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一种花生果腐病病原菌的致病性鉴定方法.pdf

花匠小妙招
2024-10-30 10:08

说明书一种花生果腐病病原菌的致病性鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种花生果腐病病原菌的致病性鉴定方法，属于花生病原菌致病性鉴定方法技术领域。
背景技术
花生是重要的油料作物和经济作物，近年来花生果腐病, 俗称烂果病，在我国花生产区尤其是北方产区呈连年加重之势。由于花生果长于地下的特殊性，使得花生果腐病的发病不易观测。这对花生果腐病病原菌的鉴定、检测技术提出了挑战。
目前国内外已报道的花生果腐病病原菌主要有Rhizoctonia solani，Pythium myriotylum，Fusarium solani，Sclerotium rolfsii，Cylindrocladium parasiticum和Sclerotinia minor几种真菌。但目前条件下，采用田间及盆栽回接检测方法不仅受花生种植周期的限制，而且检测周期长，且绝大多数病原菌存在土壤回接、扩繁困难的缺陷。因此需要一种方法能够实现对果腐病病原菌的致病性进行随时检测，不受上述条件制约。目前尚无此方面报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生果腐病病原菌的致病性鉴定方法，以克服现有条件下果腐病病原菌田间及盆栽回接检测受花生种植周期限制、且检测周期长的难题。
该方法将易感病品种晒干的花生果和仁分别消毒、冲洗、浸泡后，进行微创处理，置于培养皿中并接入相应病原菌，皿中倒入1/4浓度的相应病原菌培养基，使花生果/仁与病原菌实现共培养。10天后更换一次培养基，之后10-15天观察统计侵染致病情况。该方法能够随时对果腐病病原菌的致病性进行检测，快速简便、稳定性高、重复性好。
本发明还进一步提供了上述花生果腐病病原菌致病性鉴定方法的优选技术方案：
作为优选，所述的病原菌是从花生果腐病病果中分离、纯化获得，经形态学鉴定与分子生物学鉴定后，获知其可能为花生果腐病病原菌。
作为优选，所述的易感病品种为花育38，花育43，中华12号和冀花9号四个品种。单次实验（针对一种菌）每个品种分别需准备150个/粒饱满、健康的果和仁，50个作为一个重复，设置3次重复。
作为优选，所述的消毒、冲洗、浸泡是将花生果和仁分别用75%酒精浸泡10分钟后用1‰生汞浸泡25min和15min完成消毒，用无菌水冲洗3-4次，之后分别用无菌水浸泡36h和5h。将浸泡后的果和仁于超净台中置于无菌滤纸上吸干水分。
作为优选，所述的微创处理是指用无菌手术刀在花生果上划出3-5道10mm左右的划痕，在花生仁上同样划出3-5道5mm左右的划痕，以利于病原菌侵染。
作为优选，所述的接入病原菌是用灭菌牙签挑取2mm左右菌斑抹于微创伤口上，每个果/仁均在两个不同伤口接入菌斑。每个培养皿中分别放10个果/仁。之后在果的培养皿中接入6个5mm的菌斑（打孔法），仁的培养皿中接入4个5mm的菌斑，达到扩繁目的。
作为优选，所述的培养皿，果和仁用的分别是15cm和9cm直径的。提前需要铺好两层无菌滤纸并倒入相应的1/4浓度的病原菌液体培养基，果中培养基深度约5mm，仁中约3mm。
作为优选，所述的暗培养需在培养皿底部垫一层无菌滤纸，以防止移动培养皿时因封口膜粘破而染菌。
作为优选，所述的更换培养基需用消毒棉球擦拭培养皿封口处，之后置于超净台中，拆除封口膜，并倒入相应培养基，并用封口膜封口后再培养。
作为优选，所述的观察统计侵染致病情况包括两方面，一是分别统计病原菌在果和仁上的附着、生长情况，X=A/50×100%，X为侵染率，A为培养皿中附着菌丝/孢子的花生仁/果的个数，50即为花生果/仁的原始个数。统计完3个重复后进行比较分析；另外分别统计果和仁发生褐变的比率，并按褐变程度进行分级，以比较各病原菌的致病力。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：
以从花生果腐病病果中分离、纯化获得的Calonectria sp.（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807）为检测对象，以花育38，花育43，中华12号和冀花9号四个易感品种作为供试材料。
每个品种分别选取150个/粒饱满、健康的果和仁，50个作为一个重复，设置3次重复。将花生果和仁分别用75%酒精浸泡10分钟后用1‰生汞浸泡25min和15min完成消毒，用无菌水冲洗3-4次，之后分别用无菌水浸泡36h和5h。将浸泡后的果和仁于超净台中置于无菌滤纸上吸干水分。用无菌手术刀在花生果上划出3-5道10mm左右的划痕，在花生仁上同样划出3-5道5mm左右的划痕。然后用灭菌牙签挑取2mm左右菌斑抹于微创伤口上，每个果/仁均在两个不同伤口接入菌斑。每个培养皿中分别放10个果/仁。果和仁用的培养皿分别是15cm和9cm直径的，提前需要铺好两层无菌滤纸并倒入1/4浓度的改良察氏液体培养基，果中培养基深度约5mm，仁中约3mm。之后在果的培养皿培养基中接入6个5mm的菌斑（打孔法），仁的培养皿中接入4个5mm的菌斑，达到扩繁目的。用封口膜将培养皿封好口并置于28℃培养箱暗培养，培养皿底部垫一层无菌滤纸以防止因移动培养皿时封口膜粘破而染菌。10天后更换一次培养基，需用消毒棉球擦拭培养皿封口处，之后置于超净台中，拆除封口膜，倒入相应培养基，并用封口膜封口后继续培养，12天后进行观察统计，结果表明，该菌对四个花生品种花生果的侵染率为91-95%，对花生仁的侵染率为96-100%。四个品种果的褐变率为35-41%，仁的褐变率为55-68%。三个重复实验的重复性好，表明了该方法的可靠性与稳定性。
实施例2：
以从花生果腐病病果中分离、纯化获得的Rhizoctonia solani为检测对象，以花育38，花育43，中华12号和冀花9号四个易感品种作为供试材料。
每个品种分别选取150个/粒饱满、健康的果和仁，50个作为一个重复，设置3次重复。将花生果和仁分别用75%酒精浸泡10分钟后用1‰生汞浸泡25min和15min完成消毒，用无菌水冲洗3-4次，之后分别用无菌水浸泡36h和5h。将浸泡后的果和仁于超净台中置于无菌滤纸上吸干水分。用无菌手术刀在花生果上划出3-5道10mm左右的划痕，在花生仁上同样划出3-5道5mm左右的划痕。然后用灭菌牙签挑取2mm左右菌斑抹于微创伤口上，每个果/仁均在两个不同伤口接入菌斑。每个培养皿中分别放10个果/仁。果和仁用的培养皿分别是15cm和9cm直径的，提前需要铺好两层无菌滤纸并倒入1/4浓度的PDA液体培养基，果中培养基深度约5mm，仁中约3mm。之后在果的培养皿培养基中接入6个5mm的菌斑（打孔法），仁的培养皿中接入4个5mm的菌斑，达到扩繁目的。用封口膜将培养皿封好口并置于28℃培养箱暗培养，培养皿底部垫一层无菌滤纸以防止因移动培养皿时封口膜粘破而染菌。10天后更换一次培养基，需用消毒棉球擦拭培养皿封口处，之后置于超净台中，拆除封口膜，倒入相应培养基，并用封口膜封口后继续培养，12天后进行观察统计，结果表明，该菌对四个花生品种花生果的侵染率为87-92%,对花生仁的侵染率为92-100%。四个品种果的褐变率为19-27%，仁的褐变率为30-39%。三个重复实验的重复性好，进一步表明了该方法的可靠性与稳定性。
该发明专利保藏信息如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.9807
分类命名：丽赤壳菌Calonectria sp.
保藏日期：2014年10月20日。