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平阴玫瑰花色苷的鉴定及对LPS/AGEs/4

花匠小妙招
2024-11-23 00:02

（1 北京工商大学食品与健康学院北京市食品添加剂工程技术研究中心食品添加剂与配料北京高校工程研究中心北京100048 2北京工商大学化学与材料工程学院北京100048 3济南紫金玫瑰股份有限公司济南 250000）

摘要平阴玫瑰是我国山东特有的玫瑰花资源，于2010 年被批准为新资源食品。本文提取并鉴定平阴玫瑰花中的花色苷，以脂多糖（LPS）、晚期糖基化终末产物（AGEs）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）分别诱导RAW264.7 巨噬细胞构建炎症模型，研究其对活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）生成及部分炎症因子表达的影响。结果表明：平阴玫瑰花色苷主要含有2 种苷元，分别为矢车菊素和芍药色素；共鉴定出6 种主要花色苷，分别为3 种矢车菊素-二己糖苷、2 种芍药素-二己糖苷及芍药素-芸香糖-己糖苷。花色苷能显著抑制LPS、AGEs 和4-HNE 诱导的RAW264.7 细胞中ROS 和NO 的产生，显著抑制促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达，表现出较好的抑制炎症反应的效果。

平阴玫瑰（Pingyin rose）为蔷薇属落叶灌木，是我国山东特有的玫瑰花资源。平阴玫瑰花作为食品食用已有千年历史，并于2010 年被批准为新资源食品[1]。平阴玫瑰花中含有丰富的类黄酮、萜类、类固醇、生育酚和胡萝卜素等物质，其中花色苷是平阴玫瑰花瓣中的主要活性成分之一[2-4]。常见的天然花色素有天竺葵色素（Pelargonidin）、飞燕草色素（Delphindin）、矢车菊色素（Cyanidin）、牵牛花色素（Petunidin）、芍药色素（Peonidin）和锦葵色素（Malvidin）等[5-6]。花色素可与不同的糖基结合，形成花色苷。各种花色苷结构上的差异是由于配糖体上羟基和甲氧基数目和位置的不同，配糖体上结合的糖基数目、种类和位置的不同，或是羟基乙酰化及与糖基相连脂肪酸种类与数目的不同形成的[7]，这些差异决定花色苷生物学性状和功能的多样性。

平阴玫瑰花可加工为玫瑰鲜花饼、玫瑰花酱、玫瑰粉、玫瑰花苞茶、玫瑰饮料等多种普通和功能食品，这些食品中都有丰富的玫瑰花色苷[8]。花色苷具有较好的抗氧化性，可以有效清除多种活性氧自由基[9-10]。花色苷还可显著抑制LPS 诱导的THP-1 样巨噬细胞中iNOS、COX-2 及NO、PGE2的表达，能显著下调TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8的mRNA 表达水平[11-12]。

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁组分，是主要的病原相关识别模式分子（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），通过细胞膜上的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRR），如TLR4，诱导活性氧和炎症因子[13-14]。4-HNE 和AGEs 是主要的损伤相关模式识别分子（Damage-associated molecular patterns，DAMPs），可能通过植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1），晚期糖基化终端产物受体（RAGE）等PRR 类型的受体结合介导炎症反应[15-17]。这3 种食品和人体内常见的促炎因子通过不同受体和通路介导氧化应激和炎症反应。平阴玫瑰花色苷对这些通路的氧化应激和炎症是否有缓解功能，目前尚不清楚。

本文以平阴玫瑰为原料，采用有机试剂法提取其花色苷成分，通过大孔树脂层析，乙酸乙酯萃取和中压柱层析纯化，UPLC 结合ESI/MS 鉴定平阴玫瑰中的花色苷组分。分别以LPS、AGEs、4-HNE 诱导RAW264.7 细胞炎症，比较平阴玫瑰花色苷对RAW264.7 细胞氧化应激和炎症水平影响的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平阴玫瑰鲜花于2018 年5 月采自山东平阴，经园艺林学专业吴华博士鉴定为平阴玫瑰。RAW264.7 小鼠巨噬细胞系购于中科院上海细胞库。

甲醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、乙酸乙酯，北京化工厂；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），北京迈瑞达科技有限公司；盐酸，赛默飞世尔科技公司；AB-8 型大孔树脂，上海源叶生物科技有限公司；Sepacore 12 g C18 快速色谱柱，瑞士BUCHI仪器公司；DMEM 培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、谷氨酰胺，德国GIBCO 公司；磷酸缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS），德国Hy-Clone 公司；一氧化氮检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）、大肠杆菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2'，7' -dichlorofluorodiacetate，DCFHDA），美国Sigma 试剂公司；十二烷基硫酸钠（Sodium lauryl sulfate，SDS），上海麦克林生化科技有限公司；TransZol Up 裂解液、RT-PCR 试剂盒，全式金生物技术有限公司。晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs），北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ600Y 精密电子天平，美国双杰公司；ACQUITY 超高效液相色谱-质谱联用仪，美国WATERS 公司；Q5000 紫外可见分光光度计，美国QUAWELL 公司；Infinite M2000PRO 多功能酶标仪，瑞士TECAN 公司；CFX96 Touch 实时荧光定量PCR 仪，美国伯乐公司；9700 型PCR 扩增仪，美国ABI 公司；CKX31 倒置生物显微镜，奥林巴斯公司；BSA124S-CW 分析天平，德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；NU-4750E CO2 细胞培养箱，美国NUSIRE 公司；V-700 真空泵、R210 旋转蒸发仪、C-620 中压制备色谱层析仪，瑞士BUCHI 仪器公司；HH-2 恒温水浴锅，至翔科教仪器；Alpha 2-4 LD plus 冷冻干燥机，德国CHRIST冻干机有限公司；Sigma 1-14K 小型台式冷冻离心机，德国SIGMA 公司；DL-S105 迷你涡旋混合器，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；MINI Q 迷你掌上离心机，北京五洲东方科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰花色苷的提取本试验选用新鲜的平阴玫瑰花，仅摘取花瓣，准确称量100.0 g，以体积分数为0.1%的盐酸甲醇溶液为浸提液，料液比1∶10（g/L），50 ℃下避光水浴2 h。用BUCHI V-700真空泵抽滤，得到花色苷提取液，然后用BUCHI R210 旋转蒸发仪对提取液进行旋蒸浓缩，得到花色苷粗提液。

1.3.2 玫瑰花色苷的纯化花色苷粗提液经AB-8 大孔吸附树脂吸附后用纯甲醇洗脱，收集花色苷组分，40 ℃下减压旋蒸浓缩后，与乙酸乙酯按1∶2 比例萃取12 h，萃取2 次。收集萃取后的溶液，用Alpha 2-4 LD plus 冷冻干燥机冻干，得到初步纯化后的花色苷粉末。

将花色苷粉末溶于甲醇，使用BUCHI C-620中压制备色谱层析仪进一步纯化。色谱柱为Sepacore C18 闪柱，流动相A 为纯水、B 为甲醇。梯度洗脱：1 min-5% B；5 min-5% B；6 min-15%B；9 min-15% B；10 min-50% B；15 min-50% B。流速10 mL/min，检测波长520 nm。

根据色谱峰收集花色苷洗脱液并合并，40 ℃下减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，所得花色苷样品用于结构分析和细胞实验。

1.3.3 玫瑰花色苷的成分鉴定使用Waters ACQUITY UPLC-ESI-MS，鉴定平阴玫瑰花色苷成分。色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。流动相A 为含0.1%甲酸水溶液，B 为甲醇。梯度洗脱程序如下：5% B，0～2 min；5%～30% B，2～8 min；30%～90% B，8～10 min；90%～5% B，10～12 min。流动相流速为0.4 mL/min，进样量5 μL。PDA 检测器在280 及520 nm 处监测。

质谱使用ESI 正离子模式，主要参数如下：毛细管电压3.50 kV，锥孔电压20 V，锥孔气流量60 L/h，干燥气流速1 000 L/h，温度500 ℃，全扫描模式，扫描范围50～1 700 m/z。

1.3.4 细胞培养 RAW264.7 小鼠巨噬细胞系培养于含10%（体积分数）FBS，1%（体积分数）丙酮酸钠和1%（体积分数）谷氨酰胺的DMEM 高糖完全培养基中，在37 ℃，5% CO2 湿化气氛下置于细胞培养箱培养，当细胞铺满培养瓶底部80%（体积分数）时进行传代，将培养至对数生长期的细胞用于后续试验。

1.3.5 细胞活力检测采用MTT 法检测平阴玫瑰花色苷、AGEs 及4-HNE 对RAW264.7 细胞活力的影响。采用DMEM 高糖完全培养基将RAW264.7 细胞调整为1×106 cells/mL 的细胞悬液，加入到96 孔板中，每孔100 μL，置于细胞培养箱中孵育，至细胞汇合度达到80%以上，即可用于细胞活力检测。

移除96 孔板孔中培养基，加入用PBS（pH 7.0）配制的不同浓度的花色苷、AGEs 及4-HNE溶液孵育，空白对照组加入100 μL DMEM 高糖完全培养基，在培养箱中孵育24 h。孵育结束后，移除培养基，每孔加100 μL DMEM 高糖完全培养基和10 μL MTT，继续孵育4 h，然后加入100 μL SDS 溶液，继续孵育12 h。取出96 孔板，用Infinite M2000 PRO 多功能酶标仪在570 nm 处测量每孔吸光度，计算细胞活力。

1.3.6 活性氧ROS 检测采用1.3.5 节方法将RAW264.7 细胞在96 孔板中孵育至汇合度80%以上，加入不同浓度的花色苷溶液，分别与LPS、AGEs、4-HNE 共同孵育。24 h 后，每孔加10 μmol/L 的DCFH-DA 100 μL，继续孵育30 min，PBS 洗3 次去除游离DCFH-DA，再加100 μL DMEM 高糖完全培养基，最后采用Infinite M2000PRO 多功能酶标仪测量荧光强度（激发波长485 nm，发射波长530 nm）。

1.3.7 NO 含量测定采用1.3.5 节方法将RAW264.7 细胞在96 孔板中孵育至汇合度80%以上，加入不同浓度的花色苷溶液，分别与LPS、AGEs、4-HNE 共同孵育24 h。吸取96 孔板培养基上清，按照NO 检测试剂盒（南京建成）说明要求，处理细胞上清液，用Infinite M2000PRO 多功能酶标仪在550 nm 处测定吸光度，计算细胞上清液中NO 浓度。

1.3.8 炎症因子表达水平的定量

1.3.8.1 总RNA 的提取将RAW264.7 巨噬细胞铺于10 cm2 培养皿中，细胞浓度1×106 cells/mL，每皿4 mL，培养18 h 达到对数期后，加入不同浓度的花色苷溶液，再分别加入LPS、AGEs、4-HNE共同孵育24 h，然后每皿加入1 mL Trizol 裂解液，静置至细胞脱落，加入200 μL 氯仿，颠倒混匀，室温静置5 min；4 ℃，10 000×g 离心15 min；吸取上层无色溶液400 μL，加等量无水乙醇，颠倒混匀；按全式金RNA 提取试剂盒说明纯化RNA，加入50 μL 无RNA 酶水，静置1 min 后12 000×g 离心1 min 得到RNA 溶液，在Q5000 紫外可见分光光度计上测定RNA 浓度。

1.3.8.2 逆转录取1.0 μg RNA，65 ℃预变性5 min；加入4×DN Master Mix 2 μL，补加无RNA酶水至总体积8 μL，37 ℃反应5 min；加入5×MixⅡ2 μL，按设定程序（37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min），在9700 型PCR 扩增仪上进行反应，获得的cDNA 在-20 ℃下保存备用。

1.3.8.3 PCR 引物的设计根据基因库（Genbank）上发表的RAW264.7 细胞的炎症因子基因序列进行引物设计，设计后的引物送至华大基因公司合成，见表1。

表1 RAW264.7 巨噬细胞炎症因子的基因
Table 1 The gene of RAW264.7 macrophage inflammatory cytokine

1.3.8.4 PCR 反应体系在离心管中加入1 μL cDNA 模板，3 μL 无RNA 酶水，5 μL SYBR 染料，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，混匀后用MINI Q 迷你掌上离心机离心，离心后在CFX96 Touch 实时荧光定量PCR 仪上进行反应。PCR 反应程序如下：

第1 阶段：95 ℃，30 s；

第2 阶段：95 ℃，5 s；57 ℃，30 s；40 个循环；

第3 阶段：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。

1.4 数据统计分析

数据采用EXCEL 2017 及SPSS 17.0 软件进行统计分析，结果均以平均值±标准差表示，采用t检验进行显著性分析，用OriginPro 8.5.1 进行绘图，P<0.05 表示差异显著。试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 平阴玫瑰花色苷成分的鉴定结果

100.0 g 平阴玫瑰鲜花花瓣，经0.1%盐酸甲醇溶液浸提、AB-8 大孔吸附树脂吸附、乙酸乙酯萃取纯化、旋蒸浓缩、冷冻干燥后得到花色苷粉末0.64 g，平阴玫瑰花色苷提取率为0.64%。

纯化后的花色苷用UPLC-ESI-MS 进行分析鉴定，根据各色谱峰的紫外吸收光谱、质谱、保留时间等信息，结合文献报道，确定平阴玫瑰提取物中的花色苷成分。下图为平阴玫瑰花色苷的UPLC图谱（图1a）以及各色谱峰对应的质谱图（图1b～1g）。

图1 玫瑰花色苷的UPLC 图谱（a）及质谱分析（b-g）
Fig.1 UPLC spectrum（a）and mass spectrometry analysis（b-g）of rose anthocyanin

如图1 及表2 所示，平阴玫瑰中共鉴定出6种花色苷。峰1、峰3 与峰4 的一级质谱离子[M+H]+为m/z 611，碎片离子为m/z 449 和m/z 287，其中碎片离子m/z 449 是由于失去1 分子葡萄糖或半乳糖[M-162]+得到的，m/z 287 是矢车菊素的相对分子质量（失去2 分子葡萄糖或半乳糖所得），结合文献[18-20]推测峰1、峰3 和峰4 均为矢车菊素-二己糖苷，由于糖苷部分通过质谱无法确定，因此峰1、峰3 和峰4 分别记为矢车菊素-二己糖苷A、矢车菊素-二己糖苷B 和矢车菊素-二己糖苷C。峰2 和峰5 的一级质谱离子[M+H]+为m/z 625，碎片离子为m/z 463 和m/z 301，其中碎片离子m/z 463 是由于失去1 分子葡萄糖或半乳糖[M-162]+得到的，m/z 301 是芍药素的相对分子质量（失去2 分子葡萄糖或半乳糖所得），结合文献[21-22]推测峰2 和峰5 均为芍药素-二己糖苷，分别记为芍药素-二己糖苷A 和芍药素-二己糖苷B。峰6 的一级质谱离子为m/z 771[M+H]+，碎片离子为m/z 609，m/z 463 和m/z 301，其中碎片离子m/z 609 是由于失去1 分子葡萄糖 [M-162]+得到的，m/z 463 是由于失去1 分子芸香糖苷[M-308]+得到的，m/z 301 是芍药素的相对分子质量（失去1 分子己糖和芸香糖苷所得），结合文献[23-24]推测峰6 为芍药素-芸香糖苷-己糖苷。

表2 玫瑰花色苷成分鉴定结果
Table 2 Identification results of rose anthocyanin

2.2 玫瑰花色苷/AGEs/4-HNE 对RAW264.7巨噬细胞活力的影响

采用2.5，5，7.5，10，15，20，25，30 μg/mL 的平阴玫瑰花色苷处理RAW264.7 细胞，研究花色苷对RAW264.7 细胞活力的影响。如图2 所示，当花色苷质量浓度低于7.5 μg/mL 时，细胞活力大于90%，对RAW264.7 细胞活力无显著影响。当花色苷质量浓度大于10 μg/mL 时，细胞活力均显著降低（P<0.05），说明过高浓度花色苷对细胞会产生一定的毒性，从而降低细胞活力。因此，选择1，2.5，5，7.5 μg/mL 花色苷浓度进行后续试验，评价平阴玫瑰花色苷对RAW264.7 细胞的抗炎抗氧化作用。

图2 不同浓度玫瑰花色苷对RAW264.7 细胞活性的影响（P<0.05）
Fig.2 Effects of different concentrations of rose anthocyanin on RAW264.7 cell activity（P<0.05）

2.3 花色苷对LPS 诱导RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响

采用1，2.5，5，7.5 μg/mL 的花色苷浓度与1 μg/mL LPS[25-26]共同处理RAW264.7 细胞，测定花色苷对RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响。如图3a，3b 所示，LPS 刺激后，RAW264.7 细胞释放ROS 和NO 水平显著增加（P<0.05）。ROS 与NO 释放量的增加一定程度上说明了RAW264.7细胞氧化应激水平的增加。与LPS 组相比，花色苷处理可显著降低ROS 水平（P<0.05），花色苷质量浓度为5 μg/mL 时，抑制ROS 释放的作用最强。花色苷抑制细胞NO 生成的效果随花色苷浓度的增加而增加，表现出剂量效应（P<0.05）。

图3 不同浓度玫瑰花色苷对LPS 处理的RAW264.7 细胞ROS（a）、NO（b）及细胞炎症因子IL-1β（c）、IL-6（d）、TNF-α（e）、iNOS（f）的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of rose anthocyanin on ROS（a），NO（b）and inflammatory factors IL-1β（c），IL-6（d），TNF-α（e），iNOS（f）in RAW264.7 cells induced by LPS

细胞炎症因子表达结果如图3c～3f 所示，LPS刺激后，细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS浓度显著增加（P<0.05）。与LPS 组相比，花色苷处理可显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达（P<0.05），并表现出剂量效应。

上述结果说明，花色苷可抑制LPS 诱导的ROS 和NO 的生成及细胞炎症因子的表达，具有一定的抗氧化及抗炎作用。

2.4 AGEs 诱导RAW264.7 细胞炎症的浓度选择

采用10，25，100，200，400，600 μg/mL 的AGEs处理RAW264.7 细胞，研究AGEs 对RAW264.7细胞活力的影响。如图4a 所示，当AGEs 质量浓度低于200 μg/mL 时，细胞活力大于90%，对RAW264.7 细胞活力无显著影响。当AGEs 质量浓度大于400 μg/mL 时，细胞活力显著降低（P<0.05），说明过高浓度AGEs 对细胞会产生一定的毒性，从而降低细胞活力。因此，选择对细胞活力无影响的AGEs 浓度建立炎症模型。从图4b、4c 中可以看出，AGEs 质量浓度为200 μg/mL 时，可以显著增加IL-6、TNF-α 的表达，刺激RAW264.7 细胞产生炎症。因此，选择200 μg/mL AGEs 刺激RAW264.7 细胞产生炎症，并评价平阴玫瑰花色苷对AGEs 诱导RAW264.7 细胞氧化应激和炎症水平的影响。

图4 不同浓度AGEs 对RAW264.7 细胞活性（a）及炎症因子IL-6（b）、TNF-α（c）的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of AGEs on RAW264.7 cell activity（a）and inflammatory factors IL-6（b），TNF-α（c）

2.5 花色苷对AGEs 诱导RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响

采用1，2.5，5，7.5 μg/mL 的花色苷质量浓度与200 μg/mL AGEs 共同处理RAW264.7 细胞，测定花色苷对RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响。如图5a，5b 所示，AGEs 刺激后，RAW264.7细胞释放ROS 和NO 水平显著增加（P<0.05）。与AGEs 组相比，花色苷处理可显著抑制ROS 的生成（P<0.05），并表现出剂量效应。但花色苷抑制NO 生成的效果不显著，花色苷质量浓度为7.5 μg/mL 时，具有一定抑制NO 生成的作用。有理由推测，花色苷主要通过降低ROS 的生成抑制AGEs 诱导的RAW264.7 细胞氧化应激。

图5 不同浓度玫瑰花色苷对AGEs 处理的RAW264.7 细胞ROS（a）、NO（b）及细胞炎症因子IL-1β（c）、IL-6（d）、TNF-α（e）、iNOS（f）的影响
Fig.5 Effects of different concentrations of rose anthocyanin on ROS（a），NO（b）and inflammatory factors IL-1β（c），IL-6（d），TNF-α（e），iNOS（f）in RAW264.7 cells induced by AGEs

细胞炎症因子表达结果如图5c～5f 所示，AGEs 刺激后，细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 浓度显著增加（P<0.05）。与AGEs 相比，花色苷处理可显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达（P<0.05），并表现出剂量效应。

上述结果说明，花色苷可抑制AGEs 诱导的ROS、NO 生成及细胞炎症因子的表达，具有一定的抗氧化及抗炎作用。

2.6 4-HNE 诱导RAW264.7 细胞炎症的浓度选择

采用1，5，10，15，20，40，80 μg/mL 的4-HNE处理RAW264.7 细胞，研究4-HNE 对RAW264.7细胞活力的影响。如图6a 所示，当4-HNE 质量浓度低于20 μg/mL 时，细胞活力大于90%，对RAW264.7 细胞活力无显著影响。当4-HNE 质量浓度大于40 μg/mL 时，细胞活力均显著降低（P<0.05），说明过高浓度4-HNE 对细胞会产生一定的毒性，从而降低细胞活力。因此，选择对细胞活力无影响的4-HNE 浓度建立炎症模型。从图6b，6c 中可以看出，4-HNE 质量浓度为10 μg/mL 时，可以显著增加IL-1β、IL-6 的表达，刺激RAW264.7 细胞产生炎症。因此，选择10 μg/mL 4-HNE 刺激RAW264.7 细胞产生炎症，并评价平阴玫瑰花色苷对4-HNE 诱导RAW264.7 细胞氧化应激和炎症水平的影响。

图6 不同浓度4-HNE 对RAW264.7 细胞活性（a）及炎症因子IL-1β（b）、IL-6（c）的影响
Fig.6 Effects of different concentrations of 4-HNE on RAW264.7 cell activity（a）and inflammatory factors IL-1β（b），IL-6（c）

2.7 花色苷对4-HNE 诱导的RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响

采用1，2.5，5，7.5 μg/mL 的花色苷质量浓度与10 μg/mL 4-HNE 共同处理RAW264.7 细胞，测定花色苷对RAW264.7 细胞氧化应激及炎症水平的影响。如图7a 所示，4-HNE 刺激后，RAW264.7 细胞释放ROS 水平显著增加（P<0.05）。与4-HNE 组相比，花色苷处理可显著抑制ROS 的生成（P<0.05），并表现出剂量效应。有理由推测，花色苷主要通过降低ROS 的生成抑制4-HNE诱导的RAW264.7 细胞氧化应激。

图7 不同浓度玫瑰花色苷对4-HNE 处理的RAW264.7 细胞ROS（a）及细胞炎症因子IL-1β（b）、IL-6（c）、TNF-α（d）、iNOS（e）的影响
Fig.7 Effects of different concentrations of rose anthocyanin on ROS（a）and inflammatory factors IL-1β（b），IL-6（c），TNF-α（d），iNOS（e）in RAW264.7 cells induced by 4-HNE

细胞炎症因子表达结果如图7b～7e 所示，4-HNE 刺激后，细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 浓度显著增加（P<0.05）。与4-HNE 组相比，花色苷对IL-1β 的抑制效果不明显，但花色苷处理可显著降低IL-6、TNF-α、iNOS 的表达（P<0.05），并表现出剂量效应。

上述结果说明，花色苷可抑制4-HNE 诱导的ROS 生成及细胞炎症因子IL-6、TNF-α、iNOS 的表达，具有一定的抗氧化及抗炎作用。

3 讨论

花色苷具有良好的抗氧化和抗炎作用，广泛存在于植物的花瓣、果实等器官中，本试验采用的平阴玫瑰是我国特有的玫瑰资源，花瓣中含有丰富的花色苷组分。本研究采用有机试剂法提取平阴玫瑰中的花色苷组分，通过大孔树脂层析，乙酸乙酯萃取和中压柱层析进行纯化，UPLC 结合ESI/MS 分析鉴定，得到平阴玫瑰花色苷主要含有2 种苷元（矢车菊素和芍药色素），6 种花色苷（3 种矢车菊素-二己糖苷、两种芍药素-二己糖苷及芍药素-芸香糖-己糖苷）。在此基础上，评价平阴玫瑰花色苷对3 种食品和人体内常见的炎症刺激物（LPS、AGEs、4-HNE）诱导RAW264.7 细胞氧化应激和炎症水平影响的差异。

本研究显示，不同炎症刺激物诱导细胞氧化应激的方式不同，而平阴玫瑰花色苷抑制氧化应激的途径也不同。LPS 和AGEs 可通过刺激ROS和NO 生成诱导细胞氧化应激，但4-HNE 仅刺激ROS 生成诱导细胞氧化应激，不影响NO 的释放。花色苷可抑制LPS 诱导的ROS 和NO 的生成，但主要通过降低ROS 的生成抑制AGEs 和4-HNE诱导的RAW264.7 细胞氧化应激，且呈剂量依赖效应。3 种炎症刺激物LPS、AGEs 和4-HNE 均可通过刺激炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达诱导RAW264.7 细胞炎症反应，而平阴玫瑰花色苷抑制细胞炎症的作用效果也不同。花色苷可显著抑制LPS、AGEs 诱导的细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达，可抑制4-HNE 诱导的细胞炎症因子IL-6、TNF-α、iNOS 的表达，且呈剂量依赖效应。因此，有理由推测平阴玫瑰花色苷对LPS、AGEs 诱导细胞氧化应激和炎症水平的抑制效果优于4-HNE。目前，关于花色苷抑制LPS诱导细胞炎症的报道较多，Li等[27]从红树莓中提取花色苷并评估其对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症的作用，发现花色苷可以显著抑制NO 生成和IL-1β、IL-6 的表达，抑制细胞炎症。Xu等[28]发现从蓝莓中提取的花色苷可以显著抑制LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎症反应，降低NO 的产生，抑制细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达。但是还未见有花色苷对于AGEs 和4-HNE 诱导细胞炎症作用的相关报道。结合本研究结果，可见花色苷对于不同炎症刺激物诱导细胞炎症的抑制途径不同，打破了人们采用LPS 构建细胞炎症模型的局限性。

综上所述，平阴玫瑰花色苷可有效抑制LPS、AGEs、4-HNE 诱导RAW264.7 巨噬细胞ROS、NO的释放及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 的表达，发挥抗炎抗氧化作用，但对于不同炎症刺激物，花色苷的抗炎及抗氧化作用不完全一样，其具体的抗炎抗氧化机制还有待进一步研究。

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