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不同品种灰毡毛忍冬ACS3基因克隆、表达及生物信息学分析

花匠小妙招
2024-11-20 17:08

摘要：目的 分别克隆灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型ACS3基因，并进行生物信息学和表达模式分析。方法筛选灰毡毛忍冬转录组数据库中与ACS蛋白同源性较高的Unigene序列，设计引物，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及RACE技术对该Unigene进行全长克隆；用生物信息学软件分析蛋白的理化性质、结构域和同源性等特性；借助qRT-PCR检测1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（ACS3）基因在不同品种、不同花期灰毡毛忍冬中表达模式。结果从灰毡毛忍冬野生品种及湘蕾品种中分别克隆得Lm-ACS3（GenBank：MH724196）及Lm-XL-ACS3（GenBank：MH724197），开放阅读框长度均为1 452 bp，编码483个氨基酸，包含保守的Aminotran_1_2结构域，与其他植物的ACC合酶具较高相似度；qRT-PCR结果显示，野生型ACS3基因不同花期间表达差异显著，从花期3开始呈整体明显上升趋势，湘蕾型中花期间表达差异相对较小。结论分别克隆得到灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型ACS3基因，该基因在2品种中具不同表达模式；推测ACS3基因或为导致灰毡毛忍冬不同品种间差异表型的可能功能基因之一，为进一步验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础。

灰来源于忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属Lonicera L.，为中药材山银花主要来源之一，具清热解亦为提取绿原酸的主要原料[2-3]，应用于制药、香料、化妆品等领域，市场开发潜力大。

《中国药典》2015年版规定，灰毡毛忍冬以干燥花蕾及初开的花入药[1]。而灰毡毛忍冬野生株花蕾期仅3～4 d，开花后第2天即开始凋谢[4]，其蕾期正值南方梅雨季节，生产上为人工采摘，常因不能及时采摘，造成资源浪费。20世纪90年代末，有研究者于湖南省溆浦县发现一株灰毡毛忍冬自然变异株，与野生株比，表现出花蕾整齐、蕾期长、花冠不展开，20余天才开始凋谢等优良性状[4-6]，基于其特殊优良性状，研究者对该自然突变株进行无性栽培，培育出稳定的优良品种，命名为“湘蕾金银花”Lonicera macranthoides‘Xianglei’（Lm-XL）[7]。

研究表明，内源激素乙烯在植物开花和衰老过程中起关键作用[8-9]。为探究乙烯是否为导致2个品种灰毡毛忍冬差异表型的可能原因，前期研究[4]对灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型不同花期花样品乙烯释放量进行测定及比较，结果显示，两者乙烯生成速率动态变化趋势不同，内源乙烯差异或为导致两者差异表型的可能原因。乙烯在植物中生物学效应的发挥主要体现在两方面，即乙烯生物合成和乙烯信号转导[10]。而乙烯生物合成途径中，1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid synthase，ACS）为其中重要限速酶[11-13]，可ACS酶活性为ACC和乙烯调控植物生长发育的基础，其表达水平直接影响植物体内乙烯的含量[13,16-17]。因此，控制和修饰ACS基因，可能影响乙烯生成，从而延缓花衰老或凋谢。

目前，尚未从分子水平上开展对灰毡毛忍冬中乙烯生物合成和转导途径相关基因的研究，本研究拟克隆灰毡毛忍冬乙烯生物合成途径ACS相关基因并对其进行分析。课题组前期对灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型进行了转录组测序和分析，获得多条差异明显基因，筛选转录组中注释为1-aminocyclopropane-1-carboxylatesynthase的Unigene片段，其中Unigene5191基因差异明显，对其设计引物进行cDNA全长克隆、生物信息学及表达分析。以期为后续验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础，为进一步寻找湘蕾品种花蕾期长、花冠不展开的系列优势基因，培育出花蕾期长、花冠不展开的优良种质提供参考[18]。

1 材料与试剂

1.1 材料

于2018年5～6月分别采收野生型及湘蕾型灰毡毛忍冬不同花期花样本，花蕾用密封袋封好，液氮速冻，保存于−80 ℃冰箱。据花蕾发育阶段，野生型及湘蕾型均分为7个花期，其中野生型分为：花蕾初期、青绿色花蕾期、绿白色花蕾期、白色花蕾期、白色开花期、金黄色开花期、花朵枯萎期[4]；湘蕾型分为：花蕾初期、青绿色花蕾期、浅绿色花蕾期、绿白色花蕾期、白色花蕾期、黄白色花蕾期、花蕾枯萎期[4]，分别记为花期1～7。以上样品均采自湖南中医药大学药植园，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为野生型及湘蕾型灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. 花样品。

1.2 试剂

pEASY®-T1试剂盒、pEASY®-Blunt试剂盒（全式金生物科技有限公司）；2×Taq Master Mix（Dye）、2

2 方法

选择高质量RNA为模板，根据Thermo有限公司反转录cDNA第一链合成试剂盒说明书分别合成野生型与湘蕾型品种cDNA第一链，反转录产物置于−20 ℃保存，备用。

2.2 灰毡毛忍冬ACS3基因cDNA全长克隆

2.2.1 灰毡毛忍冬ACS3核心片段克隆根据前期实验获得的灰毡毛忍冬转录组数据库，筛选转录组中与NCBI中ACS基因蛋白同源性较高且2品种差异明显的Unigene片段，设计引物ACS3-F及ACS3-R（表1），以“2.1”项获得的cDNA为模板，进行RT-PCR，目标条带为1 108 bp。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正向引物及反向引物各1 μL，cDNA 1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，执行35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶以150 V，30 min条件电泳，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒方法回收。将回收的PCR产物按pEASY®-T1 Cloning Kit试剂盒说明书进行T载体连接、转化及过夜平板培养，筛选白斑并进行菌液PCR，将经鉴定的阳性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

：PCR-Grade H2O 15.5 μL，2×Seq Amp Buffer 25.0 μL，Seq Amp DNA Polymerase 1.0 μL，混匀并短暂离心，室温放置，作为A液备用；5’RACEcDNA 2.5 μL，5’GSP（特异性引物ACS3-5’ 10 μmol/L）1 μL，10×UPM 5 μL，轻轻混匀，并短暂离心，作为B液；将A液加入B液得到最终PCR体系50 μL。扩增程序：94 ℃变性30 s，72 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。

2.2.3 灰毡毛忍冬ACS3基因3’末端序列的获得 3’RACE cDNA合成及3’RACE特异性引物设计同“2.2.2”项，前期实验发现采用1次RACE，3’RACE条带易出现弥散或拖尾现象，故本研究3’RACE采用巢式PCR（nest PCR）。分别设计3’RACE外引物（outer primer）及内引物（inner primer），序列见表1。参照SMARTer® RACE 5’/3’Kit说明书进行3’RACE，3’RACE反应体系及反应条件如下。

5’RACE及3’RACE PCR产物检测及回收同“2.2.1”项，载体改用适用于连接末端的pEASY®-Blunt载体，将回收的RACE PCR产物按pEASY®-Blunt CloningKit试剂盒说明书进行载体连接、转化和过夜平板培养，筛选白斑并进行菌液PCR，将经鉴定的阳性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。

2.2.4 灰毡毛忍冬ACS3基因cDNA全长序列的拼接及验证根据已测定的核心片段、5’和3’端序列及其重叠区域，使用Contig Express软件进行序列分析及拼接，获得ACS3基因cDNA全长序列。根据拼接得到的cDNA全长，设计ACS3基因全长扩增引物，利用RT-PCR验证ACS3拼接结果有无错漏，引物分别为V-ACS3-F及V-ACS3-R，见表1。以“2.1”项得到的cDNA为模板，反应体系50 μL：2×PfuMasterMix（Dye）25 μL，ddH2O 19 μL，cDNA 2 μL，V-ACS3-F和V-ACS3-R各2 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2min；94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸3min，循环35次；72 ℃终延伸5 min，目的条带回收和测序等过程同“2.2.1”，载体选用Blunt载体。将验证无误的灰毡毛忍冬ACS3 cDNA碱基序列上传至NCBI，并分别命名。

2.3 灰毡毛忍冬ACS3基因生物信息学分析

2.4 灰毡毛忍冬ACS3基因的表达分析

根据拼接得到的野生型与湘蕾型灰毡毛忍冬ACS3基因全长序列，设计同样适用于2品种ACS3基因荧光定量PCR的特异性引物q-ACS3-F和q-ACS3-R，见表1，以18 S rRNA为内参基因[5]。按“2.1”项方法分别提取灰毡毛忍冬2品种不同花期花总RNA，将RNA定量至同一浓度，按“2.1”项方法合成cDNA，在Bio-RadCFX96上进行qRT-PCR。反应体系20μL：TranStart® Green qPCRSuperMix UDG 10 μL，ddH2O 8.2 μL，cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL。反应程序：50 ℃、2min，94 ℃、10min；94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，40个循环；做熔解曲线分析，每个样品重复4次，反应结束后通过2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

3 结果和分析

通过微量分光光度计测定提取灰毡毛忍冬花总RNA，结果显示1.8＜A260/A280＜2.0，A260/A230＞2.0；琼脂糖凝胶电泳结果见图1，由图1可见28 S和18 S条带明显，28 S约是18 S 2倍亮，说明RNA质量较高，完整性及纯度较好，RNA质量符合后续实验要求。

3.2 灰毡毛忍冬ACS3全长cDNA的获得

通过qRT-PCR，野生品种及湘蕾品种均得到长度为1 108 bp的ACS3核心片段，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，通过DNAMAN比对，测序所得的序列与Unigene模板序列匹配。

用表1中RACE引物分别进行5’RACE和3’RACE，得到约1280 bp 5’RACE产物，与约1 065 bp的3’RACE产物，琼脂糖凝胶电泳结果分别见图3和图4；拼接后得到序列全长分别为1 993 bp和1 994 bp的野生型及湘蕾型灰毡毛忍冬ACS3 cDNA特异性片段。

最终利用表1中验证引物再次进行RT-PCR，对2品种灰毡毛忍冬ACS3基因进行全长验证，琼脂糖凝胶电泳结果见图5，通过DNAMAN比对分析，PCR产物测序结果与拼接结果一致。

3.3 灰毡毛忍冬ACS3基因生物信息学分析

3.3.1 灰毡毛忍冬ACS3基因序列分析将获得的野生型及湘蕾型灰毡毛忍冬ACS3基因分别命名为Lm-ACS3和Lm-XL-ACS3，并将序列上传至NCBI，基因登录号分别为MH724196和MH724197，基因全长分别为1 993 bp和1 994 bp，5’端非编码区（UTR）均为163 bp，3’端非编码区（UTR）分别为378、379 bp，中间均具ORF 1 452 bp，编码483个氨基酸，有7个位点具碱基差异，编码氨基酸1个不同，全长序列及编码氨基酸分别见图6-A、B。

3.3.2 灰毡毛忍冬ACS3编码氨基酸理化性质分析通过分子生物学软件分析可得，Lm-ACS3及Lm-XL-ACS3基因编码的蛋白相似，区别较小。2品种ACS3编码蛋白理化性质见表2，蛋白间仅存在极细微差别，Lm-XL-ACS3较Lm-ACS3相对分子质量稍大，理论等电点较低，两者不稳定指数均＜40，推测2种蛋白均属于稳定蛋白；其中二者含量最高的氨基酸序列均为Leu（8.9%）；而ProtScal分析表明，灰毡毛忍冬2品种ACS3亲水/疏水氨基酸分布基本相同，亲水氨基酸分布大于疏水氨基酸，且结合表2结果中2蛋白平均总疏水系数为负，推测ACS3蛋白为亲水性蛋白。对于亚细胞定位、信号肽及跨膜域，2个ACS3蛋白基本没有区别，均为非分泌型蛋白，不具跨膜区域，定位于叶绿体中的可能性最高。

3.3.3 灰毡毛忍冬ACS3蛋白结构域、二级结构和三级结构预测利用NCBI-CDD在线分析灰毡毛忍冬2品种ACS3编码蛋白的保守结构域，结果显示2品种ACS3结构域分析结果相同（图7），均具保守的Aminotran_1_2结构域（注释为Aminotransferase class I andII），属于Aminotran_1_2superfamily；且非特定匹配位于47～427位）、AAT_like结构域（cd00609，位于89～428位）和AspB结构域（COG0436，位于91～435位），以及2个可能的超家族Aminotran_1_2超家族和AAT_I超家族。

旋占44.93%、随机卷曲占33.95%、延伸链占14.08%、β转角占7.04%。

通过SWISS-MODEL预测得到灰毡毛忍冬ACS3蛋白的三维结构（图8），并通过在线对该蛋白质进行三级结构分析，发现Lm-ACS3与Lm-XL-ACS3蛋白三级结构基本一致，仅存在细微差别，同源二聚体预测结果与数据库中苹果的

Blastp进行比对，两者同源性比对结果相似，结果表明，与烟草Nicotiana tabacum L.（NP_001313149.1）、Sieb. et Zucc.

（PHT57675.1和PHT57674.1）等植物较为相近，聚为第一大分支，其中除猕猴桃、茶和葡萄外，均具双子叶合瓣花特征，灰毡毛忍冬2品种间亲缘关系最近，聚为一小类。

利用qRT-PCR检测ACS3基因在灰毡毛忍冬2品种不同花期中表达情况，结果见图11。ACS3基因在野生型与湘蕾型灰毡毛忍冬花开放衰老过

4 讨论

因山银花药用价值高，价格远低于金银花，部分中成药处方中将金银花更改为山银花入药。灰毡毛忍冬作为山银花的主要来源，其野生株蕾期短、易凋谢，不易采摘等缺陷是灰毡毛忍冬生产中亟待解决的问题，若能延长其蕾期将带来巨大的经济价值。其突变株湘蕾品种蕾期长、花冠不展开等优良特性的出现为灰毡毛忍冬的开发利用打开了新思路，探究湘蕾品种优良表型的根本原因，对灰毡毛忍冬新品培育具有积极的促进作用和重要的研究意义。

且非特定匹配PLN02450（1-amino cyclopropane-1-carboxylate sythase）E值达到0，表示两者为目的氨基酸。同时Lm-ACS3和Lm-XL-ACS3的蛋白结构和理化性质虽存在细小差别，但相似度非常高，两者均为稳定的亲水蛋白，二级结构均以α螺旋和随机卷曲为主，仅百分比存在细微差别。通过进化树分析，可见灰毡毛忍冬Lm-ACS3和Lm-XL-ACS3归属于一小类，亲缘性最高，而其他亲缘性较近的植物除猕猴桃、茶和葡萄外，均具双子叶合瓣花特征，与灰毡毛忍冬的特征较为相符，其中葡萄与转录组中筛选的模板Unigene 5191注释结果相同。

前期研究结果[4]表明，灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型内源乙烯生成速率动态变化趋势具差异，其乙烯生成动态变化规律与本研究ACS3基因在不同品种灰毡毛忍冬中表达模式具一定相似性：野生品种乙烯释放速率从花期4逐渐上升，花期6剧烈上升，花期7到达峰值，而本研究Lm-ACS3表达量从花期3始呈逐渐上升趋势，花期5～6跃变明显，花期6表达量达最高值；而湘蕾品种乙烯释放速率变化不明显，整体呈缓慢上升趋势，与Lm-XL-ACS在不同花期间表达量变化较平缓较为相似。2品种ACS3表达量上升均在乙烯释放速率提高之前，总体趋势不完全相同，这表明ACS3表达量提高可能是乙烯产生的前提条件之一，且乙烯不完全受ACS3基因调控。2品种花蕾末期表达量均下降，可能与样品枯萎、细胞活性不高、ACS mRNA在植物组织内不稳定、极易分解有关[24]。结合灰毡毛忍冬乙烯生成动态变化规律与时空表达结果推测：ACS3的分子表达特性差异可能为导致2品种灰毡毛忍冬乙烯生成类型差异原因之一。