，pcr模板则是蒸馏水；
综上，第二轮pcr反应中，
上游引物为：“5’-测序接头+不同的barcode标签+2.1中正向前序列p1”，
下游引物同则为反向前序列p2（仅仅是p2还是“p2+反向检测引物”）；
测序接头长度为20-25bp，序列相同；
第二轮pcr扩增过程中，在96孔板的每孔分别加入步骤（2）中胶回收的首轮pcr产物作为模板，再分别加入带有不同barcode标签的第二轮pcr上游引物，以及下游引物，
20μl的pcr反应体系参考设计如下：
胶回收的首轮pcr产物（100ng/μl），1.0μl；
第二轮pcr上游引物（10μmol/l），1.0μl；
第二轮pcr下游引物（10μmol/l），1.0μl；
2×pcrsupermix，10μl；
ddh2o补至20μl；
具体操作过程中，每孔加入相同的试剂时可使用排枪，吹打混匀后整板离心，用封口膜将96孔板封好，放入pcr仪；
pcr反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮pcr反应结束后，使用排枪把96孔板不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，control孔单独处理；
1%琼脂糖凝胶电泳检测混合后的pcr产物，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，提高文库质量，避免或减少杂带对测序的不利影响；
胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0ng/μl，总质量≥30ng，总体积≥15μl；使用illuminahiseq2500对混合样本进行高通量测序，测序数据1.0-1.5g。
总体上，本申请筛选鉴定crispr/cas9基因编辑突变体过程中，配合高通量测序技术应用，可以部分克服现有鉴定过程繁琐的缺陷，而且具有可以批量应用的优点，尤其是相较于现有常规的sanger测序，本申请的高通量测序可以大幅降低测序成本，表现出较好的实用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例
以烟草crispr/cas9基因编辑突变体为例，本实施例就具体crispr/cas9基因编辑突变体的筛选鉴定过程介绍说明如下。
（一）获得crispr/cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组dna
以烟草crispr/cas9基因编辑突变体为例，其获得过程为：首先构建目标基因（本实施例分别以rax23、myc2b基因为例）的crispr/cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘（0.5~1cm2），通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为crispr/cas9基因编辑突变体。最后采集适量crispr/cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组dna备用，以便进一步检测、筛选或应用。
针对目的基因的具体crispr/cas9载体构建时，首先根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置（protospacer-adjacentmotif，pam），并针对此靶点进行引物设计，然后参考现有常规操作构建crispr/cas9载体。
就本实施例所涉及的具体目标基因rax23、myc2b而言，本实施例中所选择的具体靶点序列及所设计引物序列如下：
。
将所构建crispr/cas9载体转化植物体时，具体操作可参考如下：
将烟草种子用次氯酸钠（30%，naclo）消毒30min，然后用无菌水冲洗5~6次，点种至ms培养基中，培养箱内培养；
将培养幼苗叶片消毒后，分切成0.5~1cm2左右大小的正方形（刀片要锋利，切片时要将叶边缘和叶脉去掉，切片时要迅速，防止撕扯，挤压，尽量避免叶片损伤），然后置于含有转染菌液的培养皿中侵染1.5min左右（所述转染菌液事先制备，具体方式为：将转化crispr/cas9载体载体的农杆菌在抗性（卡那霉素和利福霉素抗性）培养基中，28℃摇菌培养至od600=0.6~0.8，集菌，4℃、5000rpm离心10min后收集菌体，用液体ms0（不加糖和琼脂的ms培养基，ph5.8）重悬，调整od600=0.6左右），迅速取出后用无菌滤纸吸干菌液；
将叶片均匀的平铺在不含抗生素的ms分化培养基上（叶表面向上），26℃暗培养2d；暗培养后转入潮霉素抗性的分化培养基中进行选择培养；7-15d为一周期，换新鲜培养基直至叶片分化出小苗；
在小苗（再生苗）长到1~2cm时切下，转入伸长培养基中培养；长到一定高度时转入生根培养基中培养；
待转基因烟草长到3-4片叶，根系发育好后，炼苗1d，再种到含蛭石的育苗盘中，种时将根部培养基洗干净，防止根部腐烂，将育苗盘盖上薄膜，约一周后在膜上扎孔，让其透气，观察生长情况，如有萎蔫就停止透气，若生长良好，可先揭开一半薄膜，隔几天再全部揭开，这一过程不需要在培养间。
烟草基因组dna时，利用qiagen公司的dneasyplantnimi试剂盒提取烟草叶片基因组dna，具体操作可参考如下：
1)称取约100mg植物叶片，在液氮保护下研磨后转入离心管，加入400μl缓冲液ap1和4μlrnasea储备液（100mg/ml），剧烈震荡；
2)65℃条件下温育10min，期间震荡混合2-3次；加入130μl的ap2缓冲液，混匀，冰上放置5min；
3)将裂解液转移至粉色柱中，10000rpm离心2min，转移滤液至一新管中；
4)加入1.5倍体积的ap3/e缓冲液上下吹打混匀，转移至吸附离心柱中，放入2ml收集管；10000rpm离心1min，弃滤液，重复此操作一次；
5)加入500μlaw缓冲液于离心柱，10000rpm离心1min，弃滤液，重复此操作一次；
6)在吸附柱中加入100μltebuffer，室温下静置3min，10000rpm离心1min，测定浓度，-20℃保存备用。
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的crispr/cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计pcr引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游大约200bp位置设计特异性检测引物，引物设计时，参考如下原则：
正向检测引物5’端增加正向前序列p1：5’-gtgcagtgtcgagattgc-3’，形成“p1+正向检测引物”；
反向检测引物5’端需要增加反向前序列p2：5’-gattcagatgagttgatc-3’，形成“p2+反向检测引物”；
（2）对目的片段进行首轮pcr扩增
以提取的烟草基因组dna为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的pcr引物进行扩增；pcr过程中，20μl反应体系参考设计如下：
基因组dna（100ng/μl），1.0μl；
p1+正向检测引物（10μmol/l），1.0μl；
p2+反向检测引物（10μmol/l），1.0μl；
2×pcrsupermix，10μl；
ddh2o补至20μl；
pcr反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
对pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，以避免或减少第二轮pcr的非特异性扩增。
（3）第二轮pcr
高通量测序是多样本平行混合测序，为了能够区分不同的样本，需要给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的barcode序列标签，若某个样本序列中不含barcode序列标签，就无法追溯该样本来源，进而在后续的生物信息学分析过程中会产生意义不明或错误的信息。因此，需要在上游引物的5’端加入测序接头和barcode标签序列，形成融合引物“5’-测序接头+barcode标签+上游引物-3’”作为测序端，下游引物则可保持不变；
而为便于批量检测样本，第二轮pcr反应可在96孔板中进行，其中有一孔为control，pcr模板则是蒸馏水；
综上，第二轮pcr反应中，
上游引物为：“5’-测序接头+不同的barcode标签+2.1中正向前序列p1”，
下游引物同则为反向前序列p2；
测序接头长度为20-25bp，序列相同；
具体参考设计如下：
rax23-f：5'-tctgataatgatcacatggttca-3'，
rax23-r：5'-tgttattagactggtacctgagtg-3'；
myc2b-f：5'-tgcacgacagatcctgcaatag-3'，
myc2b-r：5'-cttcacctttgggatcacgg-3'。
第二轮pcr扩增过程中，在96孔板的每孔分别加入步骤（2）中胶回收的首轮pcr产物作为模板，再分别加入带有不同barcode标签的第二轮pcr上游引物，以及下游引物，
20μl的pcr反应体系参考设计如下：
胶回收的首轮pcr产物（100ng/μl），1.0μl；
第二轮pcr上游引物（10μmol/l），1.0μl；
第二轮pcr下游引物（10μmol/l），1.0μl；
2×pcrsupermix，10μl；
ddh2o补至20μl；
具体操作过程中，每孔加入相同的试剂时可使用排枪，吹打混匀后整板离心，用封口膜将96孔板封好，放入pcr仪；
pcr反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮pcr反应结束后，使用排枪把96孔板不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，control孔单独处理；
1%琼脂糖凝胶电泳检测混合后的pcr产物，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，提高文库质量，避免或减少杂带对测序的不利影响；
胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0ng/μl，总质量≥30ng，总体积≥15μl；使用illuminahiseq2500对混合样本进行高通量测序，测序数据1.0-1.5g。
（5）结果分析
96孔板中每孔对应一个待鉴定的样本，下述表格中列举的是筛选出来的阳性突变体。
从对于上述鉴定过程进行分析，可以看出：传统的鉴定方法是先提取待鉴定样品的dna，使用检测引物进行pcr扩增，连接转化，挑取单克隆进行测序分析。一个待鉴定样品平均需要挑取大约15个单克隆，一个单克隆的sanger测序大约需要20元，检测96个样品则需要测序费用15×20×96=28800元。而本申请所提供的方法一次可以鉴定96个样品，测序费用大约只需要2000元，比传统的鉴定方法测序成本下降93%。因此，该方法不仅准确率高，还大幅降低了鉴定成本。
sequencelisting
<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120>crispr/cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法
<130>none
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工设计
<400>1
acatgattaactgctctttgttg23
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工设计
<400>2
acctggtgcgatgtaataatgg22
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工设计
<400>3
ggacttctgttgcttggaga20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工设计
<400>4
attgtacgggattcgtggtg20
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工设计
<400>5
ttggggatttcaccggacataa22
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工设计
<400>6
tactaattcaggctggcaca20
相关知识
一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法
我校利用高通量基因编辑系统创建棉花抗虫基因突变体库并鉴定到广谱抗虫基因GhMLP423
Adv. Sci | 华中农大棉花遗传育种团队利用高通量基因编辑系统创建棉花抗虫基因突变体库并鉴定到广谱抗虫基因GhMLP423
基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法.pdf
CRISPR/Cas9 technology in disease research and therapy: a review
Target Improvement of Rice Based on CRISPR/Cas9 Gene Editing Technology
中国农业大学园艺学院 学术动态 园艺学院马超课题组在菊花基因编辑技术方面取得技术突破
利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性
CRISPR/Cas9基因编辑技术在家畜育种新材料创制中的研究进展
基于CRISPR的月季RcTCP基因编辑技术研究
网址: CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法与流程 https://m.huajiangbk.com/newsview625034.html
| 上一篇: 用基因编辑技术对抗病毒，打响“香 |
下一篇: 一种获得转基因或基因编辑植物体的 |
