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美人蕉黄斑驳病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

花匠小妙招
2024-11-23 11:46

美人蕉黄斑驳病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于美人蕉黄斑驳病毒的检测。该试剂盒包括：正向引物、反向引物、荧光探针、TaqMan?PCR?Master?Mix、阳性对照、阴性对照和ddH2O。本发明根据美人蕉黄斑驳病毒基因序列设计一对特异性引物和一条特异性荧光探针，利用荧光定量PCR技术检测美人蕉黄斑驳病毒，不仅具有特异性强、灵敏度高、检测时间快、结果判定简单的优点，而且无需PCR后处理步骤，能有效避免交叉污染和假阳性，适合于进出境口岸检疫、引种及农业生产上美人蕉黄斑驳病毒的快速检测与诊断。
【专利说明】美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫【技术领域】，适用于进出境ロ岸检疫、引种及农业生产上美人蕉黄斑驳病毒的快速检测与诊断。
【背景技术】
[0002]美人蕉(Canna glauca)是美人蕉科美人蕉属植物，原产于美洲、非洲等地，在我国大部分地区均有分布。近年来，随着国内外美人蕉品种交流的増加和种植面积的不断扩大，病毒病逐渐成为美人蕉生产上的主要病害之一，危害美人蕉的正常生长，降低其经济价值。美人蕉黄斑驳病毒(Canna yellow mottle virus, CaYMV)属于花椰菜花叶病毒科(CaulimoViridae)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)成员，基因组为环状双链DNA,病毒粒体呈杆状，大小约120-130nmX28nm，该病毒侵染美人蕉后引起的典型症状包括叶脉黄化、叶片产生褪绿斑、茎杆和花上出现条斑等。CaYMV最早发现于日本美人蕉上，主要分布在日本和美国，近年来意大利、荷兰等国家也有发生。CaYMV目前已报道的自然寄主仅为美人蕉。CaYMV的防治极为困难，ー些国家被迫采取销毁病株的手段来防止其进ー步扩散。CaYMV可随美人蕉种苗的运输而进行远距离传播，随着我国花卉业的迅速发展，从国外引进的美人蕉品种日益增多，因此CaYMV传入的风险逐渐増大。为有效防止该病毒的发生、传播和蔓延，保护美人蕉生产安全，促进美人蕉出ロ创汇，加强CaYMV检测技术研究，建立快速、准确、灵敏的检测方法具有十分重要的意义。由于CaYMV尚无商品化的血清学检测试剂，因此该病毒的检测主要采用普通PCR方法，即以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，然后根据有无扩增出特异性的目的片段来进行判断。基于PCR的荧光定量PCR方法具有快速、准确、灵敏、污染少的优点，迄今已应用于多种病毒的快速检测。但到目前为止，尚未见专门用于CaYMV检测的TaqMan荧光定量PCR检测方法，更未见专门用于该病毒检测的荧光定量PCR试剂盒。

【发明内容】

[0003]本发明的目的在于提供一种用于美人蕉黄斑驳病毒检测的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，能有效克服现有技术中存在的缺陷，快速、准确地检测美人蕉黄斑驳病毒，具有特异性强、灵敏度高和准确性好的优点。
[0004]本发明技术方案如下:
[0005](一)一种用于美人蕉黄斑驳病毒检测的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0006]I)正向引物:10 ii mo I/L，引物序列为 5’ -TGCGAACCTGCCTGAAATG-3 ’ ；
[0007]2)反向引物:10 ii mo I/L，引物序列为 5’ -ATACATCCGTCTGITTCAAGTACCAT-3 ’ ；
[0008]3)荧光探针:10 ii mol/L，荧光探针序列为 5’ -FAM-AATTACCCCCCAGGGACGCCG-TAMRA-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA ；[0009]4) TaqMan PCR Master Mix:2X ；
[0010]5)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品；
[0011]6)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品；
[0012]7) ddH20。
[0013](二)上述美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0014]I)荧光定量PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA3UL，按每管加浓度为IOii mol/L正向引物0.75ii L、浓度为10 y mol/L反向引物0.75y L、浓度为IOy mol/L荧光探针 0.L、2XTaqMan PCR Master Mix 12.5 U L^ddH2O 7.5 ii L，使反应总体积为 25 ii L ;混合后的反应液，95°C预变性30s，然后95°C 5s, 60 °C 30s，如此共40个循环，反应结束；
[0015]2)结果判定:反应结束后根据扩增曲线判定结果，若待测样品产生典型的扩增曲线，且Ct值小于35，则判定检测到美人蕉黄斑驳病毒，反之，则判定未检测到美人蕉黄斑驳病毒。
[0016]本发明根据美人蕉黄斑驳病毒基因序列设计ー对特异性引物和一条特异性荧光探针，建立一种用于美人蕉黄斑驳病毒快速检测的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。较之已有技术而言，本发明所提供的美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于:1)特异性强:一对特异性引物和一条特异性荧光探针在PCR过程中可以对靶目标进行双重控制，出现非特异性扩增的可能性小；2)灵敏度高:荧光定量PCR综合了荧光标记、PCR、激光及数码显像等多种技术，使其灵敏度显著高于普通PCR;3)检测时间快:整个PCR检测过程在2-3小时内即可完成，且一次可以同时检测多个样品，特别适合于大批量样品的快速检测；4)PCR结果判定简单:整个PCR扩增过程可以通过电脑软件进行实时监测，能够随时掌握PCR扩增情況；PCR扩增结果在电脑上直接显示，无需电泳、染色及紫外观察等步骤，避免了使用有毒试剂和肉眼判断结果的主观性。
【专利附图】

【附图说明】
[0017]图1为实施例2的美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测結果。其中1:阳性对照；
2:携帯有美人蕉黄斑驳病毒的样品；3:阴性对照；4:空白対照。
[0018]图2为实施例3的特异性測定結果。其中1:美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV) ；2:菜豆黄花叶病毒(BYMV)样品；3:黄瓜花叶病毒(CMV)样品；4:番茄不孕病毒(TAV)样品；5:阴性对照。
[0019]图3为实施例4的灵敏度测定結果。其中I:DNA 10-1稀释；2:10_2稀释；3:10_3稀释；4:10_4 稀释；5:10_5 稀释；6:10_6 稀释；7:10_7 稀释；8:10_8 稀释；9:10_9 稀释；10:10_1Q稀释；11:阴性对照；12:空白対照。
【具体实施方式】
[0020]以下通过具体实施例对本发明作进ー步说明。
[0021]实施例1:美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
[0022]I)正向引物:10iimol/L，l 管(IOiiL)；
[0023]2)反向引物:10iimol/L，l 管(IOiiL)；[0024]3)荧光探针:10iimol/L，l 管(IOiiL);
[0025]4) TaqMan PCR Master Mix:2 X，I 管(125 ii L);
[0026]5)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品，I管(50 y L);
[0027]6)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品，I管(50y L);
[0028]7) ddH20，I 管(lmL)。
[0029]实施例2:美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法
[0030]上述美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤:
[0031]I)荧光定量PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA 3yL，按每管加浓度为IOii mol/L正向引物0.75ii L、浓度为10 y mol/L反向引物0.75y L、浓度为IOy mol/L荧光探针 0.L、2XTaqMan PCR Master Mix 12.5 U L^ddH2O 7.5 ii L，使反应总体积为 25 ii L ;混合后的反应液，95°C预变性30s，然后95°C 5s, 60 °C 30s，如此共40个循环，反应结束；
[0032]2)结果判定:反应结束后根据扩增曲线判定结果，若待测样品产生典型的扩增曲线，且Ct值小于35，则判定检测到美人蕉黄斑驳病毒(图1 )，反之，则判定未检测到美人蕉黄斑驳病毒。
[0033]实施例3:美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的特异性測定
[0034]I) DNA提取:分别以携帯有美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV)、菜豆黄花叶病毒(Beanyellow mosaic virus, BYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、番爺不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)的样品为材料,各取50_100mg用液氮充分研磨后，转置
1.5mL离心管，加入500 u L TES，50-100 y g蛋白酶K，56°C温育0.5_lh，期间轻轻摇动混匀；加入一定体积10mol/L NaCl (使之终浓度为1.4mol/L), 1/10倍体积10%CTAB，65°C温育IOmin ;加入I倍体积氯仿/异戍醇 (24:1),轻摇混匀，置冰上30min,4°C下12 000r/min离心 IOmin ;取上清，加入 225 ii L NH4AC (5mol/L)，混匀，放置冰上 lh，4°C下 12 000r/min离心 IOmin ;取上清，カロ 3 u L Rnase,37°C温育 15min,4°C下 12 000r/min 离心 IOmin ;取上清,加0.5倍体积异丙醇,置冰上15-30min,4°C下12 000r/min离心IOmin ;弃上清,沉淀用70%こ醇(预冷)洗涤2次，干燥后溶解于50 ii LTE中，_20°C冷冻保存备用；
[0035]2)荧光定量PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA 3yL，按每管加浓度为IOii mol/L正向引物0.75ii L、浓度为10 y mol/L反向引物0.75y L、浓度为IOy mol/L荧光探针 0.L、2XTaqMan PCR Master Mix 12.5 U L^ddH2O 7.5 ii L，使反应总体积为 25 ii L ;混合后的反应液，95°C预变性30s，然后95°C 5s, 60 °C 30s，如此共40个循环，反应结束；
[0036]3)结果判定:反应结束后根据扩增曲线判定结果(图2)，仅美人蕉黄斑驳病毒样品产生典型的扩增曲线，其他病毒样品和健康样品均无，表明本发明试剂盒具有很强的特异性。
[0037]实施例4:美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度測定
[0038]将美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV)样品的DNA按10倍梯度稀释后，分别作为模板，按实施例2方法进行检测，结果见图3。从图3可知，本发明具有很高的灵敏度，可以检测稀释到I (T5倍的CaYMV样品DNA。
[0039]实施例5:进境美人蕉上美人蕉黄斑驳病毒的检测
[0040]以我国ロ岸进境的美人蕉为材料(56份)，提取DNA后按实施例2方法进行检測，试验同时采用巢式PCR方法进行验证。从表1可见，从进境美人蕉样品中检出美人蕉黄斑驳病毒(CaYMV) 7份，检出率为12.5%，该结果与巢式PCR检测结果完全相符。
[0041]表1进境美人蕉样品的检测结果
【权利要求】
1.ー种美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:1)正向引物:10iimol/L，引物序列为 5，-TGCGAACCTGCCTGAAATG-3’;2)反向引物:10 u mol/L,引物序列为5’ -ATACATCCGTCTGTTTCAAGTACCAT-3’ ;3)荧光探针:10 u mol/L,荧光探针序列为5’-FAM-AATTACCCCCCAGGGACGCCG-TAMRA-3’，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA ;4) TaqMan PCR Master Mix:2X ;5)美人蕉黄斑驳病毒的阳性对照样品；6)不含美人蕉黄斑驳病毒的阴性对照样品；7) ddH20。
2.利用权利要求1所述的美人蕉黄斑驳病毒荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)荧光定量PCR反应:在PCR管中加入待测样品DNA3iiL，按每管加浓度为IOiimol/L正向引物0.75 ii L、浓度为10 u mol/L反向引物0.75 y L、浓度为10 u mol/L荧光探针`0.5u L、2 X TaqMan PCR Master Mix 12.5 ii L、ddH20 7.5 U L,使反应总体积为 25 U L ;混合后的反应液，95°C预变性30s，然后95°C 5s, 60 °C 30s，如此共40个循环，反应结束； 2)结果判定:反应结束后根据扩增曲线判定结果，若待测样品产生典型的扩增曲线，且Ct值小于35，则判定检测到美人蕉黄斑驳病毒，反之，则判定未检测到美人蕉黄斑驳病毒。
【文档编号】C12R1/94GK103571970SQ201310432638
【公开日】2014年2月12日申请日期:2013年9月22日优先权日:2013年9月22日
【发明者】沈建国, 李敏, 张总泽, 蔡伟, 廖富荣申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心