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第十二三章植物细胞的遗传转化

花匠小妙招
2024-08-26 17:33

1、第十二章种质保存第一节第一节常温保存常温保存第二节第二节常低温和低温保存常低温和低温保存第三节第三节超低温保存超低温保存种质（种质（germplasm）：）：是指亲代通过生殖细胞是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。或体细胞传递给子代的遗传物质。种质资源：种质资源：具有一定种质或基因的生物类型，具有一定种质或基因的生物类型，称为（基因资源、基因库、基因银行）。称为（基因资源、基因库、基因银行）。包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要具有种质并能繁殖

2、的生物体，都能归入种质资具有种质并能繁殖的生物体，都能归入种质资源之内。源之内。种质资源的重要性种质资源的重要性种质资源是在漫长的历史过程中种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化和人由自然演化和人工创造而形成的一种重要的自然资源。工创造而形成的一种重要的自然资源。积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异,即蕴藏着各种性状的遗传基因。即蕴藏着各种性状的遗传基因。人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础, 也是进行生物学研究的重要材料也是进行生物学研究的重要材料, 是极其宝贵的自是极其宝贵的自然

3、财富。然财富。种质保存种质保存(germplasm conservation) ：利用天利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。种质保存的两种方式：种质保存的两种方式：原地保存原地保存: 通过建立自然保护区和天然通过建立自然保护区和天然公园来实现公园来实现异地保存异地保存: 通过植物园、种质圃、种子通过植物园、种质圃、种子库以及离体保存来实现。库以及离体保存来实现。华南植物园西双版纳国家级自然保护区建

4、立的兰科植物种西双版纳国家级自然保护区建立的兰科植物种质资源保存苗圃质资源保存苗圃野生稻频临灭绝野生稻频临灭绝离体保存：离体保存：将组织和细胞培养中的外植体或试管将组织和细胞培养中的外植体或试管苗贮存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条苗贮存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条件下，达到长期保存的方法。件下，达到长期保存的方法。优点优点：n 解决一些无性繁殖作物种质资源的低温、长期保解决一些无性繁殖作物种质资源的低温、长期保存问题，可有效避免资源的丢失；存问题，可有效避免资源的丢失；n 节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少且能节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少且能在保存中脱毒；在保存中

5、脱毒；n 在需要时，可快速繁殖，在需要时，可快速繁殖，利于国际国内种质交换。利于国际国内种质交换。离体保存方法离体保存方法: :常温保存（常温保存（25255 5 ）低温保存低温保存（0-8 0-8 ），），超低温保存（超低温保存（-80 - -196-80 - -196）改变培养基无机盐的浓度改变培养基无机盐的浓度: 1/4MS培养菠萝培养菠萝苗，一年后仍有苗，一年后仍有81保持活力；保持活力；增加培养基渗透压增加培养基渗透压：添加甘露醇、蔗糖，：添加甘露醇、蔗糖，抑制外植体生长。抑制外植体生长。添加植物激素添加植物激素：多效唑：多效唑PP333 等等培养基条件的改变培养基条件的改

6、变培养环境条件的改变降低培养环境的氧含量：降低培养环境的氧含量：保存材料上覆盖一层矿物质如石蜡、液态保存材料上覆盖一层矿物质如石蜡、液态石油石油降低环境的氧分压。降低环境的氧分压。冰冻保护剂冰冻保护剂渗透型抗冻剂：渗透型抗冻剂：二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）、乙二）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油等醇、乙酰胺、丙二醇、甘油等作用特点：作用特点：属低分子中性物质，在溶液中易属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加而减弱水的结晶过程，达到保护的目的增加而减弱水的结晶过程，达到保护的目的。非渗透型抗冻剂非渗透型抗冻剂聚乙烯吡咯

7、烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、葡聚糖、聚乙）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等，二醇等，作用特点：作用特点：可溶于水，但不能进入细胞，可在特可溶于水，但不能进入细胞，可在特定的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到定的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用保护作用第十二章种质保存第一节第一节常温保存常温保存第二节第二节常低温和低温保存常低温和低温保存第三节第三节超低温保存超低温保存第十章第十章转基因植物转基因植物转基因植物转基因植物基因改良植物基因改良植物转基因生物制药转基因生物制药转基因安全性转基因安全性转基因植物转基因植物是指利用生物或物理、化学等手是指利用生

8、物或物理、化学等手段将外源基因导入植物受体系统中，使之在段将外源基因导入植物受体系统中，使之在受体中得以表达，进而获得转基因植株的技受体中得以表达，进而获得转基因植株的技术体系。术体系。基基因因转转化化的的的的基基本本步步骤骤1 转基因植物转基因植物1.1 受体受体叶盘叶盘原生质体原生质体悬浮细胞悬浮细胞愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体活体活体等等等等 1.2 转基因方法转基因方法直接转化法直接转化法 : 基因枪法基因枪法载体介导法：农杆菌介导法载体介导法：农杆菌介导法 1.2.1 直接转化法直接转化法基因枪法基因枪法 *最早的基因枪（火药式）由美国康乃尔大学最早的基因枪（火药式）

9、由美国康乃尔大学Sanford等等1987年设计制造年设计制造。基本原理基本原理将将外源外源DNA通过通过亚精胺和氯化钙的沉积作用包被在金属颗粒亚精胺和氯化钙的沉积作用包被在金属颗粒（金粉、钨粉等）表面，此为微弹，将这种（金粉、钨粉等）表面，此为微弹，将这种微弹悬液微弹悬液涂于载膜涂于载膜（尼龙、塑料等）上，以（尼龙、塑料等）上，以不同的驱动力高速驱动微弹载体不同的驱动力高速驱动微弹载体，使，使携带携带DNA的微弹穿透植物细胞壁的微弹穿透植物细胞壁，直接进入受体靶细胞。，直接进入受体靶细胞。几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤

10、，这是由于植物根部被一种革兰常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。介导的。 1.2.2 载体介导法：农杆菌介导载体介导法：农杆菌介导Ti质粒的功能区域T-DNA的染色体整合机制的染色体整合机制叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆菌土壤农杆菌浸泡浸泡培养基培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗分化出苗分化出苗生根壮苗生根壮苗植物受体植物受体抗生素筛选抗生素筛选其它方法其它方法植

11、物病毒感染法植物病毒感染法花粉管通道法花粉管通道法电穿孔转化法电穿孔转化法激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法显微注射法显微注射法超声波介导转化法超声波介导转化法多聚物介导法多聚物介导法浸渍法浸渍法电泳法电泳法碳化硅纤维介导法碳化硅纤维介导法真空渗透法真空渗透法圆球体法圆球体法等等等等1.3 转基因植物的鉴定转基因植物的鉴定遗传表型特征筛选遗传表型特征筛选依赖于重组子结构特征分析筛选依赖于重组子结构特征分析筛选核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析免疫化学分析检测免疫化学分析检测PCR筛选法筛选法抗生素抗性基因抗生素抗性基因显色或发光报告基因显色或发光报告基因抗除草剂抗性基因抗除草剂抗性

12、基因 3.1 遗传表型特征筛选遗传表型特征筛选-葡萄糖酸苷酶基因（葡萄糖酸苷酶基因（gus）能催化特殊反应，通过荧光、分光光度和组织化学能催化特殊反应，通过荧光、分光光度和组织化学方法对这些特殊反应产物进行检测。方法对这些特殊反应产物进行检测。叶特异性表达叶特异性表达叶肉特异性表达叶肉特异性表达维管束特异表达维管束特异表达茎特异表达茎特异表达GFP基因基因 GFP绿色荧光蛋绿色荧光蛋白是从一种生活白是从一种生活在北太平洋寒冷在北太平洋寒冷水域的水母体内水域的水母体内发现的。发现的。依赖于重组子结构特征分析筛选依赖于重组子结构特征分析筛选Southern blot 筛选结果筛选结果核酸分子杂交分

13、析核酸分子杂交分析第十章第十章转基因植物转基因植物转基因植物转基因植物基因改良植物基因改良植物转基因生物制药转基因生物制药转基因安全性转基因安全性2. 基因改良植物生物体生物体冻害冻害干旱干旱盐害盐害涝害涝害热害热害生物胁迫生物胁迫非生物胁迫非生物胁迫杂草杂草病害病害虫害虫害其他性状其他性状品品质质除草剂除草剂转基因在作物品种改良中的应用转基因在作物品种改良中的应用抗虫抗虫抗病毒抗病毒抗病抗病抗非生物胁迫抗非生物胁迫抗除草剂抗除草剂改良作物品种改良作物品种改变花的颜色和形状改变花的颜色和形状转基因植株作为生物反应器转基因植株作为生物反应器（A）萎黄病（箭头所指）感

14、染）萎黄病（箭头所指）感染（B）外源基因抵抗外源基因抵抗TMV对烟草的感染。对烟草的感染。接种后接种后11天天症状（箭头）症状（箭头）抗病烟草抗病烟草抗病大豆抗病大豆野生型野生型转基因转基因野生型野生型转基因转基因具有除草剂抗性的大豆具有除草剂抗性的大豆用用0.1%草苷膦处理大豆叶片草苷膦处理大豆叶片野生型野生型转基因转基因转基因转基因野生型野生型野生型野生型转基因转基因抗除草剂抗除草剂占总转基因植占总转基因植物种植面积的物种植面积的77，其中主，其中主要为抗除草剂要为抗除草剂大豆。大豆。野生型和转基因（野生型和转基因（AtNHX1 ）番茄用）番茄用200mM NaCl处

15、理处理11周周未处理前处理后抗逆-盐害野生型野生型转基因转基因野生型野生型转基因转基因野生型油菜和转基因（野生型油菜和转基因（AtNHX1）油菜经）油菜经 200mM NaCl 处理处理10 周周抗逆-盐害野生型和转野生型和转AtP5CS基因的烟草经过基因的烟草经过-2 24h 处理处理野生型野生型转基因转基因抗逆-冻害冻害前冻害前冻害后冻害后冻害前冻害前冻害后冻害后抗虫抗虫水稻抗虫水稻美国最早研制得到抗虫棉花抗虫棉花，我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。激素合成相关基因激素合成相关基因增加转基因杨树的高度增加转基因杨树的高度（十二周时期的苗

16、）（十二周时期的苗）品质改良-林木转基因杨树转基因杨树细胞结构细胞结构的变化的变化纤维长度纤维长度细胞数量细胞数量细胞长度细胞长度木质部纤维数量木质部纤维数量野生型野生型转基因转基因野生型野生型转基因转基因表皮表皮木髄部木髄部C4植物高光效基因提高水稻产量转基因对照品质改良-农作物 1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转转基因西红柿基因西红柿投放市场，1998年我国获得转基因耐储藏番茄，延长为60天转基因番木瓜品质改良-水果转基因香蕉品质改良-花卉双色茶花双色茶花各色烟草花各色烟草花白色夏堇白色夏堇第十章第十章转基因植物转基因植物转基因植物转基因植物基因改良植物基因改良植

17、物转基因生物制药转基因生物制药转基因安全性转基因安全性 3 转基因植物生物制药转基因植物生物制药世界卫生组织公布的危害人群健康最严重的世界卫生组织公布的危害人群健康最严重的48种种疾病中，传染病和寄生虫病占疾病中，传染病和寄生虫病占40种，发病人数占种，发病人数占病人总数的病人总数的85。全世界每年有。全世界每年有1700万人死于传万人死于传染病，其中大量是患可预防的传染病的儿童。这染病，其中大量是患可预防的传染病的儿童。这些儿童大多数在发展中国家，患病的主要原因除些儿童大多数在发展中国家，患病的主要原因除了经济落后、环境恶劣和卫生条件差外，另一个了经济落后、环境恶劣和卫生条件差外，另一

18、个原因是对原因是对疫苗的制作和保存疫苗的制作和保存缺乏良好的条件。缺乏良好的条件。 D转基因植物疫苗转基因植物疫苗-可食（饲）性可食（饲）性携带白喉抗原的萝卜携带白喉抗原的萝卜抗乙肝、霍乱和细菌性痢疾等传染病的香蕉抗乙肝、霍乱和细菌性痢疾等传染病的香蕉预防霍乱的苜蓿苗预防霍乱的苜蓿苗抗乙肝病的西红柿抗乙肝病的西红柿预防其他一些疾病的马铃薯、甘蓝、西红柿预防其他一些疾病的马铃薯、甘蓝、西红柿转基因土豆防乙肝转基因土豆防乙肝产生抗乙肝病毒抗体的转基因西红柿产生抗乙肝病毒抗体的转基因西红柿转基因香蕉防乙肝转基因香蕉防乙肝动物抗体基因在转基因植动物抗体基因在转基因植物中表达的免疫性产物。物

19、中表达的免疫性产物。转基因烟草能够产生狂犬病抗体转基因烟草能够产生狂犬病抗体植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高。术要求也不高。植物表达系统生产的疫苗可以直接储存在植物种植物表达系统生产的疫苗可以直接储存在植物种子和果实中，无需冷藏系统进行储藏运输，易于子和果实中，无需冷藏系统进行储藏运输，易于长距离运输及推广。长距离运输及推广。植物具有完整的真核表达修饰系统利用转基因植植物具有完整的真核表达修饰系统利用转基因植物生产的重组蛋白。物生产的重组蛋白。药物和疫苗在分子结构和生物活性上与人体来源药物和疫苗在分子结构和生物活性上与人

20、体来源的蛋白质相似。的蛋白质相似。全球转基因农作物的产业化全球转基因农作物的产业化 1983年首例转基因植物（烟草）问世年首例转基因植物（烟草）问世 1996年到年到2009年，全球转基因农作物种植面积达到年，全球转基因农作物种植面积达到6.9亿公亿公顷，顷，10多年间增长多年间增长67倍倍(大豆大豆70%、玉米、玉米25%）；）；各国批准的转基因植物各国批准的转基因植物: 在在1995有有9种，种，1998已达已达90种。种。目前全球基因作物种植面积的前四名分别是美国、阿根廷、目前全球基因作物种植面积的前四名分别是美国、阿根廷、加拿大和中国。这四个国家种植了全世界加拿大和中国。这四个国家

21、种植了全世界 99% 的转基因作的转基因作物。物。目前，我国共批准发放目前，我国共批准发放7种转基因作物安全证书，分别是种转基因作物安全证书，分别是耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米和抗虫水稻病番木瓜、转植酸酶玉米和抗虫水稻。大规模商业化生产的只有抗虫棉和抗病毒木瓜。大规模商业化生产的只有抗虫棉和抗病毒木瓜。进口用作加工原料的转基因作物有进口用作加工原料的转基因作物有大豆、玉米、棉花、油大豆、玉米、棉花、油菜和甜菜菜和甜菜5种，其中转基因大豆数量最多。种，其中转基因大豆数量最多。2012年，我国年，我国进口大豆数量达到进口大豆数量达到5838万吨，大多为转基因大豆，作为食万吨，大多为转基因大豆，作为食用油的加工原料。用油的加