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一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-23 10:37

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1、(10)申请公布号 CN 102559923 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102559923 A *CN102559923A* (21)申请号 201210073698.0 (22)申请日 2012.03.20 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/77(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人南京农业大学地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人陈发棣宋爱萍蒋甲福陈素梅李会云陈思思房伟民管志勇 (74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任。

2、公司 32218 代理人徐冬涛 (54) 发明名称一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法 (57) 摘要本发明属于植物病原菌的分子生物学检测领域，公开了一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法。该方法包括： (1)植物病样制备； (2)聚合酶链式反应 (PCR)、电泳检测及片段纯化； (3) 测序及结果比对确定病原菌种类。本方法突破了传统的植物真菌病害鉴定周期长、专业性强等局限性，提供的检测方法可在 6 小时内即可完成检测与鉴定菊花真菌病害，检测广谱性强，灵敏度高，工序简单。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页序列表 2 。

3、页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页序列表 2 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 植物病样制备：用蒸馏水冲洗干净待检病样品，从其中取一块 5mm5mm 左右大小的病害组织，置于2ml离心管中，加入无菌水200l，剧烈震荡10s，其溶液作为步骤(2)PCR 反应中的模板； (2)PCR、电泳检测、片段纯化及测序：取步骤(1)离心管中的溶液作为模板，进行PCR反应，引物分别为： ITS-F ： SE。

4、Q ID NO.1， ITS-R ： SEQ ID NO.2 ； PCR 反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后，采用Biospin Gel Extraction kit试剂盒进行切胶纯化回收，将回收产物上 ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer 测序仪测序，测序引物分别为： SEQ-F ： SEQ ID NO.3， SEQ-R ： SEQ ID NO.4 ； (3) 测序结果比对确定病原菌种类：将测序结果在美国国立生物技术信息中心上进行 BLAST 比对，从而确定导致菊花真菌病害的病原菌种类。 2. 根据权利要求 1 所述的一种快速鉴定菊花真菌病。

5、害病原菌种类的方法，其特征在于：步骤 (1) 所述的待检病样品为待检菊花的叶片、茎或根部。 3. 根据权利要求 1 所述的一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，其特征在于：步骤 (2) 所述 PCR 反应体系共 50l，包括： 25l 2MightAmp Buffer Ver.2， 1l MightAmpDNA Polymerase， 1l 上游引物 ITS-F， 1l 下游引物 ITS-R， 1l 步骤 (1) 离心管中的溶液作为模板，加灭菌水补足至 50l。 4. 根据权利要求 1 所述的一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，其特征在于：步骤 (2。

6、) 所述 PCR 反应程序设定为 98预变性 2min， 98变性 10s， 55退火 30s， 72 延伸 1min，循环 30 35 次， 72延伸 7min。 5. 根据权利要求 1 所述的一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，其特征在于：步骤(3)将测序结果在美国国立生物技术信息中心上进行BLAST比对，与所测序列最接近的且相似率达 98以上的即为导致该菊花真菌病害的病原菌种类。权利要求书 CN 102559923 A 2 1/4 页 3 一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法技术领域 0001 本发明属于植物病原菌的分子生物学检测领域，涉及一种快速鉴。

7、定菊花真菌病害病原菌种类的方法背景技术 0002 菊花 (Dendranthema morifolium Tzvel.(Chrysanthemum morifolium Ramat.) 为菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花，世界上最早栽培的观赏植物之一，具有很高的经济和观赏价值，在花卉产业中占据重要的地位。菊花在移栽、扦插、以及种植过程中易感染真菌病害，其中以菊花黑斑病和枯萎病最为普遍，本专利将以这两种菊花真菌病害为例。菊花黑斑病症状为：发病初，叶片出现大小不等的浅黄和褐色斑，逐渐发展成边缘黑褐色、中间灰黑色的近圆形不规则斑块，后期病斑上长出黑。

8、色小点，严重时病斑相连，叶片发黑焦枯乃至脱落，病株从下部叶片开始顺次向上枯死至全株。菊花枯萎病症状为：发病初时叶色变浅发黄，萎蔫下垂，茎部、枝条、根部逐渐变成淡褐色直至变黑腐烂坏死，湿度大时病部产生白霉。 0003 以往检测植物真菌病害病原菌主要有形态学观察法、酶联免疫法、基因芯片法、质谱技术等。常规直接或培养后镜检的形态学鉴定来发现和确认病原菌，其操作繁琐、费时、并且需要高度的专业知识。尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难，许多时候只能鉴定到属这一级别。酶联免疫法在国外已经形成商品化生产，。

9、但是每种病原菌都需要特异的酶标记抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，且存在假阴性和假阳性问题。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但只局限于已知的常见病原真菌，对非常见菌、突变菌或者新菌种则无能为力，且成本过高。质谱技术在微生物鉴定中具有快速准确的优点，但由于质谱鉴定必须是纯化培养的单克隆菌落，操作复杂且所需的专业技术要求较高，设备购置和维护费高昂。 0004 随着分子生物学手段的发展与应用，利用真菌核糖体 DNA 上的内部转录间隔区 (ITS) 进行真菌种类鉴定已经得到广泛认可。但现有方法利用 ITS 序列对病原真菌进行鉴定前，须先经过纯菌株的分。

10、离纯化，真菌 DNA 的提取， PCR 扩增以及亚克隆等一系列繁琐的过程。这种方法存在如下缺点： (1)至少需要7天时间，费时费力； (2)对目前无法培养或难培养的真菌很难进一步鉴定和分析； (3) 分离和培养单胞存在较高的技术难度； (4) 繁琐的真菌 DNA 提取步骤； (5)PCR 扩增片段需要经过连接、转化、质粒提取等步骤后才能测序。这些缺点极大地限制了田间病原菌的快速鉴定，贻误了病情。目前，大量的真菌病害导致了菊花观赏品质下降，造成了巨大的经济损失。发明内容 0005 发明目的：本发明的目的是提供一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，。

11、能够快速鉴定菊花真菌病害的病原菌种类。 0006 技术方案：为实现上述目的，本发明的快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，说明书 CN 102559923 A 3 2/4 页 4 包括如下步骤： 0007 (1)植物病样制备：用蒸馏水冲洗干净待检病样品(叶片、茎或根部)，从其中取一块 5mm5mm 左右大小的病害组织，置于 2ml 离心管中，加入无菌水 200l，剧烈震荡 10s，其溶液作为步骤 (2)PCR 反应中的模板； 0008 (2)PCR、电泳检测、片段纯化及测序：取步骤 (1) 离心管中的溶液作为模板，进行 PCR 反应，引物分别为：。

12、 ITS-F ： 5 -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (SEQ ID NO.1)， ITS-R ： 5 -TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 (SEQ ID NO.2) ； PCR 反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后，采用Biospin Gel Extraction kit(BioFlux)试剂盒进行切胶纯化回收，将回收产物上 ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer 测序仪测序，测序引物分别为： SEQ-F ： 5 -GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (SEQ ID NO.3)， SEQ-。

13、R ： 5 -GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 ( SEQ ID NO.4) ； 0009 (3) 测序结果比对确定病原菌种类：将测序结果在美国国立生物技术信息中心 (NCBI) 上进行 BLAST 比对，从而确定导致菊花真菌病害的病原菌种类。 0010 步骤 (2) 所述 PCR 反应体系 50l 中包括 25l 2MightAmp Buffer Ver.2， 1lMightAmp DNA Polymerase(TaKaRa)， 1l上游引物ITS-F， 1l下游引物ITS-R， 1l 步骤 (1) 离心管中的溶液作为模板，加灭菌水补足至 50l。 0011 步骤(2。

14、)所述PCR反应设定为98预变性2min， 98变性10s， 55退火30s， 72 延伸 1min，循环 30 35 次， 72延伸 7min。 0012 步骤 (3) 所述的测序结果比对确定病原菌种类为：将测序结果在 NCBI 上进行 BLAST 比对，与所测序列最接近的且相似率达 98以上的即为导致该菊花真菌病害的病原菌种类。 0013 有益效果：本发明通过比对真菌和菊花ITS序列，设计了只能扩增出真菌ITS序列的引物，采用极高 PCR 反应性能的 MightyAmp DNA Polymerase 扩增菊花病原真菌的 ITS 序列，产物纯化后直接测序，通过 BL。

15、AST 在线比对，能在较短时间内对其进行分类和鉴定。相对于之前的 PCR 鉴定植物病原真菌的方法 ( 至少需要 7 天时间 )，省去了纯菌株的分离纯化、真菌 DNA 的提取以及亚克隆等繁琐过程，减少了技术难度，省力省时，还能鉴定出不可培养或难培养的真菌，大大提高了鉴定的效率和范围。 0014 本发明提供了一种快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法，能在 6 小时内鉴定出病原菌种类，为有针对性地开展菊花真菌病害的防治，及时解决菊花的真菌病害问题提供了强有力的技术支持，推动菊花产业的发展。附图说明 0015 图 1 为实施例 1 中病叶样本图 0016 图 2 为实。

16、施例 2 中病根样本图 0017 图 3 为实施例 1 中 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图 0018 图 4 为实施例 2 中 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图 0019 图 5 本发明快速鉴定菊花真菌病害病原菌种类的方法流程图。具体实施方式说明书 CN 102559923 A 4 3/4 页 5 0020 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。 0021 实施例 1 0022 取田间表现叶片发黄、发黑的菊花植株为材料 ( 如图 1 所示 )，将病叶用蒸馏水冲洗干净，从其中取一块 5mm5mm 左右大小的病害组织，置于 2ml 离心管中，加入无菌水 200l，剧烈震荡 10。

17、s，其溶液作为下一步 PCR 反应中的模板； 0023 PCR 反应所用上下游引物分别为： 0024 ITS-F ： 5 -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (SEQ ID NO.1)， 0025 ITS-R ： 5 -TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 (SEQ ID NO.2)。 0026 PCR 反应体系 50l 中包括 25l 2MightAmp Buffer Ver.2， 1l MightAmp DNAPolymerase(TaKaRa)， 1l 上游引物 ITS-F， 1l 下游引物 ITS-R， 1l 步骤 (1) 离心管中的溶液。

18、作为模板，加灭菌水补足至 50l。PCR 反应设定为 98预变性 2min， 98变性 10s， 55退火 30s， 72延伸 1min，循环 30 35 次， 72延伸 7min。 0027 PCR 反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后 ( 如图 3 所示 )，采用 Biospin GelExtraction kit(BioFlux) 试剂盒进行切胶纯化回收。将回收产物上 ABI PRISM 3730XL DNAAnalyzer 测序仪测序，测序引物分别为： SEQ-F， SEQ-R ； 0028 SEQ-F ： 5 -GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (。

19、SEQ ID NO.3)， 0029 SEQ-R ： 5 -GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 (SEQ ID NO.4)。 0030 将测序结果在 NCBI 上进行 BLAST 比对，与所测序列最接近的且相似率达 98以上的为链格孢 Alternaria alternata，说明导致该田间菊花黑斑病的病原菌为链格孢 A/ ternariaalternata。 0031 实施例 2 0032 取田间表现叶色变浅发黄，萎蔫下垂，茎部、枝条、根部逐渐变成淡褐色的菊花植株为材料(如图2所示)，将根茎部用蒸馏水冲洗干净，从其中取一块5mm5mm左右大小的病害组织，。

20、置于 2ml 离心管中，加入无菌水 200l，剧烈震荡 10s，其溶液作为下一步 PCR 反应中的模板； 0033 PCR 反应所用上下游引物分别为： 0034 ITS-F ： 5 -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (SEQ ID NO.1)， 0035 ITS-R ： 5 -TCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 (SEQ ID NO.2)。 0036 PCR 反应体系 50l 中包括 25l 2MightAmp Buffer Ver.2， 1l MightAmp DNAPolymerase(TaKaRa)， 1l 上游引物 ITS-F，。

21、1l 下游引物 ITS-R， 1l 步骤 (1) 离心管中的溶液作为模板，加灭菌水补足至 50l。PCR 反应设定为 98预变性 2min， 98变性 10s， 55退火 30s， 72延伸 1min，循环 30 35 次， 72延伸 7min。 0037 PCR 反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增条带后 ( 如图 4 所示 )，采用 Biospin GelExtraction kit(BioFlux) 试剂盒进行切胶纯化回收。将回收产物上 ABI PRISM 3730XL DNAAnalyzer 测序仪测序，测序引物分别为： SEQ-F， SEQ-R ； 0038 SEQ。

22、-F ： 5 -GTCATTTAGAGGAAGTAAAAG-3 (SEQ ID NO.3)， 0039 SEQ-R ： 5 -GCTTATTGATATGCTTAAGTTC-3 (SEQ ID NO.4)。 0040 将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，与所测序列最接近的且相似率达98以上的为尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum，说明导致该田间菊花枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌说明书 CN 102559923 A 5 4/4 页 6 Fusariumoxysporum。说明书 CN 102559923 A 6 1/2 页 7 0001 序列表 CN 102559923 A 7 2/2 页 8 0002 序列表 CN 102559923 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说明书附图 CN 102559923 A 9 2/2 页 10 图 5 说明书附图 CN 102559923 A 10 。