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DNA条形码在热带龙脑香科树种鉴定中的应用

花匠小妙招
2024-08-27 08:24

胡建霖1,2, 刘志芳1,2, 慈秀芹1, 李捷1,*1.

中国科学院西双版纳热带植物园综合保护中心, 植物系统发育与保护生物学实验室, 昆明 650223

中国科学院大学, 北京 100049

Use of DNA Barcoding in Identifying Tropical Trees from Dipterocarpaceae

Jianlin Hu1,2, Zhifang Liu1,2, Xiuqin Ci1, Jie Li1,*1.

Laboratory of Plant Phylogenetics and Conservation, Center for Integrative Conservation, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China

University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

通讯作者:

* ,E-mail: jieli@xtbg.ac.cn* , E-mail: jieli@xtbg.ac.cn

收稿日期:2018-09-27接受日期:2019-02-11网络出版日期:2019-07-01

基金资助:中国科学院战略生物资源服务网络计划生物多样性保护策略(ZSSD-013和中国科学院东南亚生物多样性中心资助No.Y4ZK111B01)

Received:2018-09-27Accepted:2019-02-11Online:2019-07-01

摘要

龙脑香科植物是东南亚地区重要的热带木材来源树种, 对其开展DNA条形码评估在林业监管及森林资源保护等方面具有非常重要的实际应用价值。通过对龙脑香科植物样品进行rbcL、matK、trnL-trnF和ITS2四个片段的扩增和测序, 结合GenBank下载的数据, 共获得龙脑香科树种14属244种共计899条序列。通过比较4个片段的通用性、序列特征、种内和种间的遗传变异, 基于Best Match (BM)、Best Close Match (BCM)、相似性搜索算法(BLAST)和邻接树(NJ) 4种方法评估DNA条形码对于龙脑香科树种的鉴定能力。结果表明, ITS2在龙脑香科树种中鉴定效率最高, 通过优化的扩增体系能够从该科植物叶片中获得较高质量的ITS2片段; 叶绿体matK片段扩增和测序效率为100%, 且种内及种间遗传变异明显, 鉴定成功率高于其它叶绿体片段, 并据此提出ITS2和matK适合作为龙脑香科树种的DNA条形码。

关键词：

龙脑香科

;

DNA条形码

;

ITS2

;

matK

;

热带地区

Abstract

Plants from Dipterocarpaceae are vital tropical timber trees in Southeast Asia. They have high potential in forest supervision, forest resource protection and other aspects to evaluate the efficiency of DNA barcodes. We obtained 899 sequences from 244 species for 14 genera combined with sequences from the GenBank. We amplified and sequenced four DNA regions (rbcL, matK, trnL-trnF and ITS2) in samples from the family Dipterocarpaceae. The discrimination ability of DNA barcodes was evaluated by using effective sequence ratios, characteristics of sequences, divergence of intra- and inter-varieties, and identification success rates (Best Match, Best Close Match, BLAST and neighbor-joining methods). The ITS2 fragment showed the highest identification efficiency. High-quality ITS2 sequence can be obtained from the leaves of Dipterocarpaceae plants by using an optimized amplification system. The matK fragment showed obvious genetic variation and 100% amplification and sequencing efficiency, and its identification ability was higher than with other chloroplast markers. Therefore, ITS2 and matK are suitable markers for tropical trees from Dipterocarpaceae.

Keywords：

Dipterocarpaceae

;

DNA barcoding

;

ITS2

;

matK

;

tropical region

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引用本文
胡建霖, 刘志芳, 慈秀芹, 李捷. DNA条形码在热带龙脑香科树种鉴定中的应用. 植物学报, 2019, 54(3): 350-359 doi:10.11983/CBB18205
Hu Jianlin, Liu Zhifang, Ci Xiuqin, Li Jie.

Use of DNA Barcoding in Identifying Tropical Trees from Dipterocarpaceae

. Chinese Bulletin of Botany, 2019, 54(3): 350-359 doi:10.11983/CBB18205

自林奈时期, 人们就利用生物的形态学特征对动、植物进行分类与鉴别, 但是分类学发展了200多年, 地球上仅有约20%的物种被正式鉴定命名(Wilson, 2016)。面对传统形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学研究队伍, 分类学的发展面临巨大的挑战(Hebert et al., 2003), 尤其是在生物多样性极为丰富的热带东南亚地区, 如何对这些区域的热带树种进行分类鉴定是植物分类学和生态学工作者面临的一个重大挑战。

龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(李锡文等, 2002)。龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(Ashton, 1982)。中国有龙脑香科植物5属13种, 均局域分布在西藏东南部、云南西南至东南部、广西西南部及海南, 目前已有10种被列入国家重点保护野生植物名录, 占中国分布总数的76.9%, 其中一级保护种类1种, 二级保护种类6种, 三级保护种类3种(童绍全和陶国达, 1990; 于永福, 1999)。龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(罗良才, 1988)。在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(杨家驹等, 1989)。据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(罗良才, 2008)。云南婆罗双(Shorea assamica Dyer)树干挺直, 分枝高, 径级大, 出材量高, 其木材为散孔材, 边材黄白色, 心材黄褐色, 比重及硬度中等, 木材纹理直, 结构中至略粗, 加工性能良好, 可供旋切、工业、建筑及装修等多种用途(杨家驹等, 1991; 周亮等, 2013)。东京龙脑香(Diptero- carpus retusus Bl.), 其商品材名称为Holong (印度、缅甸)、Hullung (印度)、Kanyin (缅甸)、Keruing gunong (马来西亚), 主要生长于潮湿的沟谷雨林及石灰山密林中, 树形高大, 木材暗灰色, 材质略硬重, 是稀有珍贵的大径级用材树种, 被列为国家I级重点保护物种(成俊卿, 1980; 童绍全和陶国达, 1990)。冰片是龙脑香科植物中树脂凝结形成的一种近于白色的结晶体, 是一种名贵香料, 古代称之为龙脑, 以示其珍贵。另外, 龙脑香科植物的树脂和木油是化工和医药原料(王锦亮等, 1992; 戴文君等, 2017)。由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(朱华和王洪, 1992)。龙脑香科树种多为高大乔木, 难以获取花和果实等具明显特征的植物器官用于形态鉴定, 因此对其进行分类鉴定往往依赖于经验丰富的分类专家。在实际工作中, 针对龙脑香科树种、幼苗、植物碎片及木材产品等的准确鉴定尤为困难。

DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(Hebert et al., 2003; Kress et al., 2005)。自DNA条形码技术的概念被提出以来, 研究者制订了DNA条形码的选择标准: (1) 尽量短的片段, 片段两端连接相对保守的区域, 易于开发通用引物; (2) 要有足够的变异可将物种区分开来(CBOL Plant Working Group et al., 2009; 任保青和陈之端, 2010)。利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(Kress et al., 2005; China Plant BOL Group et al., 2011)。近些年, DNA条形码技术的发展十分迅速, 已经应用于一些热带珍贵植物树种的鉴定。例如, Hassold等(2016)对马达加斯加的红木类树种(red wood)进行DNA条形码研究, 评估3个DNA条形码片段(matK、rbcL和trnL)对于不同产地及不同种类红木的鉴定效率; Jiao等(2018)利用6种紫檀属(Pterocarpus Jacq.)木材标本和干燥叶片样品材料, 评估ITS2、matK、ndhF-rpl32和rbcL四个DNA条形码鉴定效果, 并构建6种紫檀属DNA条形码数据库。在龙脑香科树种中也开展了不少相关研究。例如, Tsumura等(2011)通过比较trnL、trnL-trnF、trnH-trnK和psbC-trnS片段构建了84种娑罗双属(Shorea Roxb.)植物分子数据库; Trang等(2015)评估rbcL、matK和trnH-psbA片段在东南亚地区4种坡垒属(Hopea Roxb.)近缘树种中的鉴定效果, 发现matK鉴定效果优于rbcL和trnH-psbA。目前, 龙脑香科植物的DNA条形码研究仅见于对娑罗双属和坡垒属等少数类群, 而整个龙脑香科的条形码尚未形成统一的标准(Kamiya et al., 2005; Tsumura et al., 2011; Trang et al., 2015)。

本研究选择目前常用于龙脑香科植物分子系统学研究的叶绿体rbcL、matK和trnL-trnF片段以及ITS2, 综合评估其在热带龙脑香科树种中的通用性和鉴定能力, 筛选出适合龙脑香科木材树种鉴定的DNA条形码及组合片段, 以期为热带地区森林树种鉴定与保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究样品采集于中国科学院西双版纳热带植物园龙脑香科专类园区, 每个树种采集2-3个个体的新鲜叶片, 共采集龙脑香科5属9种共计19份样品(表1)。凭证材料均保存于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆(HITBC)。为了在更大范围内考察条形码片段对龙脑香科树种的鉴别能力, 我们整理了来自GenBank中常用于龙脑香科植物系统发育分析的叶绿体rbcL、matK和trnL-trnF片段以及进化速率较快的ITS2, 最终共获得龙脑香科14属244种共计899条序列, 包括娑罗双属(Shorea Roxb.) 119种、坡垒属(Hopea Roxb.) 40种、龙脑香属(Dipterocarpus Gaertn. f.) 26种、青梅属(Vatica L.) 20种以及柳安属(Parashorea Kurz) 7种。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和扩增

使用变色硅胶快速干燥叶片材料。每次称取30 mg叶片加入液氮研碎, 采用改进后的CTAB法(Doyle and Doyle, 1987)提取植物总DNA, 使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。以rbcL、matK、trnL-trnF和ITS2作为扩增目的片段, 扩增体系(20 μL)为: 2 μL DNA模板, 2.0 μL 10×PCR Buffer, 2.0 μL 25 mmol∙L-1 MgCl2, 1.6 μL 2.5 mmol∙L-1 dNTPs, 0.2 μL 5 U∙μL-1 rTaq, 12.2 μL ddH2O, 10 µmol∙L-1正反扩增引物各1 μL。对扩增或测序失败的样品使用高保真聚合酶(TransTaq HiFi DNA Polymerase)进行重复实验, 并调整扩增体系为: 2 μL DNA模板, 2.0 μL HiFi Buffer I, 1.6 μL 2.5 mmol∙L-1 dNTPs, 0.2 μL 5 U∙μL-1 HiFi DNA Polymerase, 14.2 μL ddH2O。由于matK片段引物通用性较低, 实验中使用matK3- F/matK1R与matK-390F/matK-1326R两对引物(Chen et al., 2010)进行扩增。另外, 在matK和ITS2扩增体系中添加BSA和DMSO以提高扩增效率。除此之外, 由于ITS2片段有较高的GC/AT含量, 在扩增失败的样品反应体系中添加5% GC Enhancer。扩增产物送华大基因(广州华大公司)进行双向测序, 扩增引物及反应程序见表2。

Table 1
表1
表1实验材料
Table 1

Information of experimental materials
No.SpeciesVoucher numbersGenBank accession numberrbcLmatKtrnL-trnFITS21Dipterocarpus turbinatus C. F. GaertnerJL5901MK030561MK051080MK051054MK0510692D. turbinatus C. F. GaertnerJL5902MK030562MK051081MK051055MK0510703D. retusus BlumeJL9601MK030559MK051078MK051052MK1930324D. retusus BlumeJL9602MK030560MK051079MK051053MK1930315Hopea chinensis (Merr.) Hand.-Mazz.JL110AMK030563MK051082MK193024MK1930266H. chinensis (Merr.) Hand.-Mazz.JL110BMK030564MK051083MK051059MK1930257H. hainanensis Merrill & ChunJL2201MK030565MK051084MK051060MK1930298H. hainanensis Merrill & ChunJL2202MK030566MK051085MK051061MK1930289H. hainanensis Merrill & ChunJL2203MK030567MK051086MK051062MK19303010Parashorea chinensis H. WangJL6101MK030568MK051087MK051056MK05107111P. chinensis H. WangJL6102MK030569MK051088MK051057MK05107212Shorea assamica DyerJL3901MK030571MK051090MK051063-13S. assamica DyerJL3902MK030570MK051089MK051058MK05107314Vatica diospyroides SymingtonJL7601MK030572MK051091MK051064MK05107415V. diospyroides SymingtonJL7602MK030573MK051092MK193023MK05107516V. guangxiensis X. L. MoJL4801MK030574MK051093MK051065MK05107617V. guangxiensis X. L. MoJL4802MK030575MK051094MK051066MK05107718V. mangachapoi BlancoJL111AMK030576MK051095MK051067-19V. mangachapoi BlancoJL111BMK030577MK051096MK051068MK193027

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Table 2
表2
表2PCR扩增引物及程序
Table 2

Primer pairs used for PCR amplification and amplification protocol
BarcodesPrimers sequence (5'-3')Amplification protocolReferencesrbcL1F: ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
724R: TCGCATGTACCTGCAGTAGC94°C 4 min; 94°C 30 s, 55°C 45 s, 72°C 1 min, 5 cycles; 94°C 30 s, 54°C 45 s, 72°C 10 min, 30 cycles; 72°C 10 minFay et al., 1997 Olmstead et al., 1992
matK
3F: CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGA
1R: ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGG94°C 4 min; 94°C 30 s, 51°C 50 s, 72°C 50 s, 35 cycles; 72°C 10 minUnpublished
390F: CGATCTATTCATTCAATATTTC
1326R: TCTAGCACACGAAAGAAGT94°C 4 min; 94°C 30 s, 50°C 50 s, 72°C 50 s, 35 cycles; 72°C 10 minCuénoud et al., 2002trnL-trnF
F: GGTTCAAGTCCCTCTATCCC
R: ATTTGAACTGGTGACACGAG94°C 4 min; 94°C 30 s, 55°C 1 min,
72°C 1 min, 35 cycles; 72°C 5 minTaberlet et al.,1991
ITS2
ITS2 2F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT
ITS2 3R: GACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C 4 min; 94°C 30 s, 55°C 45 s, 72°C 45 s, 35 cycles; 72°C 10 minChen et al., 2010
Chen et al., 2010ITS3: GCATCGATGAAGAACGCAGC
26SE: TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC94°C 4 min; 94°C 30 s, 57°C 45 s, 72°C 45 s, 35 cycles; 72°C 10 minWhite et al., 1990; Sun et al., 1994

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1.2.2 数据处理

使用Sequencher 4.14软件(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA)对双向测序结果进行序列拼接和人工校对, 去除低质量序列和两端引物区。使用MEGA 6.0软件(Tamura et al., 2013)对获得的序列进行比对, 采用K2P (Kimura-2-parameter)模型计算种内及种间平均遗传距离。种内、种间遗传变异通过Taxton DNA软件(Meier et al., 2006)进行计算, 随后使用SPSS V21.0软件(IBM Corp., Armonk, New York, USA)对各片段的种内、种间遗传距离差异进行Wilcoxon Signed Rank检验(Lahaye et al., 2008)。采用Taxon DNA软件中的BM (Best Match)和BCM (Best Close Match)两种方法分析鉴定成功率。利用Geneious 6.15软件(Biomatters Ltd.)中Custom Blast功能实现本地BLAST, 以相同位点的百分比(identical sites)作为量化标准, 如果相同物种的identical sites值都大于与其它所有物种个体间的identical sites值, 即认为这个物种被准确鉴定(卢孟孟等, 2013)。使用Geneious 6.15软件构建邻接(NJ)树, 设置bootstrap值为1 000, 检验各支点支持率。如果同一个物种的所有个体形成1个单系, 且节点支持率大于50%, 则认为该物种被准确鉴定。

2 结果与讨论

2.1 候选条形码扩增和测序成功率

我们统计了4个片段的扩增和测序成功率, 将获得清晰的目的条带判定为扩增成功, 测序后获得高质量目的片段序列判定为测序成功。有效片段获得率计算公式为:

有效片段获得率=扩增成功率×测序成功率

计算结果见表3。叶绿体片段rbcL、matK和trnL-trnF均获得100%的扩增成功率和测序成功率。通过采用引物ITS2F/ITS3R (Chen et al., 2010)进行扩增, ITS2的扩增成功率为100%, 而有效序列获得率仅为47.4%; 通过调整引物ITS3/26SE (White et al., 1990; Sun et al., 1994)并优化扩增体系, ITS2的有效序列获得率提高到89.5%。19个龙脑香科植物样品材料的扩增和测序结果表明, 叶绿体片段的有效序列获得率明显高于ITS2, 但采用2对ITS2引物进行扩增能够获得较高质量的ITS2序列。

Table 3
表3
表3条形码扩增和测序成功率
Table 3

The success rate of PCR amplification and sequencing
BarcodesAmplification efficiency (%)Success rate of sequencing (%)Effective sequence ratio (%)rbcL100.0100.0100.0matK100.0100.0100.0trnL-trnF100.0100.0100.0ITS2 100.089.589.5

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2.2 序列特征分析及种内种间遗传变异比较

我们共获得899条序列, 包括rbcL片段259条、matK片段207条、trnL-trnF基因间隔区365条和ITS2片段68条。经过序列比对后得到rbcL、matK、trnL-trnF和ITS2四个片段的序列矩阵, 其长度分别为684、969、454和473 bp, GC含量分别为46.0%、35.8%、27.2%和72.5% (表4)。由于获得的序列包含ITS2片段数目较少, 因此没有对ITS2片段进行种内种间的遗传变异统计。数据分析结果显示, 3个叶绿体片段rbcL、matK和trnL-trnF的种内和种间变异分布有较多的重叠区域, 没有形成明显的间隔区; trnL-trnF和matK片段的种内遗传变异大于rbcL片段(P<0.05), 而trnL-trnF和matK片段的种内遗传变异差异不显著, 3个叶绿体片段的种内遗传变异的大小关系为trnL-trnF>rbcL, matK>rbcL, trnL-trnF和matK种内变异不显著(表5); 在种间遗传距离的Wilcoxon Signed Rank检验中, 3个叶绿体片段的种间遗传变异差异显著, 其变异大小为trnL-trnF>matK>rbcL (表6)。

通过对种内和种间的K2P遗传距离分布进行分析, 表明3条叶绿体片段rbcL、matK和trnL-trnF的种内和种间遗传距离分布没有显示清晰的Barcoding Gap (图1)。

Table 4
表4
表4序列特征信息
Table 4

Information of sequences characteristic
BarcodesNo. of sequencesAligned length (bp)GC content (%)No. of
variable sitesIntraspecific distance (mean)Interspecific distance (mean)rbcL25968446.0230.00060.0161matK20796935.8270.00320.0273trnL-trnF36545427.2460.00410.0273ITS26847372.5510.00170.1311

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Table 5
表5
表5叶绿体条形码片段在龙脑香科物种种内变异Wilcoxon检验
Table 5

Wilcoxon signed rank tests of intraspecific divergence among chloroplast markers in the species of Dipterocarpaceae
W+W-Intra relative ranksNP valueResulttrnL-trnFrbcLW+=1258, W-=120962.20E-07P<0.05, trnL-trnF>rbcLtrnL-trnFmatKW+=298, W-=297439.93E-01P>0.05, matK=trnL-trnFmatKrbcLW+=408, W-=57449.18E-04P<0.05, matK>rbcL

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Table 6
表6
表6叶绿体条形码片段在龙脑香科物种种间变异Wilcoxon检验
Table 6

Wilcoxon signed rank tests of interspecific divergence among chloroplast markers in the species of Dipterocarpaceae
W+W-Inter relative ranksNP valueResulttrnL-trnFrbcLW+=8136415.5, W-=1811614.545603.78E-296P<0.05, trnL-trnF>rbcLtrnL-trnFmatKW+=236579.5, W-=156361.59031.41E-07P<0.05, trnL-trnF>matKmatKrbcLW+=411099, W-=368329461.00E-13P<0.05, matK>rbcL

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图1

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图1条形码片段在龙脑香科物种种内和种间遗传变异分布

(A) rbcL序列; (B) matK序列; (C) trnL-trnF序列
Figure 1Distribution for intra and inter-specific variation of markers in the species of Dipterocarpaceae

(A) rbcL sequence; (B) matK sequence; (C) trnL-trnF sequence

2.3 候选条形码鉴定能力评估

利用BM、BCM、BLAST和NJ四种方法分别对4个候选条形码物种水平的鉴定能力进行分析(图2), 结果获得ITS2 68条, 用BM/BCM方法获得100%的鉴定成功率; 基于BLAST方法, 鉴定成功率为93.33%; 基于NJ法, 鉴定成功率为85.71%。matK片段207条, 基于BM/BCM方法, 鉴定成功率为31.45%; 基于

BLAST方法, 鉴定成功率为42.31%;基于NJ法, 成功率为35.42%。获得trnL-trnF片段365条, 基于BM/BCM、BLAST和NJ方法分别获得22.34%、37.61%和17.04%的鉴定成功率。获得rbcL片段259条, 基于BM/BCM、BLAST和NJ方法, 分别获得22.03%、32.79%和27%的鉴定成功率。总体来看, 基于4种评估方法获得了较为一致的分析结果。

图2

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图2基于4种方法的条形码鉴定效率比较

Figure 2Comparison of the identification efficiency of barcodes base on four methods

2.4 讨论

2.4.1 龙脑香科树种DNA条形码综合评价

理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(Kress et al., 2005; Taberlet et al., 2007; 任保青和陈之端, 2010)。本研究中, 我们发现ITS2片段在龙脑香科植物树种中呈现较高的扩增率和测序成功率(分别为100%和89.5%), 且基于BM、BCM、BLAST和NJ树4种条形码评估方法均获得最高的鉴定成功率, 因此我们认为ITS2是龙脑香科树种首选的DNA条形码。能否成功获得高质量条形码序列决定着条形码技术可否应用到实际物种鉴定工作中, 因此条形码扩增率和测序成功率是条形码筛选时的重要指标。ITS2是ITS序列的1个片段, 位于5.8S和26S rRNA之间, 其序列长度较短, 易于扩增和测序, 且其二级结构能够提供更多的信息(Schultz and Wolf, 2009; China Plant BOL Group et al., 2011)。Chen等(2010)通过大规模的取样分析, 认为可将ITS2作为药用植物鉴定的核心条形码; 同时, ITS2在山葡萄(Vitis amurensis)、兰科及红景天属等植物中也显示较好的鉴定效果(宋慧芳等, 2017; De Boer et al., 2017; Zhu et al., 2017)。本研究采用引物ITS3/26SE并优化扩增体系, 通过在扩增体系中添加DMSO及BSA提高PCR的产物特异性和产量。此外, 根据ITS2具有较高的GC/AT含量, 使用高保真DNA聚合酶和GC Enhancer优化PCR过程, 提高了ITS2在龙脑香科树种的获得率, 我们建议将20 μL体系作为龙脑香科植物树种ITS2片段扩增的标准体系。

以往的研究表明, 叶绿体基因组进化速率相对较慢, 能够提供鉴定分析的变异位点较少(Newmaster et al., 2006; Chase et al., 2007; Kress and Erickson, 2007)。根据Wilcoxon Signed Rank检验结果, matK和trnL-trnF片段的种间遗传变异较高, 且差异显著, 显示出较高的应用潜力。matK基因序列是植物叶绿体基因中进化较快的编码基因, 基于样品序列matK片段在龙脑香科树种中进行物种鉴定的成功率仅次于ITS2片段, 表明matK用于龙脑香科树种鉴定效果较好。叶绿体基因间隔区trnL-trnF常用于龙脑香科树种的分子系统学研究, 在GenBank数据库中有较多的数据, 但在本研究中基于4种评估方法获得的鉴定成功率较低。rbcL片段是DNA条形码的核心之一, 由于其引物通用性较高而被广泛使用, 但因变异较小不适合用于种级水平的物种鉴定(Kress and Erickson, 2007; Lahaye et al., 2008)。本研究结果显示, 叶绿体rbcL片段种内种间遗传变异不明显, 且鉴定成功率低于其它片段, 因此不适合作为热带龙脑香科树种的DNA条形码。综上, 我们建议将ITS2和matK片段作为热带龙脑香科树种的DNA条形码。

2.4.2 条形码技术在热带龙脑香科树种鉴定中的应用展望

随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(Dormontt et al., 2015)。基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(Gasson et al., 2010; Dormontt et al., 2015)。近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(Huang et al., 2015)、植物幼苗(Gon- zalez et al., 2009)和木材标本(Yu et al., 2017; Jiao et al., 2018; 乔梦吉等, 2018)等样品材料中均成功获得条形码片段, 尤其是Tsumura等(2011)在龙脑香科木材样品中成功扩增到trnL、trnL-trnF、trnH- trnK和psbC-trnS片段。这些研究表明以植物叶片为材料扩增到的植物条形码片段也能用于龙脑香科木材产品的鉴定。本研究以龙脑香科树种的干燥叶片为样品材料, 结合GenBank数据分析评估4种条形码片段在龙脑香科植物鉴定方面的应用潜力, 能够为龙脑香科树种及木材产品的条形码鉴定提供借鉴。

龙脑香科植物是热带雨林中具有重要生态价值和经济意义的树种, 其木材产品在东南亚地区热带木材市场中有重要地位。本研究涉及的条形码序列来自龙脑香科14属244种, 共计899条, 涵盖了龙脑香科树种82.4%的属和46.1%的种, 序列数据大多来源于东南亚地区龙脑香科树种的相关研究, 在较大范围内代表了龙脑香科树种的遗传变异。目前, 龙脑香科植物的物种亲缘关系还未得到很好的解决与澄清, 这可能在一定程度上影响了DNA条形码在此类群中的应用。分子系统学研究结果不支持将龙脑香亚科(Dipterocarpoideae)分为Dipterocarpeae和Shoreeae 2个族, 理由是龙脑香属(Dipterocarpus Gaertn. f.)被认为是冰片香属(Dryobalanops C.F. Gaertn.)和Shoreeae的姐妹类群, 且娑罗双属(Shorea Roxb.)为非单系分支(Heckenhauer et al., 2017; Ng et al., 2017)。利用DNA条形码进行物种鉴定需要较为完善的物种系统发育框架, 因此龙脑香科条形码的研究有赖于其系统发育关系树的构建。随着高通量测序技术(next generation sequencing)的发展, DNA条形码技术衍生出新的发展趋势。例如, 基因组浅层测序(genome skimming)通过获得全基因组较低测序深度基因组数据, 借助生物信息学手段可获得叶绿体全基因组以及核基因组中高度重复区域(nrDNA)等序列(Hollingsworth et al., 2016; Zeng et al., 2018)。利用高通量测序技术能够获得物种的基因组水平信息, 为快速分化的近缘物种鉴定提供更加有效的解决办法(李德铢和曾春霞, 2015)。随着条形码技术的不断成熟, 以及龙脑香科木材树种DNA条形码数据库的不断完善和龙脑香科系统发育关系的日趋明确, 相信DNA条形码技术将成为热带地区龙脑香科木材树种鉴定的有力工具。

致谢本研究的样品采集承蒙中国科学院西双版纳热带植物园园林园艺部工作人员和实习生刘志毅的大力帮助; 实验处理得到了蔡超男和张灿瑜的帮助。在此一并表示感谢！

(责任编辑: 白羽红)

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... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

).中国有龙脑香科植物5属13种, 均局域分布在西藏东南部、云南西南至东南部、广西西南部及海南, 目前已有10种被列入国家重点保护野生植物名录, 占中国分布总数的76.9%, 其中一级保护种类1种, 二级保护种类6种, 三级保护种类3种(

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

).云南婆罗双(Shorea assamica Dyer)树干挺直, 分枝高, 径级大, 出材量高, 其木材为散孔材, 边材黄白色, 心材黄褐色, 比重及硬度中等, 木材纹理直, 结构中至略粗, 加工性能良好, 可供旋切、工业、建筑及装修等多种用途(

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

).东京龙脑香(Diptero- carpus retusus Bl.), 其商品材名称为Holong (印度、缅甸)、Hullung (印度)、Kanyin (缅甸)、Keruing gunong (马来西亚), 主要生长于潮湿的沟谷雨林及石灰山密林中, 树形高大, 木材暗灰色, 材质略硬重, 是稀有珍贵的大径级用材树种, 被列为国家I级重点保护物种(

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

).冰片是龙脑香科植物中树脂凝结形成的一种近于白色的结晶体, 是一种名贵香料, 古代称之为龙脑, 以示其珍贵.另外, 龙脑香科植物的树脂和木油是化工和医药原料(

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

).龙脑香科树种多为高大乔木, 难以获取花和果实等具明显特征的植物器官用于形态鉴定, 因此对其进行分类鉴定往往依赖于经验丰富的分类专家.在实际工作中, 针对龙脑香科树种、幼苗、植物碎片及木材产品等的准确鉴定尤为困难. ...

植物DNA条形码研究展望
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戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

亚热带森林乔木树种DNA条形码研究——以哀牢山自然保护区为例
1
2013

... 使用Sequencher 4.14软件(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA)对双向测序结果进行序列拼接和人工校对, 去除低质量序列和两端引物区.使用MEGA 6.0软件(

Tamura et al., 2013

)对获得的序列进行比对, 采用K2P (Kimura-2-parameter)模型计算种内及种间平均遗传距离.种内、种间遗传变异通过Taxton DNA软件(

Meier et al., 2006

)进行计算, 随后使用SPSS V21.0软件(IBM Corp., Armonk, New York, USA)对各片段的种内、种间遗传距离差异进行Wilcoxon Signed Rank检验(

Lahaye et al., 2008

).采用Taxon DNA软件中的BM (Best Match)和BCM (Best Close Match)两种方法分析鉴定成功率.利用Geneious 6.15软件(Biomatters Ltd.)中Custom Blast功能实现本地BLAST, 以相同位点的百分比(identical sites)作为量化标准, 如果相同物种的identical sites值都大于与其它所有物种个体间的identical sites值, 即认为这个物种被准确鉴定(

卢孟孟等, 2013

).使用Geneious 6.15软件构建邻接(NJ)树, 设置bootstrap值为1 000, 检验各支点支持率.如果同一个物种的所有个体形成1个单系, 且节点支持率大于50%, 则认为该物种被准确鉴定. ...

云南龙脑香科树种木材识别与利用的研究
1
1988

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

云南进口龙脑香科树种的木材识别与利用
1
2008

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

基于DNA条形码技术的楠属和润楠属5种木材的识别
1
2018

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

)等样品材料中均成功获得条形码片段, 尤其是Tsumura等(2011)在龙脑香科木材样品中成功扩增到trnL、trnL-trnF、trnH- trnK和psbC-trnS片段.这些研究表明以植物叶片为材料扩增到的植物条形码片段也能用于龙脑香科木材产品的鉴定.本研究以龙脑香科树种的干燥叶片为样品材料, 结合GenBank数据分析评估4种条形码片段在龙脑香科植物鉴定方面的应用潜力, 能够为龙脑香科树种及木材产品的条形码鉴定提供借鉴. ...

植物DNA条形码技术
2
2010

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

).自DNA条形码技术的概念被提出以来, 研究者制订了DNA条形码的选择标准: (1) 尽量短的片段, 片段两端连接相对保守的区域, 易于开发通用引物; (2) 要有足够的变异可将物种区分开来(

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

).近些年, DNA条形码技术的发展十分迅速, 已经应用于一些热带珍贵植物树种的鉴定.例如, Hassold等(2016)对马达加斯加的红木类树种(red wood)进行DNA条形码研究, 评估3个DNA条形码片段(matK、rbcL和trnL)对于不同产地及不同种类红木的鉴定效率; Jiao等(2018)利用6种紫檀属(Pterocarpus Jacq.)木材标本和干燥叶片样品材料, 评估ITS2、matK、ndhF-rpl32和rbcL四个DNA条形码鉴定效果, 并构建6种紫檀属DNA条形码数据库.在龙脑香科树种中也开展了不少相关研究.例如, Tsumura等(2011)通过比较trnL、trnL-trnF、trnH-trnK和psbC-trnS片段构建了84种娑罗双属(Shorea Roxb.)植物分子数据库; Trang等(2015)评估rbcL、matK和trnH-psbA片段在东南亚地区4种坡垒属(Hopea Roxb.)近缘树种中的鉴定效果, 发现matK鉴定效果优于rbcL和trnH-psbA.目前, 龙脑香科植物的DNA条形码研究仅见于对娑罗双属和坡垒属等少数类群, 而整个龙脑香科的条形码尚未形成统一的标准(

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

).本研究中, 我们发现ITS2片段在龙脑香科植物树种中呈现较高的扩增率和测序成功率(分别为100%和89.5%), 且基于BM、BCM、BLAST和NJ树4种条形码评估方法均获得最高的鉴定成功率, 因此我们认为ITS2是龙脑香科树种首选的DNA条形码.能否成功获得高质量条形码序列决定着条形码技术可否应用到实际物种鉴定工作中, 因此条形码扩增率和测序成功率是条形码筛选时的重要指标.ITS2是ITS序列的1个片段, 位于5.8S和26S rRNA之间, 其序列长度较短, 易于扩增和测序, 且其二级结构能够提供更多的信息(

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

).Chen等(2010)通过大规模的取样分析, 认为可将ITS2作为药用植物鉴定的核心条形码; 同时, ITS2在山葡萄(Vitis amurensis)、兰科及红景天属等植物中也显示较好的鉴定效果(

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

).本研究采用引物ITS3/26SE并优化扩增体系, 通过在扩增体系中添加DMSO及BSA提高PCR的产物特异性和产量.此外, 根据ITS2具有较高的GC/AT含量, 使用高保真DNA聚合酶和GC Enhancer优化PCR过程, 提高了ITS2在龙脑香科树种的获得率, 我们建议将20 μL体系作为龙脑香科植物树种ITS2片段扩增的标准体系. ...

山葡萄种质资源DNA条形码通用序列的筛选
1
2017

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

两种云南龙脑香属植物树脂精油的倍半萜成分及其季节性变化
1
1992

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

龙脑香亚科木材
1
1989

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

娑罗双属商品材
1
1991

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

中国野生植物保护工作的里程碑——《国家重点保护野生植物名录(第一批)》出台
1
1999

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

热带植物云南娑罗双
1
2013

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

西双版纳龙脑香科植物纪要
1
1992

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

Flora Malesiana. Series I—Spermatophyta. Flowering Plants, Vol. 9, Part 2. Dipterocarpaceae. The Netherlands:
1
1982

... 龙脑香科(Dipterocarpaceae)是典型的泛热带分布科, 作为东南亚低地湿性雨林的优势科, 是热带雨林特征性树种(

李锡文等, 2002

).龙脑香科被划分为龙脑香亚科(Dipterocarpideae)、非洲香亚科(Mon- toideae)及美洲香亚科(Pakaraimoideae) 3个亚科, 共有17属约529种(

Ashton, 1982

童绍全和陶国达, 1990

;

于永福, 1999

).龙脑香科植物具有速生、丰产和材质优良等特点, 是东南亚国家传统商品木材的重要来源(

罗良才, 1988

).在东南亚地区, 龙脑香科木材产量约为其它各科之总和(

杨家驹等, 1989

).据统计, 云南进口龙脑香科树种的木材有7属, 25-30种, 且进口比例呈逐年上升的趋势(

罗良才, 2008

杨家驹等, 1991

;

周亮等, 2013

成俊卿, 1980

;

童绍全和陶国达, 1990

王锦亮等, 1992

;

戴文君等, 2017

).由于历史上龙脑香科的有关资料缺乏, 加之该科植物又都是热带雨林的上层乔木树种, 分类和鉴定存在较大困难(

朱华和王洪, 1992

A DNA barcode for land plants
1
2009

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants
1
2007

... 以往的研究表明, 叶绿体基因组进化速率相对较慢, 能够提供鉴定分析的变异位点较少(

Newmaster et al., 2006

;

Chase et al., 2007

;

Kress and Erickson, 2007

).根据Wilcoxon Signed Rank检验结果, matK和trnL-trnF片段的种间遗传变异较高, 且差异显著, 显示出较高的应用潜力.matK基因序列是植物叶绿体基因中进化较快的编码基因, 基于样品序列matK片段在龙脑香科树种中进行物种鉴定的成功率仅次于ITS2片段, 表明matK用于龙脑香科树种鉴定效果较好.叶绿体基因间隔区trnL-trnF常用于龙脑香科树种的分子系统学研究, 在GenBank数据库中有较多的数据, 但在本研究中基于4种评估方法获得的鉴定成功率较低.rbcL片段是DNA条形码的核心之一, 由于其引物通用性较高而被广泛使用, 但因变异较小不适合用于种级水平的物种鉴定(

Kress and Erickson, 2007

;

Lahaye et al., 2008

).本研究结果显示, 叶绿体rbcL片段种内种间遗传变异不明显, 且鉴定成功率低于其它片段, 因此不适合作为热带龙脑香科树种的DNA条形码.综上, 我们建议将ITS2和matK片段作为热带龙脑香科树种的DNA条形码. ...

Validation of the
2
2010

... 使用变色硅胶快速干燥叶片材料.每次称取30 mg叶片加入液氮研碎, 采用改进后的CTAB法(

Doyle and Doyle, 1987

)提取植物总DNA, 使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测.以rbcL、matK、trnL-trnF和ITS2作为扩增目的片段, 扩增体系(20 μL)为: 2 μL DNA模板, 2.0 μL 10×PCR Buffer, 2.0 μL 25 mmol∙L-1 MgCl2, 1.6 μL 2.5 mmol∙L-1 dNTPs, 0.2 μL 5 U∙μL-1 rTaq, 12.2 μL ddH2O, 10 µmol∙L-1正反扩增引物各1 μL.对扩增或测序失败的样品使用高保真聚合酶(TransTaq HiFi DNA Polymerase)进行重复实验, 并调整扩增体系为: 2 μL DNA模板, 2.0 μL HiFi Buffer I, 1.6 μL 2.5 mmol∙L-1 dNTPs, 0.2 μL 5 U∙μL-1 HiFi DNA Polymerase, 14.2 μL ddH2O.由于matK片段引物通用性较低, 实验中使用matK3- F/matK1R与matK-390F/matK-1326R两对引物(

Chen et al., 2010

)进行扩增.另外, 在matK和ITS2扩增体系中添加BSA和DMSO以提高扩增效率.除此之外, 由于ITS2片段有较高的GC/AT含量, 在扩增失败的样品反应体系中添加5% GC Enhancer.扩增产物送华大基因(广州华大公司)进行双向测序, 扩增引物及反应程序见

表2

. ...

... 计算结果见

表3

.叶绿体片段rbcL、matK和trnL-trnF均获得100%的扩增成功率和测序成功率.通过采用引物ITS2F/ITS3R (

Chen et al., 2010

)进行扩增, ITS2的扩增成功率为100%, 而有效序列获得率仅为47.4%; 通过调整引物ITS3/26SE (

White et al., 1990

;

Sun et al., 1994

)并优化扩增体系, ITS2的有效序列获得率提高到89.5%.19个龙脑香科植物样品材料的扩增和测序结果表明, 叶绿体片段的有效序列获得率明显高于ITS2, 但采用2对ITS2引物进行扩增能够获得较高质量的ITS2序列. ...

Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants
2
2011

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

Molecular phylogenetics of Caryo- phyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid
0
2002

DNA metabarcoding of orchid-derived products reveals widespread illegal orchid trade
0
2017

Forensic timber identification: it's time to integrate disciplines to combat illegal logging
2
2015

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

... ;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue
1
1987

... 使用变色硅胶快速干燥叶片材料.每次称取30 mg叶片加入液氮研碎, 采用改进后的CTAB法(

Doyle and Doyle, 1987

Chen et al., 2010

表2

. ...

Familial relationships of
0
1997

Wood identification of
1
2010

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

Iden- tification of Amazonian trees with DNA barcodes
0
2009

DNA barcoding of Malagasy rosewoods: towards a molecular identification of CITES-listed
0
2016

Biological identifications through DNA barcodes
2
2003

... 自林奈时期, 人们就利用生物的形态学特征对动、植物进行分类与鉴别, 但是分类学发展了200多年, 地球上仅有约20%的物种被正式鉴定命名(

Wilson, 2016

).面对传统形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学研究队伍, 分类学的发展面临巨大的挑战(

Hebert et al., 2003

), 尤其是在生物多样性极为丰富的热带东南亚地区, 如何对这些区域的热带树种进行分类鉴定是植物分类学和生态学工作者面临的一个重大挑战. ...

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

Phylogenetic analyses of plastid DNA suggest a different interpretation of morphological evolution than those used as the basis for previous classifications of Dipterocarpaceae (Malvales)
1
2017

Heckenhauer et al., 2017

;

Ng et al., 2017

Hollingsworth et al., 2016

;

Zeng et al., 2018

).利用高通量测序技术能够获得物种的基因组水平信息, 为快速分化的近缘物种鉴定提供更加有效的解决办法(

李德铢和曾春霞, 2015

Telling plant species apart with DNA: from barcodes to genomes
1
2016

Heckenhauer et al., 2017

;

Ng et al., 2017

Hollingsworth et al., 2016

;

Zeng et al., 2018

).利用高通量测序技术能够获得物种的基因组水平信息, 为快速分化的近缘物种鉴定提供更加有效的解决办法(

李德铢和曾春霞, 2015

Application of DNA barcodes in Asian tropical trees—a case study from Xishuangbanna Nature Reserve, Southwest China
1
2015

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

DNA barcode authentication and library development for the wood of six commercial
1
2018

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

Phylogeny of
1
2005

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding
2
2007

... 以往的研究表明, 叶绿体基因组进化速率相对较慢, 能够提供鉴定分析的变异位点较少(

Newmaster et al., 2006

;

Chase et al., 2007

;

Kress and Erickson, 2007

;

Lahaye et al., 2008

... 片段是DNA条形码的核心之一, 由于其引物通用性较高而被广泛使用, 但因变异较小不适合用于种级水平的物种鉴定(

Kress and Erickson, 2007

;

Lahaye et al., 2008

Use of DNA barcodes to identify flowering plants
3
2005

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

... 作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots
2
2008

... 使用Sequencher 4.14软件(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA)对双向测序结果进行序列拼接和人工校对, 去除低质量序列和两端引物区.使用MEGA 6.0软件(

Tamura et al., 2013

)对获得的序列进行比对, 采用K2P (Kimura-2-parameter)模型计算种内及种间平均遗传距离.种内、种间遗传变异通过Taxton DNA软件(

Meier et al., 2006

)进行计算, 随后使用SPSS V21.0软件(IBM Corp., Armonk, New York, USA)对各片段的种内、种间遗传距离差异进行Wilcoxon Signed Rank检验(

Lahaye et al., 2008

卢孟孟等, 2013

... 以往的研究表明, 叶绿体基因组进化速率相对较慢, 能够提供鉴定分析的变异位点较少(

Newmaster et al., 2006

;

Chase et al., 2007

;

Kress and Erickson, 2007

;

Lahaye et al., 2008

DNA barcoding and taxonomy in Diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success
1
2006

... 使用Sequencher 4.14软件(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA)对双向测序结果进行序列拼接和人工校对, 去除低质量序列和两端引物区.使用MEGA 6.0软件(

Tamura et al., 2013

)对获得的序列进行比对, 采用K2P (Kimura-2-parameter)模型计算种内及种间平均遗传距离.种内、种间遗传变异通过Taxton DNA软件(

Meier et al., 2006

)进行计算, 随后使用SPSS V21.0软件(IBM Corp., Armonk, New York, USA)对各片段的种内、种间遗传距离差异进行Wilcoxon Signed Rank检验(

Lahaye et al., 2008

卢孟孟等, 2013

DNA barcoding in land plants: evaluation of
1
2006

... 以往的研究表明, 叶绿体基因组进化速率相对较慢, 能够提供鉴定分析的变异位点较少(

Newmaster et al., 2006

;

Chase et al., 2007

;

Kress and Erickson, 2007

;

Lahaye et al., 2008

Genome size variation and evolution in Dipterocarpaceae
0
2016

Monophyly of the Asteridae and identification of their major lineages inferred from DNA sequences of
0
1992

ITS2 sequence-structure analysis in phylogenetics: a how-to manual for molecular syste- matics
1
2009

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

Phylogenetic analysis of
1
1994

... 计算结果见

表3

.叶绿体片段rbcL、matK和trnL-trnF均获得100%的扩增成功率和测序成功率.通过采用引物ITS2F/ITS3R (

Chen et al., 2010

)进行扩增, ITS2的扩增成功率为100%, 而有效序列获得率仅为47.4%; 通过调整引物ITS3/26SE (

White et al., 1990

;

Sun et al., 1994

Power and limitations of the chloroplast
1
2007

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA
0
1991

MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0
1
2013

... 使用Sequencher 4.14软件(GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA)对双向测序结果进行序列拼接和人工校对, 去除低质量序列和两端引物区.使用MEGA 6.0软件(

Tamura et al., 2013

)对获得的序列进行比对, 采用K2P (Kimura-2-parameter)模型计算种内及种间平均遗传距离.种内、种间遗传变异通过Taxton DNA软件(

Meier et al., 2006

)进行计算, 随后使用SPSS V21.0软件(IBM Corp., Armonk, New York, USA)对各片段的种内、种间遗传距离差异进行Wilcoxon Signed Rank检验(

Lahaye et al., 2008

卢孟孟等, 2013

Application of DNA barcoding markers to the identification of
1
2015

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

Molecular database for classifying
1
2011

... DNA条形码技术首先由Paul Hebert提出, 是利用1个或少数几个DNA片段对地球上所有物种进行识别和鉴定(

Hebert et al., 2003

;

Kress et al., 2005

CBOL Plant Working Group et al., 2009

;

任保青和陈之端, 2010

).利用以上标准, 研究者陆续提出将matK、rbcL、trnH-psbA和ITS/ITS2作为陆地植物的候选DNA条形码(

Kress et al., 2005

;

China Plant BOL Group et al., 2011

Kamiya et al., 2005

;

Tsumura et al., 2011

;

Trang et al., 2015

). ...

DNA barcoding of vouchered xylarium wood specimens of nine endangered
1
2017

... 随着世界各国对森林资源保护的重视, 使用合法认证的木材和木制品已成为国际共识, 因此对木材种类进行准确鉴定的重要性日趋凸显(

Dormontt et al., 2015

).基于宏观和微观特征的木材鉴定方法往往依赖于经验丰富的技术专家, 且大多数解剖学特征也只能将木材产品鉴定到属级水平(

Gasson et al., 2010

;

Dormontt et al., 2015

).近年来, 植物幼苗和木材等非标准材料DNA提取方法的改进大大提高了条形码技术在木材树种及其产品鉴定中的可行性, 研究者在树木形成层(

Huang et al., 2015

)、植物幼苗(

Gon- zalez et al., 2009

)和木材标本(

Yu et al., 2017

;

Jiao et al., 2018

;

乔梦吉等, 2018

Genome skimming herbarium spe- cimens for DNA barcoding and phylogenomics
1
2018

Heckenhauer et al., 2017

;

Ng et al., 2017

Hollingsworth et al., 2016

;

Zeng et al., 2018

).利用高通量测序技术能够获得物种的基因组水平信息, 为快速分化的近缘物种鉴定提供更加有效的解决办法(

李德铢和曾春霞, 2015

Establishment of the most comprehensive
1
2017

... 理想的DNA条形码需具备片段较短、种间变异较大且鉴定效率高等特点(

Kress et al., 2005

;

Taberlet et al., 2007

;

任保青和陈之端, 2010

Schultz and Wolf, 2009

;

China Plant BOL Group et al., 2011

宋慧芳等, 2017

;

De Boer et al., 2017

;

Zhu et al., 2017

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养花生活

DNA条形码在热带龙脑香科树种鉴定中的应用

Use of DNA Barcoding in Identifying Tropical Trees from Dipterocarpaceae

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

2 结果与讨论

2.1 候选条形码扩增和测序成功率

2.2 序列特征分析及种内种间遗传变异比较

图1

2.3 候选条形码鉴定能力评估

图2

2.4 讨论

参考文献 原文顺序文献年度倒序文中引用次数倒序被引期刊影响因子

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家庭养花知识大全(家庭养花知识大全与技巧)

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家庭养花知识大全 家庭养花有什么好处

参考文献原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

家庭养花风水知识家庭养花“五行说”

家庭养花知识大全家庭养花有什么好处