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七叶一枝花种子超低温保存方法与流程

花匠小妙招
2024-11-20 20:43

本发明涉及药用植物种子保存技术领域，具体地说是针对七叶一枝花种子超低温保存方法。

背景技术：

七叶一枝花是多年生草本植物，别名独脚莲、一枝箭、草河车等。野生七叶一枝花分布在湖南、云南、四川、贵州等省份，主产区为湖南的湘西、云南的滇中、滇西和滇西北地区，生长在海拔为1400～3100m，年平均气温为10～13℃，年降雨量850～1200mm的冷凉山区，多生于常绿阔叶林、针阔混交林、山坡阴湿处及灌木丛山地。七叶一枝花从种子萌发生长发育5～6年后，才进入生殖生长期。由于生长缓慢，多年的大量采挖使野生七叶一枝花资源面临枯竭。

七叶一枝花以根茎入药，秋季采收。其性微寒味苦，有小毒，归肝经，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效，主治疔疮痈肿，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，跌打伤痛，惊风抽搐等症。现代药理研究证明，七叶一枝花有止血、祛痰和抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀灭精子、抗细胞毒等作用，临床用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及肿瘤等，具有显著的疗效。国内以七叶一枝花为主要原料的产品有云南白药系列、宫血宁、热毒清、抗病毒颗粒、季德胜蛇药片、七叶一枝花解毒酊等，产值40亿元。

由于制药企业对七叶一枝花原料大量的需求，使得七叶一枝花野生资源长期过度无序地采挖，野生药材的供应量不断减少，已不能满足国内以七叶一枝花为原料的制药企业的生产需求。七叶一枝花从播种到收获利用需八年以上的时间，制药企业为获取更多原料，大幅度提高七叶一枝花收购价格，现在好的产品收购价格已达700元/kg以上，是五年前的16～30倍。收购价格上涨再刺激农民过度的采挖，采挖速度远远超过了野生资源繁殖生长的速度，导致七叶一枝花成为稀缺资源。七叶一枝花的稀缺已成为制约相关制药企业规模生产和可持续发展的瓶颈。进行七叶一枝花人工栽培，保证药材有效供应，满足制药企业需求，造福人类健康，已势在必行。但人工栽培七叶一枝花存在一些急待攻克的关键技术。

七叶一枝花种子休眠程度高、萌发缓慢、出苗率低等生物学特征限制，种子种苗繁殖难度大；七叶一枝花根茎因用药和繁殖需求量大，使野生资源锐减，而且会使种质退化，抗逆性下降；至今为止，对七叶一枝花的种质研究甚少。目前种质资源保存方式为常温、低温保存七叶一枝花种子两种方式。常温保存中药材种子，需要每年重新繁种更新，因为植物种子经过常温保存，活力降低很快；低温保存植物种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。

因此，为了安全保存七叶一枝花种质资源，研究探索一种安全而长久保存七叶一枝花种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种适合于七叶一枝花种子的超低温保存法，该方法能够补充现在七叶一枝花种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存七叶一枝花种质资源，为七叶一枝花种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。

本发明的目的是提供一种七叶一枝花种子超低温保存方法，包括步骤以下：

(1)采摘七叶一枝花种子，喷洒40ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液5～30kg/100kg七叶一枝花种子，在空气湿度30～55％、常温放置25～50天，用水洗净，用营养液温育20～50min后，取出温育过的七叶一枝花种子；

(2)温育过的七叶一枝花种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；

(3)将带有七叶一枝花种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-60℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；

(4)经低温保存5年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。

在一个具体方案中，步骤(1)中所述营养液指ms液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/l甘油和1～1.5mol/l二甲基亚砜。

所述营养液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。

在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。

在一个具体方案中，步骤(2)中所述抗冻液是指ms液体培养液，还包含有2.5～3mol/l甘油、1.5～2mol/l二甲基亚砜和0.4～0.8mol/l蔗糖。

所述抗冻液优选10.50～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。

在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。

七叶一枝花上述所保存的七叶一枝花种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中七叶一枝花种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后用100ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液恒温浸泡8～15h，溶液温度保持在25～30℃，沥干水分，拌入5～10倍量种子的河砂，河砂与种子混合均匀后再放入搅拌机中打磨20～40min，再直播到苗床上进行育苗。

技术效果

1、本发明进行七叶一枝花超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的七叶一枝花种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后七叶一枝花种子发芽率高达98％以上。

2、采摘后的七叶一枝花种子进行后熟处理，更能提高低温保存后种子发芽率，后期采用打磨种子外壳，更有利于种子吸水，提高了种子的萌发率。

3、本发明具有长期、有效、安全保存七叶一枝花种子，是七叶一枝花种质资源长期保存的最有效方法。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。

实施例1

取100kg刚采摘七叶一枝花种子，喷洒40ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液5kg，在空气湿度45％、常温放置30天，用水洗净，用含有1.8mol/l甘油和1.2mol/l二甲基亚砜的ms液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的七叶一枝花种子，再放入冻存管中，再加入含有2.8mol/l甘油、1.5mol/l二甲基亚砜和0.6mol/l蔗糖的ms，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；七叶一枝花将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中七叶一枝花种子从液氧取出室温解冻，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后用100ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液恒温浸泡10h，溶液温度保持在28℃，沥干水分，拌入6倍量种子的河砂，河砂与种子混合均匀后再放入搅拌机中打磨30min，再直播到苗床上进行育苗，经测试发芽率达到98.73％。

对照实施例1

取100kg刚采摘七叶一枝花种子，喷洒40ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液5kg，在空气湿度45％、常温放置30天，用水洗净，用含有2.3mol/l甘油的ms液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的七叶一枝花种子，再放入冻存管中，再加入含有2.8mol/l甘油、1.5mol/l二甲基亚砜和0.6mol/l蔗糖的ms，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中七叶一枝花种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后用100ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液恒温浸泡10h，溶液温度保持在28℃，沥干水分，拌入6倍量种子的河砂，河砂与种子混合均匀后再放入搅拌机中打磨30min，再直播到苗床上进行育苗，经测试发芽率达到79.62％。

对照实施例2

取100kg刚采摘七叶一枝花种子，用水洗净，用含有1.8mol/l甘油和1.2mol/l二甲基亚砜的ms液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的七叶一枝花种子，再放入冻存管中，再加入含有2.8mol/l甘油、1.5mol/l二甲基亚砜和0.6mol/l蔗糖的ms，室温温育30min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中七叶一枝花种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后用100ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液恒温浸泡10h，溶液温度保持在28℃，沥干水分，拌入6倍量种子的河砂，河砂与种子混合均匀后再放入搅拌机中打磨30min，再直播到苗床上进行育苗，经测试发芽率达到30.8％。而取新鲜七叶一枝花1～5℃下低温保存5年后，用于发芽实验，经测试七叶一枝花未能发芽。

实施例2

取100kg刚采摘七叶一枝花种子，喷洒40ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液10kg，在空气湿度45％、常温放置35天，用水洗净，用含有2mol/l甘油和1.4mol/l二甲基亚砜的ms液体培养液温育，温育30min后，取出温育过的七叶一枝花种子，再放入冻存管中，再加入含有3.3mol/l甘油、1.7mol/l二甲基亚砜和0.5mol/l蔗糖的ms，室温温育20min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-55℃左右，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中七叶一枝花种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后用100ppm赤霉素+500倍多菌灵+1000倍甲基托布津溶液恒温浸泡8～15h，溶液温度保持在25～30℃，沥干水分，拌入5～10倍量种子的河砂，河砂与种子混合均匀后再放入搅拌机中打磨20～40min，再直播到苗床上进行育苗，经测试发芽率达到98.87％。