木兰花碱在制备防治失眠症抑郁症药物的用途和制备方法与流程

• 花匠小妙招
• 2024-11-22 00:34

本发明涉及一种本发明属于医药、保健品领域，涉及一种生物碱有效成分木兰花碱在治疗抑郁症、失眠疾病方面的应用和制备方法。

背景技术：

抑郁症是以显著而持久的心境低落为主要临床表现的综合症，严重者会出现自杀和自残的行为，目前，全球抑郁症发病率已经达到了3.3％，而在发达国家超过了6％，全球抑郁症患者超过7亿，我国抑郁症的患病率在3％-5％之间，随着社会的发展，这一数据还在不断地持续上涨。失眠指的是无法进行正常的睡眠，具体症状表现为辗转难眠、睡眠质量差、睡眠时间减少，严重者可能会彻夜失眠[3]。当今社会，越来越多的人患有失眠症，失眠已经严重影响到人们的正常生活，带给患者极大精神痛苦，因而被社会广泛关注[4]。研究发现，失眠症与抑郁症之间密切相关。大多数抑郁症患者都患有失眠症，而失眠患者的抑郁发病率也远远高于正常人群。长期的临床试验表明，抑郁症及失眠症患者使用西药治疗会产生大量的副作用，如记忆力衰退，药物依懒性，甚至会使病情反弹，增加危险程度，但使用中药治疗效果良好、副作用少，适用人群广泛，因此以中药治疗抑郁及失眠得到越来越多的关注。

已有研究中证实，木兰花碱在保护心血管系统，调节免疫功能和抗氧化等方面具有良好的功效。因此木兰花碱的药用及保健价值研究，逐渐成为国内外研究的热门领域，但未见其在制备抗抑郁、失眠方面药物的新用途。现有技术一般采用色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时费力、污染环境，且所有固定相对样品有不可逆性吸附作用。高速逆流色谱(hsccc)是一种连续的无需固体支撑物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，依据物质在两相中分配系数不同而得以分离，特别适合于天然产物活性成分的分离。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生物碱单体成分木兰花碱及其应用，解决现有技术中抗抑郁失眠药副反应多，中药服药量大的问题。

本发明的目的之二是提供高速逆流色谱制备木兰花碱的方法，该方法能够从酸枣仁药材中提取纯的木兰花碱，以克服现有技术中提取分离酸枣仁活性成分费时费力、固定相对样品有不可逆性吸附作用，产率低的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

木兰花碱在制备防治失眠症、抑郁症药物的用途，以木兰花碱为活性成分，加入药学可接受的辅料制成各种制剂，其中所述木兰花碱为生物碱类，分子式c20h24no4+，分子结构式如下：

所述活性成分是从酸枣仁中提取分离或者通过化学合成方法或者选自具有类似药理作用的天然药物。

一种木兰花碱的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)粗提物的制备：

酸枣仁粉碎，通过40目筛，以石油醚脱脂后，加入6～12质量倍的体积百分浓度为60％～80％的乙醇水溶液，加热回流提取2～3次，每次1～3h，滤过，合并提取液，滤液浓缩乙醇至无醇味后用2～6倍量水溶解，用正丁醇萃取4-6次，提取液减压浓缩，回收溶剂后得到正丁醇粗提物，即待分离样品；

(2)采用高速逆流色谱法分离木兰花碱：

取乙酸乙酯、正丁醇和水的体积比为1～3:1～5:2～7，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，在25～35℃下，主机正转，转速为300～900r/min，然后以1.5～10ml/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；取步骤(1)制备的混合粗提物，用上相、下相体积比1:1的混合溶剂溶解后进样，在紫外检测器下分别收集木兰花碱的流出液，浓缩、干燥，即可分别得到木兰花碱。

步骤(2)中，正丁醇-乙酸乙酯-水的体积比为：2:3:5。

步骤(2)中，在25℃下，主机正转，转速为500r/min，然后以7ml/min的流速泵入流动相。

本发明的有益效果是：

本发明提供的分离纯化生物碱单体木兰花碱的方法，相对于现有技术，本发明分离纯化单体效率高、制备量大、损失少、产品纯度高、操作简便、经济环保。本发明一次性分离纯化得到的生物碱单体木兰花碱经高效液相色谱(hplc)法纯度达到95％以上。

附图说明

图1为实施例1制得的木兰花碱和斯皮诺斯、6″′-阿魏酰斯皮诺素的混合粗提物的hplc图谱；

图2为实施例1的高速逆流色谱(hsccc)图；

图3为实施例1制得的化合物1木兰花碱的hplc图谱；

图4为木兰花碱质谱图；

图5为木兰花碱核磁共振氢谱；

图6为木兰花碱的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。在不违背本发明精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动或改变都将落入本发明保护范围内。

实施例1

木兰花碱制备方法

(1)粗提物的制备：

酸枣仁250g粉碎，通过40目筛，以石油醚脱脂后，分别加1200ml、800ml、600ml百分浓度为70％的乙醇水溶液，加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并提取液，滤液浓缩乙醇至无醇味后用2倍量水溶解，用正丁醇萃取5次，提取液减压浓缩，回收溶剂后得到正丁醇粗提物，即待分离样品，其hplc图谱如图1所示。

(2)采用高速逆流色谱法分离木兰花碱和斯皮诺素、6″′-阿魏酰斯皮诺素：

取正丁醇、乙酸乙酯和水的体积比为2:3:5，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为流动相；将固定相充满逆流色谱的色谱柱，在25℃下，主机正转，转速为500r/min，然后以7ml/min的流速泵入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态；取步骤(1)制备的混合粗提物，用上相、下相体积比1:1的混合溶剂溶解后进样，以波长280nm的紫外检测器检测流出液，根据高速逆流色谱图，见图2，对72min到84min、86min到100min和176min到202.5min对应的流出液分别进行合并收集，浓缩、干燥至恒重，即可分别得到木兰花碱(流分ⅰ)和斯皮诺素(流分ⅱ)、6″′-阿魏酰斯皮诺素(流分ⅲ)。

(3)单体纯度测定及结构测定

所得单体化合物分别使用高效液相色谱仪对得到的进行检测。色谱柱：agilenttc-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱；运行时间40min；0min10％乙腈，5min20％乙腈，5～40min20％～30％乙腈；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；检测波长280nm。测得化合物木兰花碱的纯度达到95.0％(图3)。经质谱(ms)(图4)、1h-nmr和13c-nmr分析，经结构解析并与与文献数据比对，所得单体化合物分别为木兰花碱250mg。

木兰花碱结构鉴定：为黄色针晶，紫外灯254nm下显蓝色荧光，改良碘化铋钾试剂显色呈阳性。对其进行核磁共振谱鉴定，其1h-nmr(400mhzdmso)(图5)化学位移如下：6.504(1h,s)，6.356(ihd,j＝8.0hz)，6.598(ihd,j＝8.0hz)；其13c-nmr(100mhzmeod-d4)(图6)化学位移如下：43.5，53.8(n-me)，24.6(2*me)，56.0，56.3(10,11-meo)，150.8，151.7(2，10)，对比相关文献确定化合物为木兰花碱(magnoflorine)，分子式为c20h24no4+，分子量342.4。

实施例2

木兰花碱对cums抑郁失眠小鼠模型的药效实验

1实验材料

1.1实验动物

健康雄性icr小鼠(体重20±2g)购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心；实验前饲养3天适应环境。室温22±2℃，相对湿度65％～70％。日光照12h，自由饮食、摄水。1.2试剂及药品：

木兰花碱、斯皮诺素(本实验室自制)；盐酸文拉法辛缓释胶囊(成都康弘药业集团股份有限公司)

1.3仪器

秒表(瑞士霍耶尔-奥利达斯厂)；

aux120型分析天平(岛津(香港)有限公司)；

zh-yls-1a动物自主活动记录仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；

kq-200kdb型高功率数控超声清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

2实验方法

2.1动物分组和给药

小鼠随机分成6组，每组10只，分别为空白组、模型组、西药阳性组(文拉法辛)、中成药阳性组(解郁安神颗粒剂)、水煎组、木兰花碱组。除空白组外，其余各组小鼠均按“2.2”方法造模；从造模的第一天开始每天早上8:00-9:00灌胃给药持续21天，给药方案见表1。

表1动物分组及给药方案

2.2cums抑郁失眠小鼠模型的建立方法

在21d内按随机安排10种应激因素，每天给予任意两种刺激，为避免小鼠产生适应性平均每种刺激给予4次。

(1)潮湿饲养：在小鼠垫料中加入适量水使其潮湿，在潮湿的环境中生存12h。

(2)禁食：12h断食。

(3)禁水：12h断水。

(4)倾斜饲养：将鼠笼倾斜45°饲养小鼠12h。

(5)夹尾：将小鼠放入固定笼中，用止血钳夹住距尾根1cm处持续1min。

(6)无垫料饲养：在无垫料的鼠笼中饲养小鼠，每次12h。

(7)睡眠剥夺：剥夺睡眠24h。采用小平台水环境法，在容器底部设置直径3cm、高2cm的平台，周边注满水(水深0.5cm)，若小鼠睡眠则会落入水中。

(8)冷水游泳：将动物放在盛有10℃水的容器中(水深5cm)5min。

(9)热水游泳：将动物放在盛有45℃水的容器中(水深5cm)5min。

(10)昼夜颠倒：于早7:00时将小鼠的笼子放置在黑暗空间不开灯，至晚19:00时将小鼠置于开灯的房间直至次日早7:00时。

2.3观测指标及方法

(1)体重

测量小鼠在实验过程中的体重变化，即第1天，第3天，第10天，第17天，第21天的体重，并计算出各组小鼠体重增长量。

(2)悬尾实验(tst)

将小鼠尾端贴在一水平木棍上，木棍离地使动物呈悬空倒挂状，悬挂两侧用隔板挡住小鼠视线。动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。实验进行6min，记录后4min内的不动时间。

(3)强迫游泳实验(fst)

将小鼠单独放入盛有深10cm以上、温度45℃水的透明玻璃缸中，实验进行6min。小鼠为挣扎逃跑至感觉无望后即停止挣扎，仅将头露出水面四肢呈不动状态，记录后4min内小鼠的不动时间。

(4)戊巴比妥钠协同作用实验

在动物实验的第8天灌胃0.5h后腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠，剂量为28mg/kg。记录各组小鼠出现睡眠的只数。第9天灌胃0.5h后腹腔注射阈上剂量戊巴比妥钠，剂量为38mg/kg。注射后开始计时，记录睡眠潜伏期及睡眠时间。以翻正反射消失时为睡眠开始时间，翻正反射恢复为睡眠结束时间。腹腔注射后到睡眠开始时间为睡眠潜伏期，潜伏期超过15min按15min记录。

3结果

3.1各给药组对cums小鼠tst实验不动时间的影响

模型组与空白组小鼠tst不动时间相比明显增加。木兰花碱组的tst不动时间均低于模型组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；木兰花碱组与模型组比较tst不动时间较少百分比与水煎组相当，结果见表2。

表2各给药组对cums抑郁失眠小鼠悬尾不动时间的影响

*与模型组比较p<0.05**与模型组比较p<0.01

3.2各给药组对cums小鼠fst实验不动时间的影响

木兰花碱组的fst不动时间与模型组相比较明显降低，具有显著统计学差异(p＜0.01)，阳性药组、水煎组与模型组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)。木兰花碱组与模型组比较fst不动时间较少百分比与空白组、水煎组、阳性药组相当，结果见表3。

表3各给药组对小鼠强迫游泳不动时间的影响

*与模型组比较p<0.05**与模型组比较p<0.01

3.3各给药组对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠实验的影响

由表4实验结果表示，与模型组相比各给药组的睡眠只数百分比均明显升高，其中木兰花碱组睡眠只数百分比与水煎组相当。

表4各给药组对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠实验的影响

3.4各给药组对阈上剂量戊巴比妥钠协同作用的影响

由表5数据显示，各给药组睡眠潜伏期无统计学差异。各给药组睡眠时间均长于模型组，其中木兰花碱组睡眠时间显著长于模型组，差异具有统计学意义(p<0.05)，与解郁安神颗粒剂组及水煎组相近。

表5各给药组对小鼠阈上剂量戊巴比妥钠实验

*与模型比较p<0.05**与模型组比较p<0.01

实施例3

木兰花碱加入药学可接受的辅料按常规方法制成各种剂型，如各种规格的液体注射剂，粉针注射剂，注射用乳剂，片剂，丸剂，胶囊剂，膏剂，霜剂，贴剂，擦剂，粉剂，喷雾剂，植入剂，滴剂，栓剂，软膏剂，糖果剂等。

木兰花碱的给药途径包括各种给药途径：口服给药，注射给药，植入给药，腔内给药，舌下给药，肛门给药，透皮给药，内外敷等。

相关知识

一种治疗抑郁症的精油及其制备方法与用途与流程
紫椴花提取物在制备失眠症治疗药物中的应用
一种具有缓解抑郁症的食品组合物及其制备方法与流程
一种生物农药及其制备方法与流程
一种高效园林植物花卉杀虫剂及其制备方法与流程
一种防治花生根结线虫的药物组合物、药物制剂及其制备方法
灯盏花素中药提取物的制备方法与流程
植物提取物的制备方法与流程
舞花姜在杀螨杀虫方面的用途及其生物农药与制备方法
一种茉莉花白绢病的中草药防治剂及其制备方法与流程

网址: 木兰花碱在制备防治失眠症抑郁症药物的用途和制备方法与流程 https://m.huajiangbk.com/newsview644033.html