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浅部真菌病菌种鉴定及氮掺杂碳纳米酶联合NIR抗真菌研究

花匠小妙招
2024-11-23 10:38

背景:浅部真菌病是指皮肤、黏膜、毛发和指(趾)甲的真菌感染,主要由皮肤癣菌属和酵母菌属引起,但不同地区、不同季节的菌种分布不同,不同感染部位也有差异。既然不同感染部位菌种可能不同,那么同一患者不同部位感染菌种是否相同?是否是自体传染?近几年来,随着抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的大量使用以及慢性疾病、慢性感染等因素的影响,临床上真菌感染特别是浅部真菌病的发病率逐步呈现上升趋势。同时,也因为耐药真菌的增加,导致治愈浅部真菌病的难度增加。纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料,其抗菌活性是全球研究的热点。碳材料因其良好的生物相容性备受大家的关注,可以通过掺杂其他材料来调节其酶活性,而且碳材料具有良好的光热效应,能够吸收光能转换为热能。已有研究报道碳纳米酶对细菌有抑制作用,但对真菌的研究较少。氮掺杂碳纳米酶(Nitrogen-doped carbon nanozyme,N-Carbon nanozyme)不仅具有多种酶活性,也有光热效应,因此,N-Carbon nanozyme联合近红外光(Near Infrared,NIR)抗真菌的效果值得探讨。目的:分析鉴定临床浅部真菌病的致病菌种及不同部位菌种分布情况,了解同一患者不同感染部位的菌种是否有差异。探讨N-Carbon nanozyme联合NIR对白念珠菌和红色毛癣菌体外抗菌效果,为临床治疗浅部真菌病提供新方法。方法:1.选择2019年4月至2019年10月在扬州大学临床医学院皮肤科门诊拟诊为浅部真菌病患者55例,进行真菌镜检、培养并分离纯化。2.丝状真菌运用氯化苄法提取DNA,利用通用引物扩增ITS1和ITS2区段并进行基因测序,同时以简单重复序列寡核苷酸(GACA)4作为引物,进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)指纹图谱分析;酵母菌属直接采用质谱仪进行分析鉴定。3.采用热解法制备N-Carbon nanozyme,用扫描和透射电镜进行表征观察。4.测定N-Carbon nanozyme在808nm NIR照射下的光热转换效果。5.采用平板计数法,根据菌落形成单位(CFU)的数量来筛选N-Carbon nanozyme联合808nm NIR抗白念珠菌的最适材料浓度和最适光照参数。6.以白念珠菌和红色毛癣菌为研究对象,进行了N-Carbon nanozyme联合808nm NIR体外抗真菌实验,实验分组:(I)空白对照组:真菌不作任何处理;(II)光照组:真菌予以2.5W/cm~2NIR照射8min;(III)材料组:真菌予以250μg/ml的N-Carbon nanozyme处理30min;(IV)实验组:真菌予以250μg/ml的N-Carbon nanozyme及2.5W/cm~2NIR照射8min处理。7.抗真菌活性观察采用SYTO9/PI死活染色来观察,对白念珠菌抗菌活性研究还采用了扫描电镜观察形态以及平板计数法,根据菌落形成单位(CFU)的数量来判定。结果:1.55例浅部真菌病患者,包括股癣25例(33.3%),足癣21例(28%),体癣14例(18.7%),甲真菌病12例(16%)和手癣3例(4%)。镜检阳性63例(84%),分离培养出真菌71例(94.7%)。其中20例发生身体两部位感染。2.丝状真菌经ITS1及ITS2区段扩增后进行测序,其中红色毛癣菌63株,犬小孢子菌5株;酵母菌属经质谱仪鉴定后,测得白念珠菌1株,近平滑念珠菌1株及无名酵母菌1株。20例两部位感染患者中,18例患者为同一菌种感染,且为红色毛癣菌。指纹图谱中,犬小孢子菌条带均含有800kb、1200kb的条带,红色毛癣菌均含有600kb、950kb、1050kb的条带。3.N-Carbon nanozyme在NIR照射下,能将光能转换为热能,其光热转换率具有浓度依赖性,并与功率的强度呈正相关。4.通过平板法计数菌落形成单位(CFU)的结果,将反应条件设置为:N-Carbon nanozyme 250μg/ml;NIR 2.5W/cm~2,8min。5.体外抗白念珠菌实验中,光照组、材料组与空白对照组间未见明显差异。而白念珠菌的实验组,通过平板计数法可观察到,至少99.9%的白念珠菌被杀灭;SYTO9/PI死活染色也证明了这一点,绝大多数白念珠菌均显示为红色荧光;且生物扫描电镜显示白念珠菌的细胞形态发生明显的变化。6.体外抗红色毛癣菌实验中,通过SYTO9/PI死活染色法可观察到,虽然光照组和材料组可见一定程度的红色荧光,但实验组红色荧光信号显著增加,表明大部分红色毛癣菌被杀灭。结论:1.红色毛癣菌为浅部真菌病主要致病菌。同一患者不同部位感染,多数是同一菌种感染,考虑自体接触传染可能性大。2.联合ITS1和ITS2区段对丝状真菌进行分子鉴定,基本可鉴定到种。同时通过PCR指纹图谱分析可观察到,同一菌种的条带基本相同,可帮助进行批量鉴定。3.N-Carbon nanozyme联合NIR对白念珠菌及红色毛癣菌均有明显的抑制作用。