首页 > 分享 > 一种棉花主要病原真菌ITS

一种棉花主要病原真菌ITS

花匠小妙招
2024-11-23 10:37

技术领域

本发明涉及植物病理学领域，具体地，本发明涉及一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法。

背景技术

棉花是世界性重要的经济作物和纺织工业原料，也是关系国计民生的重要物资。长期以来，棉花病虫害的普遍发生始终是制约棉花高产的瓶颈问题，其中最为严重的当属黄萎病和枯萎病，其次为铃病和苗病，多为真菌病害。为了更加科学制定合理的防控措施，对病害种类的确认是最为必要的前提，因此快速准确鉴定病原菌就显得尤为重要。

棉花病原真菌传统的鉴定是以形态学、细胞学、生理学和生态学等特征为根据的，但是由于很多真菌生物学性状极其相似，因此，要求科研工作者具有丰富的实践经验，同时，传统的鉴定还较为费时、费力。随着分子生物学的发展，核糖体内部转录间隔区(Internaltranscribedspacer，ITS)扩增、克隆测序，大大提高了病原真菌鉴定的准确性，但仍存在实验周期较长，成本较高的问题。完成ITS克隆、测序、比对一系列程序需要大约一周，且一个样品的鉴定费用大约是40元。

虽然采用ITS-RFLP方法鉴定病原真菌已经有文献进行报道，由于棉花病原真菌基因上的相似性，存在严重的相互干扰，因此如何针对棉花病原真菌的特点，选择合适的引物以及内切酶来提高鉴定的准确性仍然是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，快速而又准确的鉴定棉花病原真菌的种类，为病害的有效防控提供依据。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2-4％的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱；

随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’：

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’：

扩增产物使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。

其特征在于包括下述步骤：

表1棉花主要病害和病原真菌列表

在本发明的一个优选实施方式中，所述的鉴定步骤包括如下步骤：

1)DNA的提取：将分离纯化的棉花病原真菌接种至PDA培养基，28℃恒温静置培养，收集菌丝，收集棉花病原真菌的菌丝，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH2O溶解基因组DNA

2)PCR扩增：以上述病原真菌的基因组DNA为模板，采用引物对ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS55’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’进行PCR扩增。20μl的PCR反应体系：包括10×PCRbuffer(Mg2+)2μl，浓度为10mM的dNTP溶液1.6μl，浓度为10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因组DNA1μl，浓度为5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH2O。扩增反应程序为：94℃预变性2min，之后，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环，最后72℃延伸10min，得到ITS的PCR产物，产物大小范围为500-750bp。

3)酶切反应：任意使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对ITS的PCR产物酶切。10μl的酶切体系：ITS模板6μl，10×内切酶buffer1μl，内切酶0.5μl、ddH2O2.5μl。反应条件为：PCR仪中37℃保温1h，加入2μl的6×loadingbuffer终止反应，3％琼脂糖凝胶电泳恒压75V，2小时，在紫外灯下观察拍照，获得ITS-RFLP带谱；

4)带谱鉴别：将上述获得的ITS-RFLP带谱和标准电子酶切图谱比对，首先比对HhaI和Sau3A对应的大小和电子图谱(如表2和图3)，以粉红单端孢(Tr)为例，用HhaI酶切后，如果出现四条泳带，且最大为295bp，最小为23bp，则说明是Tr，与此同时结合Sau3A的酶切结果，显示出有两条泳带，分别是396bp和190bp，就进一步确认待鉴定菌株为粉红单端孢。本发明提供了6种棉花病原真菌的4种常用内切酶的带谱对比表和电子图谱，以便实现准确鉴定的目的。

表2棉花病原菌ITS-RFLP带谱对比表(bp)

本发明的有益效果主要体现在以下三个方面：

1、操作流程简单，可操作性强，不要求鉴定者拥有丰富的经验，鉴定周期短，可以快速鉴定棉花病原真菌。

1)基因组DNA提取速度快。本发明采用的是CTAB-NaCl方法抽提DNA，由于下游实验ITS-PCR反应的灵敏度高，因此对模板DNA纯度要求低，对裂解液中的蛋白和多糖杂质只需要用有机溶剂抽提一次，然后用冰冷无水乙醇沉淀，无需对沉淀洗涤，干燥后直接加入ddH2O，1个半小时即可完成DNA抽提。

2)ITS引物选择科学。本发明所选择的ITS4源于真菌核糖体的28S保守区段，ITS5则位于18S，扩增产物包括两个完整的内部转录间隔区(ITS)，在种属各异的可变区段上，不同限制性内切酶的识别位点均不相同，使得ITS-RFLP的结果更为可信。

3)PCR扩增ITS效率高。本发明中ITS扩增的反应程序简单，由于ITS序列较短，都在720bp以下，如步骤3)中所示延伸时间40s即可，共计25个循环，可以在1小时之内完成病原真菌的ITS扩增。

4)ITS-RFLP方法新颖且快速。棉花病原真菌的ITS扩增产物无需纯化回收，用本发明所列出的四个限制性内切酶中的任意组合直接酶切ITS，将酶切带谱和标准带谱对比表和电子酶切图谱进行比对，就可鉴定出病原真菌的种类。

综上所述，棉花病原真菌种类的鉴定工作，可以在5-6小时完成，和传统的形态学鉴定和ITS克隆测序相比大大缩短了鉴定周期，更加快捷方便。

2、棉花病原真菌的鉴定准确，假阳性率低。本发明从9种四碱基限制性内切酶中，筛选得到了4个对6种棉花主要病原菌酶切图谱各异的内切酶HhaI、HaelII、TaqI、Sau3A，并制作了标准ITS-RFLP的带谱对比表和电子酶切图谱，大小精确，图谱清晰。鉴定者可以根据自己的实际情况任意选择以上四种限制性内切酶或者其组合，比对标准图谱，可以准确鉴定棉花病原菌的类别。

3、成本低廉。本发明不使用任何商业试剂盒和委托测序服务，涉及到都是常规的分子试剂，一个样品的鉴定花费5元左右，支出费用远低于40元／样品的克隆测序鉴定病原菌的方法。

附图说明

图1显示6种棉花病原真菌基因组DNA提取电泳图

图2显示6种棉花病原真菌ITS扩增电泳图

图3显示四种限制性内切酶的ITS-RFLP的标准电子图谱

具体实施方式

实施例1棉花病原真菌基因组DNA的提取

1)从PDA固体培养基上刮取50-100mg的新鲜菌丝，放于1.5ml离心管中，加入200μl预热的DNA提取缓冲液[配方：50mmol／LHris-HCl(pH=7.5)，50mmol／LEDTA(pH=8.0)，1.4mol／LNacl、20g/LCTAB]，用微型研磨棒磨碎，然后再加入450μl的提取缓冲液，65℃水浴30min，每10min反转一次；

2)加入等体积的1：1饱和酚和氯仿，上下颠倒充分混匀，室温下12000g离心15min；

3)小心移取上清液于新的1.5ml离心管中，加入等体积的冰冷无水乙醇沉淀，室温放置10min，12000g离心10min收集沉淀，弃上清，37℃烘箱烘干；

4)加入30μl的ddH2O溶解基因组DNA，置于-20℃冰箱备用。

5)电泳检测，取2μl的基因组DNA连同1μl的6×loadingbuffer点样至0.8％的琼脂糖凝胶上，200V恒压电泳15min，见图1。

实施例2棉花病原真菌ITS扩增

1)扩增反应体系：以上述病原真菌的基因组DNA为模板，采用引物对ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS55’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’进行PCR扩增。20μl的PCR反应体系：包括10×PCRbuffer(Mg2+)2μl，浓度为10mM的dNTP溶液1.6μl，浓度为10uM引物ITS4／ITS5各1μl，基因组DNA1μl，浓度为5U／μl的Taq酶0.2μl，以及13.2μl的ddH2O。

2)扩增反应程序为：94℃预变性2min，之后，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环，最后72℃延伸10min，得到内部转录间隔区的PCR产物。

3)电泳检测，取5μl的ITS的PCR产物，混合1μl的6×loadingbuffer点样至0.8％的琼脂糖凝胶上，200V恒压电泳10min，大小范围为500-750bp，见图2。

实施例3限制性内切酶的选择

筛选合适的四碱基限制性内切酶的。根据6种棉花病原真菌的ITS序列测定结果，逐个分析9种四碱基限制性内切酶(AccII、AfaI、AluI、HaeIII、HhaI、Sau3A、MspI、TaqI和XspI)在不同ITS上的识别位点，计算产物长度，充分考虑多态性和真菌种类特异性等特点，最终选择了4种常见的内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A。

实施例4棉花病原真菌ITS-RFLP带谱对比表和电子图谱的制作

1)ITS-RFLP带谱对比表制作。以6种棉花病原真菌的ITS序列为主要依据，利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，根据酶切产物片段大小制作ITS-RFLP带谱对比表(表2)。

2)ITS-RFLP电子图谱的制作。结合pDRAW32软件，对四种限制性内切酶酶切产物分布情况进行分析，并绘制出3％的琼脂糖电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱，见图3。

采用本发明的方法鉴定58个样品，经过ITS克隆测序的方法验证结果，结果显示本发明的方法准确性在94％以上，而平均检测时间仅为5.5个小时，成本为5元／样品，可见本发明的方法具有准确性高，成本低的优势，适合大规模使用。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。